人工合成的根特異啟動子及其應用的製作方法

2023-05-05 04:20:01

人工合成的根特異啟動子及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及「人工合成的根特異啟動子及其應用」，屬於生物【技術領域】。人工合成的根特異性啟動子，命名為SRS1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，利用重疊PCR方法添加35S啟動子部分區域及Omega序列，合成的序列為SRSO1，以pCAMB2300.1為基礎載體(含有GUSplus報告基因)，分別用人工合成的啟動子替換pCAMBIA2300.1上的CaMV35S啟動子，得到表達載體p2300.1-SRSO1，轉化農桿菌後，轉入菸草中驗證，表明啟動子SRS1具有根特異性表達特性。該人工合成的啟動子SRS1，豐富了根特異表達啟動子的種類，可用於植物抗蟲基因的根部表達，防治地下害蟲。
【專利說明】人工合成的根特異啟動子及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及根部特異表達啟動子，其克隆、功能驗證其應用。
【背景技術】
[0002]組織特異性啟動子，可以避免蛋白合成的浪費，使基因只在某些特定的器官或組織中表達。目前相繼發現的組織特異性啟動子主要有根部特異、果實特異、維管組織特異、花粉管特異、韌皮部特異、種子特異和塊莖特異等組織特異啟動子，是研究基因功能及表達特性的重要工具，尤其在植物基因工程育種中發揮重要作用。
[0003]根是植物體的重要器官，除了吸收土壤中的水分及養分、貯存合成有機物質，還和土壤中的微生物有密切的互作關係。植物根系容易受地下害蟲的啃食，繼而感染根腐病、莖腐病等細菌真菌病害的機率增加，造成作物部分產區的減產絕收。植物抗病蟲基因工程的研究已經在我國陸續的展開，根部特異表達啟動子的獲得，對於保證抗病蟲外源基因在作物根中特異、穩定、高效表達及增加轉基因生物安全性具有重要意義。目前已克隆到的植物根特異性啟動子主要在擬南芥、水稻、菸草、大豆、玉米、松樹、胡蘿蔔、番茄中，這些啟動子驅動的基因多與根 系分泌、次生代謝有關。
[0004]在植物基因工程應用中，由於所使用的天然啟動子與植物內源基因啟動子存在潛在的同源性，因此可能會造成外源基因的沉默(Thierry D, Vaucheret H.Sequencehomology requirements for transcriptional silencing of35S transgenes andpost-transcriptional silencing of nitrite reductase(trans)genes by thetobacco2711ocus.Plant Molecular Biology, 1996, 32 (6): 1075-1083.)。而人工合成啟動子不存在這一問題，可極大程度上避免由於啟動子同源性造成的基因沉默。另外，與天然啟動子相比，人工啟動子可根據不同目的合成各種組織特異或廣泛誘導型啟動子，從而在基因表達時間和空間上進行更為精確的調控(彭舒，黃真池，歐陽樂軍等.植物基因工程中人工啟動子的研究進展.植物生理學報，2011，47 (2):141-146.)。

【發明內容】

[0005]針對上述領域中的需求，本發明合成了兩條啟動子序列SRSl和SRS2，通過實驗驗證，人工合成的啟動子序列SRSl具有根特異表達的特性，而SRS2並不具有該特性。該人工合成的根特異啟動子SRSl可用於植物地下害蟲防治。
[0006]人工合成的根特異性啟動子，命名為SRS1，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
[0007]合成的啟動子，命名為SRS01，其核苷酸序列如SEQ ID N03所示。
[0008]一種表達載體，其含有上述根特異性啟動子SRSl。
[0009]上述表達載體在轉基因植物中的應用。
[0010]上述人工合成的根特異性啟動子在轉基因植物中的應用。
[0011]所述應用為將含有該根特異性啟動子和抗蟲基因的表達載體轉入植物中，使其在植物根部表達該抗蟲基因，以防治地下害蟲。
[0012]本發明根據表達元件合成了兩個啟動子序列SRS1、SRS2(SEQ ID NOU SEQ IDN02)，利用重疊PCR方法添加35S啟動子部分區域及Omega序列，合成的序列為SRSOl和SRS02 (SEQ ID N03、SEQ ID N04)，以 pCAMB2300.1 為基礎載體(含有⑶Splus 報告基因)，分別用人工合成的啟動子替換PCAMBIA2300.1上的CaMV35S啟動子，得到兩個表達載體P2300.l-SRS01/p2300.1-SRS02，轉化農桿菌後，轉入菸草中驗證，表明啟動子SRSl具有根特異性表達特性，而啟動子SRS2沒有根特異表達的特性。
[0013]該人工合成的啟動子SRS1，豐富了根特異表達啟動子的種類，可用於植物抗蟲基因的根部表達，防治地下害蟲。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1利用重疊PCR合成人工啟動子SRSOl，
[0015]其中A:SRS1、35S mini及Ω序列的PCR擴增；B:利用重疊PCR合成人工啟動子SRSOl ；M:DL500marker ；N:陰性對照(ddH20) ；1:SRS1 片段的 PCR 擴增結果；2:35S_minipromoter PCR擴增結果；3: Ω序列PCR擴增結果；4:利用重疊PCR合成人工啟動子SRSOl，
[0016]圖2p2300-SRS01/p2300.1-SRS02 酶切鑑定，
[0017]其中M:DL15000marker ；1:人工啟動子SRSOl 的PCR擴增；2:p2300.1-SRSOI/BamHI+Hind III ；3:p2300.l_SRS02/BamH I+Hind III，
[0018]圖 3ρ2300.l_SRS01/p2300.1-SRS02 轉化農桿菌 LBA4404 的 PCR 鑑定
[0019]其中M:DL500marker ；N:陽性對照(ddH20) ；P:陽性對照(plasmid DNA) ;1、2:P2300.1-SRS01轉化農桿菌的PCR檢測結果；3、4:p2300.1-SRS02轉化農桿菌的PCR檢測結果，
[0020]圖4 轉 p2300.1-SRS01、ρ2300.1-SRS02 菸草的⑶S 染色結果，
[0021]其中A:菸草葉片(轉化p2300.1-SRS01載體)；Β:根部(轉化p2300.1-SRS01載體)；C:菸草葉片(轉化p2300.1-SRS02載體)；D:根部(轉化p2300.1-SRS02載體)。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0023]下面所涉及的實驗材料均為己公開的或市售的材料。
[0024]1、實驗步驟和方法
[0025]1.1人工啟動子SRSl和SRS2的構建
[0026]人工合成兩條啟動子序列SRS1，SRS2，序列交由金維智生物科技(蘇州)有限公司進行化學合成。
[0027]SEQ ID NOl =SRSl:
[0028] aagcttGATTATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGATTTACTCTTGTAAATAAAAGAGAACGTGACTGTGTA GCACTGTGTACATAACTGTGTACATTTGAAACTGTGTAAAGTTTTATCTTTAGTTTTTAATCTTTACTTTTAATCTTTTA ATAAAGATTAGAGCCTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTTGATAATTAATTCATATTTTAAAAATATTAAATAAATT AATTTTTAATATTTACCAGAAATGATAATTAATTCATATTTTTTTATCAAGCATGCTTCTTGC[0029]SEQ ID N02:SRS2:
[0030]aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTTCAAAGAGAATCATCCAAACTCTTCAATTTCAAAGAGATTCCTACTGTGTAAGAC TGTGTATCTAACTGTGTAGAAAGCAAACTGTGTATTGTAATATCTTTGGAATACAATCTTTCAATACGATCTTTATTTAA AGATAAGTTACTTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACTCCATTATAACAACATATTTATTAAATATTATTTACATTAATA ATTAATATTCAAACATTACGATAATTAATTCATATTTAATTATCAAGCATGCTTCTTGC
[0031]利用重疊PCR方法添加35S啟動子部分區域及Omega序列，合成的序列為SRSOl和SRS02，(見SEQ ID N03、SEQ ID N04)所用到的引物如下，小寫部分為所加酶切位點:
[0032]proSRSFHl:5』-aagcttGATTATTTACTCTTGTAAAT_3』
[0033]proSRSFH2:5』-aagcttCCATTAGATCTCTTCAATTT_3』
[0034]proSRSRcd:5』-GAAGGATAGTGGGATTGCAAGAAGCATGCTT-3』
[0035]35SminiFcd:5』-AAGCATGCTTCTTGCAATCCCACTATCCTTC-3』
[0036]35SminiRcd:5』-AATTGTTGTAAAAATTCCTCTCCAAATGAAATG-3』
[0037]OmegaFcd:5』-CATTTCATTTGGAGAGGAATTTTTACAACAATT-3』
[0038]OmegaRB:5』-ggatccTGTAATTGTAAATAGTAATTG_3』
[0039]35S啟動子部分區域及Omega序列擴增所用引物對分別為35sminiFcd/35sminiRcd 和 OmegaFcd/OmegaRB, PCR 反應體系和反應條件如下:
[0040]
【權利要求】
1.人工合成的根特異性啟動子，命名為SRS1，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.合成的啟動子，命名為SRS01，其核苷酸序列如SEQID N03所示。
3.—種表達載體,其含有權利要求1或2所述的啟動子。
4.權利要求3所述表述載體在轉基因植物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，所述表述載體中含有抗蟲基因，將該載體轉入植物，使其在植物根部表達該抗蟲基因，以防治地下害蟲。
6.權利要求1或2所述的啟動子在轉基因植物中的應用。
7.權利要求6所述應用，為將含有權利要求1或2所述的啟動子和抗蟲基因的表達載體轉入植物中，使 其在植物根部表達該抗蟲基因，以防治地下害蟲。
【文檔編號】A01H5/00GK103966220SQ201410228207
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】張 傑, 耿麗麗, 遲婧, 束長龍, 宋福平, 彭琦, 梁影屏 申請人:中國農業科學院植物保護研究所