薺菜冷調節蛋白基因啟動子及其在植物抗寒性改良中的應用的製作方法

2023-05-04 20:45:06 2

專利名稱：薺菜冷調節蛋白基因啟動子及其在植物抗寒性改良中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學、植物基因工程技術領域，具體涉及植物逆境誘導啟動子的克隆及其應用。
背景技術：
低溫寒害是農林業生產中一種嚴重的自然災害，世界每年因此造成的損失十分巨大，據統計達2000億美元。自然環境下溫度是決定植物地域分布的主要限制因子，在栽培條件下更影響著農作物及園藝植物等的產量和品質。溫度作為重要的環境因子之一， 限制植物的分布及生長和產量，對植物生長發育起著決定性作用(Viswanathan C, Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002，357 (1423) :877-886)。隨著轉基因技術的日益成熟，人們已從植物中分離了大批抗寒相關基因(藺忠龍等.植物抗凍基因最新研究進展， 北方園藝，2009(1):119- 123)用於抗寒植物的培育。但利用抗寒相關基因進行轉基因抗寒植物培育時均發現在獲得優良低溫抗性植株的同時，普遍出現不同程度的生長延滯 (retardation)現象。主要是利用抗寒相關基因進行的轉基因植物都是在組成性啟動子 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S驅動下產生的。這種基因的組成性表達對植物的生長造成了一定的影響。為了克服轉基因植物出現的生長延滯現象，人們開始利用冷誘導啟動子代替組成性啟動子。冷誘導基因RD^A (來源於擬南芥C0R78基因)啟動子驅動的轉基因植株的研究表明，轉基因植株的生長延滯比CaMV35S啟動子驅動的轉基因植株所表現出來要輕微得多(Kasuga M, et al. A combination of the Arabidopsis DREBlA gene and stress—inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Phsiol, 2004, 45:346-350)。利用特異性的誘導型啟動子避免外源基因在宿主植物中非特異性的持續、高效表達已經得到廣泛共識，但是真正能應用於生產實際的特異性啟動子不多，而冷誘導型特異啟動子更少。 目前特異啟動子的克隆及其結構功能的研究是轉基因植物研究中的一個熱點，也是一個生發點。這一領域的研究成果將極大推動轉基因植物基礎研究的進展，加速轉基因植物的產業化。薺菜Wapsella bursa-pastoris )是一種1或2年野生的草本植物，平鋪地面，喜陰，在南方是處處可見的一種可食用的蔬菜，屬於十字花科、薺菜屬Capsella Medik，在低溫條件下能夠正常生長發育並結實。早期的研究表明，擬南芥中的冷調節蛋白(cold-regulated，C0R)基因是一種誘發基因，只有在特定的條件下(如零上低溫)， COR基因才被啟動進而促進細胞產生抗冷力。過表達CORlfe基因的擬南芥比野生型 Wiitt Wifi^ftiiiWiSIrHi^ (Artus NN, et al. Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaiiana C0R15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. PNAS, 1996，93:13404-13409)。擬南芥中 COR 基因有兩個拷貝，分別稱為JiOMVfe和JiOMVl^，這兩個基因串聯排列在擬南芥第二條染色體上。研究表明^(0^75 對低溫和外源施加的ABA有強烈響應，而對乾旱不響應(Kathy S. et al. Arabidopsis thaiiana cor 15b, an apparent homologue of cor 15a, is strongly responsive to cold and ABA, but not drought. Plant Mol Biol, 1993, 23: 1073-1077)。本發明所涉及的薺菜冷調節蛋白基因的啟動子與擬南芥中的AtCORMb同源， 屬於CORMb型，命名CbCORMb，是從薺菜葉片的DNA中克隆到的。目前尚未發現00^75 啟動子序列和利用CbC0R15b啟動子培育耐寒植物的相關報導。

發明內容
本發明的目的是克隆、鑑定一個受低溫強烈誘導表達的植物內源啟動子，並利用該啟動子構建抗寒相關基因表達載體，通過遺傳轉化方法達到提高植物的抗寒性，最終獲得抗(耐)寒能力明顯增強的優良植物品種。本發明通過以下技術方案實現
首先是分離受低溫強烈誘導表達的啟動子，所提供的受低溫強烈誘導表達的啟動子來源於薺菜。該啟動子控制的薺菜內源基因為編碼受低溫誘導表達的、能促進細胞產生抗冷性的基因，屬於冷調節蛋白基因，該冷調節蛋白屬CORKb型，故基因被命名為00^75 ，啟動子被命名為 <^bC0R15bP (CbCORl5b Promoter)。CbC0R15bP 是具有序列表 SEQ ID NO: 1 中的鹼基第1-1123位的序列。CbC0R15bP控制的CbCORMb基因是具有序列表SEQ ID NO: 1中鹼基第1124-1960位的編碼序列或含有與其編碼的蛋白質同源性至少在80%以上具有相同功能的序列。本發明所提供的冷調節蛋白基因的啟動子(CbCORMbP)(以下將這一啟動子統稱為CbCORMbP)區域含有一個ABRE順式作用元件，能特異地對低溫和ABA起應答反應， 一個 CRT/DRE (C-repeat dehydration-responsive element)順式作用元件，能夠特異性的和一種受低溫誘導的調控冷誘導基因的反式轉錄激活因子CBF (C-repeat binding transcription factor)結合，一yIv TGA-element (auxin-responsive element),可以禾口生長素反應因子(ARF)相結合，一個 TCA-element (salicylic acid responsiveness), 一個 GARE-motif (gibberellin-responsive element), 以及兩個 CGTCA-motif (MeJA-responsiveness)，能夠分別被水楊酸、赤黴素和甲基茉莉酸所誘導。本發明還利用CbC0R15bP構建的誘導性表達載體可以在植物受到低溫脅迫時強烈地誘導報告基因GUS在葉和根中表達。利用本發明所提供的CbC0R15bP構建的植物表達載體轉化模式植物菸草，檢測轉基因菸草的抗寒的生理指標，顯示植株耐寒性有了顯著提高。本發明詳細技術方案如下
一種分離出的薺菜DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，其中薺菜 CbCORl5b啟動子及其基因包含序列表SEQ ID NO: 1所示序列中的1-1123和1124-1960位的核苷酸序列，1124-1960位鹼基的核苷酸序列編碼一個受低溫誘導的、能促進細胞產生抗冷性的冷調節基因。所述的一種分離的DNA分子，其啟動子區(SEQ ID NO: 1序列中1_1123位)包含有包含一個ABRE順式作用元件CACGTG，一個CRT/DRE元件TGGCCGAC，一個TGA順式作用元件AACGAC，一個TCA順式作用元件GAGAGGAATA，一個GARE順式作用元件TGTGTTG，兩個 MeJA順式作用元件TGACG和CGTCA。所述的CbC0R15bP全部或部分序列構建的植物表達載體。所述的CbC0R15bP全部或部分序列構建的植物表達載體，通過遺傳轉化培育抗寒植物的方法。所述的CbC0R15bP全部或部分序列構建的植物表達載體，通過遺傳轉化培育抗寒植物材料。所述的抗寒植物材料是指植株、種子或無性細胞系。按照以上的技術方案，很顯然，申請人或申請人以外的其他人可以利用本發明所提供的CbC0R15bP構建抗寒相關基因的表達載體轉化植物以提高植物的抗寒性。受體植物主要包括水稻、小麥、玉米等在內的禾穀類作物，當然也包括其他一些重要的經濟作物，例如棉花、油菜或番茄等。序列表SEQ ID NO :1，公開了本發明克隆的包含啟動子序列的薺菜冷調節基因 CbCORl5b全長基因序列。序列表SEQ ID NO :2_3，公開了本發明用於克隆薺菜CbCORMb啟動子的引物序列。


圖1顯示的是CbC0R15bp的全長基因序列。其中，起始密碼子ATG和轉錄起始位點用方框表示；ATG前為啟動子序列，ATG後為編碼序列，編碼序列中的小寫字母為內含子； ABRE元件、CRT/DRE順式作用元件、TGA作用元件，TCA作用元件，GARE作用元件和MeJA作用元件均用下劃線表示。圖2顯示的是冷馴化和冷誘導下薺菜CbCORMb和CbCORlfe基因在根莖葉中的表達特性。圖3顯示的是用轉基因菸草苗的PCR檢測電泳圖。圖4顯示的是⑶S基因的表達和組織化學染色圖。其中，(a)為⑶S基因的表達量檢測圖；(b)為GUS基因的組織化學染色圖。
具體實施例方式下面結合實驗室具體的試驗數據和結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 CbC0R15bP的分離和鑑定。1.薺菜幼苗的培養
薺菜種子來源於上海白玉蘭蔬菜種子有限公司，薺菜種子經過消毒處理後，播種於含有皿&培養基的培養罐內，置於25°C下培養4周，其中光照周期為1 光照，8h黑暗。2.啟動子序列的克隆
採用Genome walking技術擴增薺菜CbCORMb基因的啟動子序列。實驗操作按照 Universal Genomeffalker Kit (CL0NTECH)的使用手冊進行。薺菜的 Genome walking庫建好後，根據CORMb基因的cDNA序列的開放閱讀框(ORF)設計2條引物=CbCORMbFl 5' -GATCAGTCTGTTGTAATGA-3『(記為 SEQ ID NO. 2)禾口 CbCORl5bF2 5' - ACCATCG CCATGAGAGATATG-3，(記為SEQ ID NO. 3)，與試劑盒中的2個接頭引物配合，進行兩輪PCR 反應，同時電泳檢測兩輪PCR擴增產物。挑選第二輪中的特異條帶進行克隆、測序。測序顯示克隆到的CbCORMbP全長序列1123bp記為SEQ ID NO. 1。薺菜CbCORMb 基因編碼框的第一個起始密碼子在(1124bp)處，第一個起始密碼子ATG前的1123個鹼基為CbCORMb的啟動子序列，命名為CbCORMbP。實施例2 00^75 冷誘導和冷馴化處理下的表達特性。1.薺菜的種植和處理
取適量新鮮薺菜種子，無菌處理後置於預先配置好的MS培養基(MS粉4. 41g/L，蔗糖 30g/L，瓊脂粉8. 5g/L)無菌培養罐中，26°C光照培養。冷馴化處理選取種子萌發後4周的幼苗，按溫度梯度 26°C (4d), 12°C (4d), 4°C (4d), 0°C (2h), _4°C Oh)處理薺菜幼苗，冷誘導處理選取種子萌發後4周的幼苗，在4°C條件下，按時間0h，lh, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h梯度處理薺菜幼苗，分別取葉片、莖段和根提取總RNA。2. RNA 抽提
RNA提取按照Plant RNA Mini Kit操作程序進行。3. RT-PCR 擴增
使用 One Step RNA PCR Kit (AMV)進行。各管使用 Total RNA 模板為 1 μ g, RT-PCR 操作按試劑盒操作程序進行。50°C 30min,94°C ^iin反轉錄後，樣品經30次循環(94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s)，內參經 18 次循環(94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s)，得到 PCR 產物。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結果。冷馴化結果表明，薺菜根、莖、葉中CbC0R15b的表達在不同的低溫處理下均有一定變化，同時在低溫(0-4°C)處理下具有組織特異性。CbCORl5b 時在根、莖和葉中幾乎沒有表達，但隨著溫度降低，表達水平逐漸提高，12°C _4°C時在根、莖、葉中表達水平幾乎沒有提高，0°C時，在葉中和莖中表達水平提高明顯，在根中表達提高不明顯，到-4°C時， 莖中表達水平增加較為明顯(附圖2A)。從附圖2A中還可以看出CbC0R15b的表達模式與 CbCORl5a不同，CbCORl5b在莖中受低溫調控更明顯。冷誘導結果表明，薺菜根、莖、葉中CbC0R15b的表達在_4°C低溫處理下有不同程度的冷應答，同時也具有組織特異性。在_4°C放置前根、莖、葉中的CbC0R15b均沒有表達， 在移入-4°C Ih時葉中00^75 有微量表達，3hjh時表達提高明顯，24h時表達水平有所下降；在移入_4°C lh,3h, 6h根中的CbCORl5b均沒有表達，到24h表達水平才有一定的提高；在移入_4°C Ih時莖中的岱0%7瀝沒有表達，3hjh和24h時表達逐漸增加(附圖2B)。 從附圖2B中還可以看出CbCORl5b的表達模式與CbCORl5a不同，CbCORl5b在莖中受低溫調控表達水平增加得更明顯。實施例3薺菜C0R15bP啟動子低溫誘導活性分析。在該實施例中，將克隆到的CbCORl5bP序列加上酶切位點Bgl II和/ I，連至 PCAMBA1301 載體上(由澳大利亞 CAMBIA [the Center of the Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia]惠贈),構建一個驅動 GUS 基因的植物表達載體。轉化菸草實驗表明，CbC0R15bP在低溫誘導下能增強GUS基因的表達。因此，CbCORl 5bP在作物抗寒基因工程育種中具有較好的應用前景。表汰載體的構津。在本實施方案中，構建表達載體pCAMBA1301-C0R15bP-GUS
切除商品化的植物表達載體PCAMBA1301自帶的CaMV35S啟動子，連入薺菜CORMbP，調控⑶S基因的表達。用商品化的植物表達載體pCAMBA1301，作為薺菜C0R15bP在雙子葉植物菸草中表達實驗的對照。農桿菌介導法對菸草的轉化。1.農桿菌的培養挑取單菌落，在2ml農桿菌液體培養基中，28° C培養過夜；取 ImL以上培養物，加入50mL農桿菌液體培養基中，28°C培養至OD6tltl=O. 6-1. 0 ；8000rpm離心 IOmin,收集菌體，用重懸，使OD6tltl=L 0。2.共培養取菸草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0.8X 0. 8cm 左右的葉盤，放在MS1培養基上，防止葉盤脫水；將葉盤放入農桿菌培養液中，190rpmJ8°C 搖床上浸染IOmin ；用藥勺撈出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸乾葉盤上的多餘菌液；將吸乾的葉盤平放在加蓋一層濾紙的MS1培養基上，25°C左右，於暗處共培養約2d。3.誘導叢生芽共培養後，按以下步驟將葉盤表面的農桿菌洗掉，其間不時搖動，使葉盤充分接觸下列溶液無菌水，15min ；無菌水+羧苄青黴素(500mg/L)，15min ；MS0 +羧苄青黴素(500mg/L)，20min。用藥勺撈出葉盤，放在吸水紙上，吸乾多餘水分；將葉盤放在培養基上，葉盤邊緣輕壓入培養基中；25°C左右，16h光照培養。4.誘導生根在賂2培養基上誘導約4周後，將葉緣長出的幼芽從基部與葉盤切開，將幼芽插入培養基中誘導生根，25°C左右，16h光照培養。5.誘導生根後約3-4周，挑選生長茁壯根系發達的植株，首先將培養基罐子打開適應外界環境5-7天，然後將幼苗溫柔取出，在水中輕柔洗淨培養基殘餘(不要傷害根系)後栽入普通土質中培養(腐殖質土 +珍珠巖+沸石)。標好編號待檢測。25° C左右，1 光照培養。轉基因菸草微量DNA提取及PCR檢測篩選。1. 取少量轉基因植株葉片，剪碎，置研缽中，加入ImL提取緩衝液(100 mmol/L Tris · Cl pH 8. 0,20mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 1. 5% SDS)，研磨成菜。2.吸入1. 5mL EP管中，劇烈搖動混勻。3. 60°C水浴保溫30_60min，不時顛倒混勻。4.室溫下 IOOOOrpm 離心 5min。5.小心吸取上清於新的離心管中，加入等體積氯仿，劇烈震動。6.室溫下 IOOOOrpm 離心 5min。7.小心將上清吸入新的離心管中。8.加入1倍體積異丙醇，室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉澱。SOOOrpm離心 5min,棄掉上清；75%酒精洗1次，晾乾沉澱。9.加入 5μ L RNaseA (10μ g/μ L)，37°C lOmin，除去 RNA。10.力Π 50-100 μ L 水融解，_20°C貯存。11. 以提取出的DNA為模板，用表達載體自帶HYG基因引物、CbC0R15bP特異性引物和GUS基因的引物分別進行PCR擴增，鑑定目的基因在轉基因菸草基因組中的整合狀況，結果顯示119個株系中有35個株系在三種引物擴增下均能PCR出特異的條帶，說明這 35個株系是轉基因陽性植株(見附圖3)。轉基因菸草RNA提取及RT-PCR檢測。常溫下以及4° C冷處理菸草轉基因陽性植株30號株系苗，取葉片和根，提取總的 RNAjSDNase I 消化基因組DNA，以菸草中 GAPDH基因(GenBank Accession No. :AJ133422) 為內參，對轉基因菸草苗30號株系在4°C處理後G依的表達量進行RT-PCR檢測，結果顯示在4°C處理下，菸草葉片和根中⑶S基因的表達量明顯高於^TC條件下的⑶S基因的表達量(附圖如所示)。低溫逆境處理和⑶S組織化學染餼。常溫下以及4°C冷處理菸草30號株系苗，取葉片和根，用⑶S反應液(0.0577 mol/ L NaH2P04，0. 0423 mol/L Na2HPO4, pH 7. 0,3g/L EDTA pH 7. 0, lg/L 鐵氰化鉀，0.75g/L X-gluc ；0. 1% NP40)浸泡上述各處理菸草幼葉和根，抽真空(200 Mbar，15min)，37°C溫育過夜，用75%乙醇脫色脫水，蒸餾水清洗，然後觀察拍照。⑶S基因的表達產物可將反應液中的X-Gluc水解成藍色物質，使組織呈現藍色， 藍色的深淺及斑點數量，能在一定程度上反應GUS基因的表達水平。在正常培養條件下 pCAMBA1301-C0R15bP-GUS載體轉化的陽性菸草幼葉和根中沒有顯示藍色斑點，但在冷誘導條件下，pCAMBA1301-C0R15bP-GUS載體轉化的陽性菸草幼葉和根顯現藍色。由此說明， CbC0R15bP在菸草細胞中可受低溫誘導啟動結構基因的表達(見附圖4b)。
權利要求
1.一種分離的具有低溫誘導表達特性的薺菜冷調節蛋白基因的啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中鹼基第1-1123位的序列所示。
2.如權利要求1所述的薺菜冷調節蛋白基因的啟動子，其特徵在於啟動子區包含一個 ABRE順式作用元件CACGTG，一個CRT/DRE元件TGGCCGAC，一個TGA順式作用元件AACGAC， 一個TCA順式作用元件GAGAGGAATA，一個GARE順式作用元件TGTGTTG，兩個MeJA順式作用元件TGACG禾口 CGTCA。
3.由權利要求1所述的薺菜冷調節蛋白基因的啟動子構建的植物表達載體。
4.如權利要求1所述的薺菜冷調節蛋白基因的啟動子在植物的抗寒性改良中的應用。
5.如權利要求4所述的薺菜冷調節蛋白基因的啟動子在植物的抗寒性改良中的應用， 其特徵在於所述植物為水稻、小麥、玉米、棉花、油菜或番茄。
全文摘要
本發明屬於植物基因工程技術領域，具體涉及一種薺菜冷調節蛋白基因的啟動子及其在植物的抗寒性改良中的應用。該啟動子的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其中薺菜冷調節蛋白基因及其啟動子包含序列表SEQIDNO:1所示序列中的1960位鹼基的核酸序列，該核苷酸序列編碼一個受低溫誘導表達的、能促進細胞產生抗冷力的基因。在-4℃誘導條件下，該啟動子除了在葉中表達量上調外，還在莖中表達量上調。利用該基因啟動子片段構建的誘導性表達載體可以在植物受到低溫脅迫時啟動目標基因的表達。本發明還提供上述啟動子在培育抗寒植物中的應用，以改良農作物品種的抗寒性能。
文檔編號C12N15/113GK102329796SQ20111030943
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月13日 優先權日2011年10月13日
發明者吳麗華, 周明琦, 林娟, 沈忱 申請人:復旦大學