一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法
2023-05-04 15:29:31 2
專利名稱：：一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法
技術領域：
：本發明涉及一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，特別涉及一種應用蛋白質譜技術建立活動性肺結核病的血清診斷模型的方法，屬於蛋白質譜應用
技術領域：
。
背景技術：
：我國的結核病疫情相當嚴重，結核病人數位居世界第二，僅次於印度。早期診斷、發現病人、選擇敏感的抗結核藥物進行有效治療是控制結核病的關鍵。目前臨床上常規應用的診斷方法中，臨床標本塗片檢測的靈敏度低，陽性率只有20-30%;傳統的羅氏培養陽性率低，只有30%左右，而且需4-8周時間；傳統的藥敏試驗和菌種鑑定煩瑣、費時，需1一2月時間；血清結核抗體檢測的靈敏度和特異性不理想；PPD含有許多分枝桿菌共同的抗原，診斷的特異性差，使得全國451萬活動性肺結核患者中，通過痰塗片檢査發現塗陽肺結核患者150萬，菌陽肺結核患者200萬，菌陰肺結核患者251萬。由此可見，在診斷的肺結核患者中33.3%為塗陽肺結核患者，通過細菌培養使菌陽肺結核患者增加到44.4%，菌陰肺結核患者佔活動性肺結核患者的55.6%，肺結核患者檢出率低，漏診率高，導致結核菌繼續傳播和病人治療延誤。因此，迫切需要發現新的結核病診斷標誌物，建立快速、敏感、高效的結核病診斷、鑑別診斷新方法。隨著質譜儀的發展和蛋白質組學研究的深入，產生了蛋白質指紋圖譜的診斷新技術，該技術是通過質譜分析不同疾病血清中循環蛋白的差異，以特異性差異蛋白作為診斷標誌物來診斷疾病。由於不同的疾病在血清中有許多潛在的生物標誌物，通過質譜定量和定性分析這些生物標誌物可用於疾病的診斷。該方法已成功地用於研究SARS、癌症等診斷標誌物。因此，提供一種診斷模型簡便、快速，標本用量少，可直接檢測血清標本，靈敏度高，特異性好的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法就成為該
技術領域：
急需要解決的技術難題。
發明內容本發明的目的是提供一種診斷模型簡便、快速，標本用量少，可直接檢測血清標本，靈敏度高，特異性好的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法。本發明的上述目的是通過以下技術方案達到的一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其步驟如下1.血清來源和製備包括實驗組和對照組；採集受檢者靜脈血，分離血清後分裝，放置在-8(TC冰箱保存，備用；2.血清的質譜分析(1)樣品處理取3ul血清與6ulU9緩衝液混勻，冰浴震蕩30min;樣品變性後，加入360ulCM10結合緩衝液；(2)蛋白晶片檢測用200ulCM10結合緩衝液洗滌CM10蛋白晶片後，加入100ul步驟(1)處理後的樣品，室溫孵育l小時；棄液體，用CM10結合緩衝液洗滌2次；風乾後，取出蛋白晶片，每個點加0.5yl飽和的芥子酸溶液；風乾後，再重複一次；(3)質譜分析採用質譜儀進行蛋白質譜分析，參數設置如下雷射強度220，最高分子量IOOOkDa，檢測靈敏度9，焦點分子量IOkDa;(4)數據採集應用Ciphergen蛋白晶片3.1.1軟體採集信噪比為10的血清蛋白峰；3.統計學分析和差異蛋白的篩選用CiphergenProteinChipBiomarkerWizard軟體對步驟2中之(4)所獲得的數據進行統計學分析，設置P〈0.01，篩選出50個差異蛋白；4.診斷模型的建立應用BiomarkerPattern5.0軟體建立診斷活動性肺結核的模型。一種優選技術方案，其特徵在於所述步驟2中所述步驟(1)中的U9緩衝液的組成為9M尿素、2%3-環乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、50mMTris-HCL、1%二硫蘇糖醇(DTT)，pH9.0;所述CM10結合緩衝液為50mMNaAC，pH4.0。一種優選技術方案，其特徵在於所述步驟2中所述步驟(2)中的所述芥子酸溶液為芥子酸溶於50%乙腈和0.5%三氟乙酸。一種優選技術方案，其特徵在於所述步驟2中所述步驟(3)中的所述蛋白分子量的優化範圍1000—30000Da。一種優選技術方案，其特徵在於所述步驟3中所述50個差異蛋白峰具體如下。tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9一種優選技術方案，其特徵在於所述步驟4中所述建立診斷活動性肺結核的模型的具體步驟如下對照組中包括非結核呼吸疾病患者和健康人，包括PPD陽性者和PPD陰性者，通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇5個蛋白峰4360、3311、8160、5723、15173m/z建立活動性肺結核診斷預測模型1;並計算出活動性肺結核診斷預測模型1中各個差異蛋白高、低表達的臨界值4360m/z為2.381、3311m/z為0.975、8160m/z為3.558、5723m/z為2.163、15173m/z為1.725。一種優選技術方案，其特徵在於所述步驟4中所述建立診斷活動性肺結核的模型的具體步驟如下-對照組中只包括非結核呼吸疾病患者，不包括健康人，通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇3個蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活動性肺結核診斷預測模型2;並計算出活動性肺結核診斷預測模型2中各個差異蛋白高、低表達的臨界值5643m/z為5.162、4486m/z為0.943、4360m/z為2.039。本發明的有益效果本發明的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法簡便、快速，標本用量少，可直接檢測血清標本，鑑別活動性肺結核和對照組的靈敏度為96.9%，特異性為97.8%，陽性預測值和陰性預測值分別為97.7%和97.1%，總準確率為97.3%，是篩選結核病特異性標誌物的有效手段。下面通過附圖和具體實施方式對本發明做進一步說明，但並不意味著對本發明保護範圍的限制。圖1中的a-l是本發明實施例1中對照組中編碼為59的m/z5643蛋白峰，a-2是活動性肺結核組中編碼為P985的m/Z5643蛋白峰；b-1是健康組中編碼為59的m/z4360蛋白峰，b-2是活動性肺結核組中編碼為P985的m/z4360蛋白峰;c-1是健康組中編碼為59的ra/z4486蛋白峰，c-2是活動性肺結核組中編碼為P985的m/z4486蛋白峰。圖2為本發明實施例中診斷預測模型1的分類樹。圖3為本發明實施例中診斷預測模型2的分類樹。具體實施例方式實施例1一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其步驟如下1.血清來源和製備129例活動性肺結核血清來源於2007年2—5月解放軍總醫院第二附屬醫院全軍結核病研究所確診的住院患者，平均年齡41.31±20.63歲，其中男性85例，女性44例，結核桿菌塗片或培養陽性58例、陰性71例；69例非結核呼吸疾病血清來源於2007年2—5月解放軍總醫院第二附屬醫院呼吸科、腫瘤科確診的住院患者(包括肺癌18例，肺炎23例，慢性支氣管炎、肺氣腫15例，哮喘4例，上呼吸道感染4例，其它5例)，平均年齡59.33士19.15歲，其中男性42例，女性27例；66例健康人血清來源於2007年入伍新兵體檢血清，平均年齡18.91±1.14歲，均為男性，其中PPD皮膚試驗陰性者30例，PPD皮膚試驗陽性者36例。採集受檢者靜脈血2ml，分離血清後分裝，放置於-8(TC冰箱保存，備用，避免反覆凍融。2.血清的質譜分析應用陽離子交換蛋白晶片CMIO(Ciphergen，Fremont,CA,USA)對血清標本進行分析。(1)樣品處理取3ul血清與6ulU9緩衝液[9M尿素、2%3-環乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、50mMTris-HCL、1%二硫蘇糖醇(DTT)，pH9.0]混勻，冰浴震蕩30min;樣品變性後，加入360ulCM10結合緩衝液(50mMNaAC，pH4.0)。(2)蛋白晶片檢測用200ulCM10結合緩衝液洗滌CM10蛋白晶片後，加入100pl處理好的樣品，室溫孵育l小時；棄液體，用CM10結合緩衝液洗滌2次。風乾後，取出蛋白晶片，每個點加0.5ul飽和的芥子酸溶液(芥子酸溶於50%乙腈和0.5%三氟乙酸)；風乾後，再重複一次。(3)質譜分析採用PBS-IIc型質譜儀(Ciphergen,Fremont,CA,USA)進行蛋白質譜分析，參數設置如下雷射強度220，最高分子量IOOOkDa，檢測靈敏度9，焦點分子量IOkDa，蛋白分子量的優化範圍1000—30000Da。(4)數據採集應用Ciphergen蛋白晶片3.1.1軟體採集信噪比為10的血清蛋白峰。3.統計學分析和差異蛋白的篩選用CiphergenProteinChipBiomarkerWizard軟體對步驟(4)所獲得的數據進行初步的統計學分析(計算均值、SD和P值)，發現了50個差異蛋白(代O.Ol)。具體如下表1活動性肺結核組和對照組之間有顯著差異的50個蛋白峰(P〈0.01)tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage134.診斷模型的建立應用BiomarkerPattern5.0軟體建立診斷活動性肺結核的模型。任何一個單一的蛋白峰都無法完全鑑別活動性肺結核和對照組。本發明人採用下列2種方式建立診斷模型-第一種方式是對照組中包括非結核呼吸疾病患者和健康人(包括PPD陽性者和PPD陰性者)，通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇了5個蛋白峰4360、3311、8160、5723、15173m/z建立活動性肺結核診斷預測模型1，其分類樹分布詳見附圖2。並計算出診斷預測模型l中各個差異蛋白高、低表達的臨界值4360m/z為2.381、3311m/z為0.975、8160m/z為3.558、5723m/z為2.163、15173m/z為1.725。活動性結核病的檢測該模型鑑別264例活動性肺結核和對照組(包括非結核呼吸疾病患者和健康人)的靈敏度為83.0%，特異性為89.6%，陽性預測值和陰性預測值分別為88.4%和84.6%，總準確率為86.4%。22例肺結核血清和14例對照組血清被錯誤診斷。結果見下表2。表2應用診斷模型1診斷活動性肺結核的結果tableseeoriginaldocumentpage14第二種方式是以對照組中只包括非結核呼吸疾病患者，不包括健康人，通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇了3個蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活動性肺結核診斷預測模型2，其分類樹分布詳見附圖3。代表性樣本的m/z5643和4360蛋白峰見圖1(其中圖1中的a-1是健康組中編碼為59的m/z5643蛋白峰，a-2是活動性肺結核組中編碼為P985的m/z5643蛋白峰；b-l是健康組中編碼為59的m/z4360蛋白峰，b-2是活動性肺結核組中編碼為P985的m/z4360蛋白峰；c-1是健康組中編碼為59的m/z4486蛋白峰，c-2是活動性肺結核組中編碼為P985的m/z4486蛋白峰)。其中，P985為原某某，女，83歲，粟粒型肺結核。59為張某某，男，19歲，PPD陰性健康人。並計算出診斷預測模型l中各個差異蛋白高、低表達的臨界值5643m/z為5.162、4486m/z為0.943、4360m/z為2.039。活動性結核病的檢測該模型鑑別264例活動性肺結核和對照組(包括非結核呼吸疾病患者和健康人)的靈敏度為96.9%，特異性為97.8%，陽性預測值和陰性預測值分別為97.7%和97.1%，總準確率為97.3%。只有4例肺結核血清和3例對照組血清(包括上呼吸道感染者1例，PPD皮膚試驗陽性和陰性健康人各1例)被錯誤診斷，結果見下表3。其中質荷比峰為5643m/z的蛋白峰在62.8%(81/129)的活動性肺結核患者血清中表達顯著增高，在71.9%(97/135)的非結核呼吸疾病患者和健康人血清中表達顯著降低。表3應用診斷模型2診斷活動性肺結核的結果imageseeoriginaldocumentpage15本發明活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，從264例血清標本中共獲得IOO個蛋白峰，50個蛋白峰在活動性肺結核組和對照組之間有顯著差異(表l，P〈O.OD，其中34個峰在活動性肺結核組表達顯著增高，16個峰在活動性肺結核組表達顯著減少。通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇了3個蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活動性肺結核診斷預測模型2，其分類樹分布詳見附圖3。該模型只需3個生物標誌物，鑑別活動性肺結核和對照組的靈敏度為96.9%，特異性為97.8%，陽性預測值和陰性預測值分別為97.7%和97.1%，總準確率為97.3%。只有4例肺結核血清和3例對照組血清(包括l例上呼吸道感染者，1例PPD皮膚試驗陽性(++)、抗結核抗體陽性的健康人，1例PPD皮膚試驗陰性、抗結核抗體陰性的健康人)被錯誤診斷(表3)。潛伏感染者並不影響診斷模型的結果。其中質荷比峰為5643m/z的蛋白峰在62.8y。(81/129)的活動性肺結核患者血清中表達顯著增高，在71.9%(97/135)的非結核呼吸疾病患者和健康人血清中表達顯著降低，有可能是結核病特異性標誌物，我們將進一步鑑定其分子量及胺基酸組成，以便了解該蛋白的性質。該診斷模型簡便、快速，標本用量少，可直接檢測血清標本，鑑別活動性肺結核和對照組的靈敏度為96.9%，特異性為97.8%，陽性預測值和陰性預測值分別為97.7%和97.1%，總準確率為97.3%，是篩選結核病特異性標誌物的有效手段。權利要求1、一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其步驟如下(1)血清來源和製備包括實驗組和對照組；採集受檢者靜脈血，分離血清後分裝，置-80℃冰箱保存，備用；(2)血清的質譜分析(a)樣品處理取3μl血清與6μlU9緩衝液混勻，冰浴震蕩30min；樣品變性後，加入360μlCM10結合緩衝液；(b)蛋白晶片檢測用200μlCM10結合緩衝液洗滌CM10蛋白晶片後，加入100μl步驟(a)處理後的樣品，室溫孵育1小時；棄液體，用CM10結合緩衝液洗滌2次；風乾後，取出蛋白晶片，每個點加0.5μl飽和的芥子酸溶液；風乾後，再重複一次；(c)質譜分析採用質譜儀進行蛋白質譜分析，參數設置如下雷射強度220，最高分子量1000kDa，檢測靈敏度9，焦點分子量10kDa；(d)數據採集應用Ciphergen蛋白晶片3.1.1軟體採集信噪比為10的血清蛋白峰；(3)統計學分析和差異蛋白的篩選用CiphergenProteinChipBiomarkerWizard軟體對步驟(2)之步驟(d)所獲得的數據進行統計學分析，設置P<0.01，篩選出50個差異蛋白；(4)診斷模型的建立應用BiomarkerPattern5.0軟體建立診斷活動性肺結核的模型。2、根據權利要求1所述的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中所述步驟(a)中的U9緩衝液的組成為9M尿素、2%3-環乙胺-1-丙磺酸(CHAPS)、50mMTris-HCL、1%二硫蘇糖醇(DTT)，pH9.0;所述CM10結合緩衝液為50mMNaAC，pH4.0。3、根據權利要求2所述的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中所述步驟(b)中的所述芥子酸溶液為芥子酸溶於50%乙腈和O.5%三氟乙酸。4、根據權利要求3所述的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(2)中所述步驟(c)中的所述蛋白分子量的優化範圍IOOO—30000Da。5、根據權利要求4所述的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(3)中所述50個差異蛋白峰具體如下。tableseeoriginaldocumentpage3tableseeoriginaldocumentpage46、根據權利要求5所述的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其特徵在於所述步驟(4)中所述診斷模型的建立步驟如下對照組中包括非結核呼吸疾病患者和健康人，包括PPD陽性者和PPD陰性者，通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇5個蛋白峰4360、3311、8160、5723、15173m/z建立活動性肺結核診斷預測模型1;並計算出診斷預測模型1中各個差異蛋白高、低表達的臨界值4360m/z為2.381、3311m/z為0.975、8160m/z為3.558、5723m/z為2.163、15173m/z為1.725。7、根據權利要求5所述的活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其特徵在於所述(4)中所述診斷模型的建立步驟如下對照組中只包括非結核呼吸疾病患者，不包括健康人，通過BiomarkerPattern5.0軟體選擇3個蛋白峰5643、4486、4360m/z建立活動性肺結核診斷預測模型2;並計算出診斷預測模型2中各個差異蛋白高、低表達的臨界值5643m/z為5.162、4486m/z為0.943、4360m/z為2.039。全文摘要本發明涉及一種活動性肺結核病的血清診斷模型的建立方法，其步驟如下(1)血清來源和製備包括實驗組和對照組；採集受檢者靜脈血，分離血清後分裝，置-80℃冰箱保存，備用；(2)血清的質譜分析，包括樣品處理；蛋白晶片檢測；質譜分析；數據採集；(3)統計學分析和差異蛋白的篩選；(4)診斷模型的建立應用BiomarkerPattern5.0軟體建立診斷活動性肺結核的模型。該模型鑑別活動性肺結核和對照組的靈敏度為96.9％，特異性為97.8％，陽性預測值和陰性預測值分別為97.7％和97.1％，總準確率為97.3％。文檔編號G01N27/64GK101424661SQ20081018402公開日2009年5月6日申請日期2008年12月9日優先權日2008年7月23日發明者何菊芳,劉又寧,華衛,吳雪瓊,張俊仙,張翠英,賓易,李仲興,豔梁,梁建琴,紅武,梅董,陽幼榮,陳紅兵,馬瑞娟申請人:中國人民解放軍總醫院第二附屬醫院;北京德易生物醫學技術有限公司