肥大細胞抑制劑在製備抗流感病毒感染藥物中的應用的製作方法

2023-04-24 00:36:21 1

肥大細胞抑制劑在製備抗流感病毒感染藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了肥大細胞抑制劑在製備抗流感病毒感染藥物中的應用。本發明首次證明肥大細胞在流感病毒感染中起到關鍵作用，利用肥大細胞抑制劑可顯著地提高現有抗流感病毒藥物的療效，從而提供了一種治療流感的藥物組合物。
【專利說明】肥大細胞抑制劑在製備抗流感病毒感染藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及肥大細胞抑制劑在抑制流感病毒複製和增強宿主抗病毒力的藥物中的應用，以及含肥大細胞抑制劑的藥物組合物及其用途。
【背景技術】
[0002]流感病毒H5N1的快速傳播和高致病性給全世界範圍內家禽和人類的健康造成了巨大的威脅。人類患高致病性流感H5N1死亡率超過50%，患病動物和人類出現發燒、食欲不振、腦炎、肺炎、急性呼吸窘迫症候群的併發症。患者過度的炎症反應造成的瀰漫性肺泡損傷和出血是這種疾病高死亡率的主要原因。在H5N1感染早期，炎性細胞發揮著重要的作用，據報導，在H5N1感染小鼠中，肺部出現大量炎性細胞浸潤現象。中性粒細胞可能是病毒複製和傳播的工具。巨噬細胞分泌TNF- α和其他細胞因子，使人體感染Η5Ν1後損傷更加嚴重。最近研究發現，Η5Ν1假病毒顆粒會影響NK細胞的活化。研究還證實Η5Ν1感染小鼠和人體體內TNF-a、 IL-6和CC趨化因子受體2等炎性細胞因子的過度分泌，人們普遍推測「細胞因子風暴」是導致出現病理變化並最終引起死亡的主要原因。但是，抑制細胞因子(TNF-α、IL-6 和 CC 趨化因子受體 2、TNF_a 受體 1、TNF-a 受體 2、MIP_la 和 IL-1R)反應並不能保護動物免受致死性流感病毒H5N1的感染。因此，H5N1感染引起的炎性損傷機制仍存爭議。很可能是人們忽略了其他一些致炎因素，諸如肥大細胞及其介質。
[0003]肥大細胞廣泛分布於機體各種組織中，通過分泌大量炎性分子包括強效蛋白酶、細胞因子、趨化因子和花生四烯酸代謝產物，在免疫和炎症反應中發揮著重要的作用。近來，肥大細胞在腫瘤、寄生蟲、細菌和病毒感染中的作用受到了廣泛的關注。特別是已經證實肥大細胞在一些病毒如HIV-1、登革熱病毒、巨細胞病毒、牛呼吸道症候群病毒的感染中發揮重要作用，但其在流感病毒感染中的作用仍不明了。因此，探討肥大細胞在流感病毒感染中所發揮的作用，以及對肥大細胞的功能進行抑制後對治療流感病毒感染的潛在治療作用具有重要的臨床意義和社會效益。
[0004]當前，防治流感的最有效手段之一是使用滅活流感病毒疫苗來降低流感的發病率。但由於所製備疫苗具有病毒株特異性，每年的疫苗均需使用當年可能流行的病毒株進行製備。另外，疫苗所誘導的免疫反應為IgG型，一般只能保持6個月左右(Castle，ClinicallnfectiousDiseases, 31:578-585，2000)。用於治療流感病毒感染的另一種手段是使用抗病毒製劑。這些製劑包括:金剛燒胺(Amamtadine)、金剛乙胺(Rimatadine)、瑞樂沙(Relenza)和達菲(Tamiflu)。臨床結果證明，儘管使用這些製劑對部分患者有一定的療效，但其很容易誘導產生病毒抗性株和具有很強的副作用，特別對中樞神經系統的影響很大(Wenzel, Journal ofAmerican Medical Association, 283:1057-1059，2000)。
[0005]由此可見，人類面臨的巨大挑戰是尋找一種療效高、副作用小或無副作用、不易誘導產生變異病毒株的新型抗流感病毒製劑和方法。

【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一類有效預防和治療流感病毒感染及其症狀的方法和藥物組合。
[0007]本發明通過研究肥大細胞在流感病毒感染初期發揮的作用和引起的病理損傷中，發現肥大細胞主動參與流感病毒感染引起的初次免疫反應，通過釋放組胺、類胰蛋白酶、IFN-Y，直接引起細胞凋亡或產生細胞因子及其介質，加重感染組織的病理損傷。利用肥大細胞抑制劑，從而提供了一種藥物治療流感的方法和組合物
[0008]本發明發現應用肥大細胞抑制劑抑制肥大細胞功能，可以有效抑制流感病毒感染。肥大細胞抑制劑通過影響肺上皮細胞的凋亡過程減輕或消除流感病毒感染造成的組織損傷，從而可顯著地提高現有抗流感病毒藥物的療效。
[0009]本發明所述的肥大細胞抑制劑包括，但不限於:肥大細胞脫顆粒抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑、抗組胺類抑制劑。
[0010]本發明的肥大細胞脫顆粒抑制劑包括兩類，即以色甘酸二鈉為代表的酸性脫顆粒抑制劑和以酮替芬為代表的鹼性脫顆粒抑制劑。
[0011]本發明的類胰蛋白酶抑制劑，依據其作用機制可分為兩類:針對酶活性中心的類胰蛋白酶抑制劑和拮抗肝素作用的類胰蛋白酶抑制。其中，針對酶活性中心的類胰蛋白酶抑制劑例如:N-(1-羥基-2-萘醯)-L-精氨醯基-L-脯氨醯胺、分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(secretoryleukocyte protease inhibitor, SLPI)、β -類膜蛋白酶的有效抑制劑 TdPI(tick-derived proteaseinhibitor)和一些非肽類小分子化合物；拮抗肝素作用的類胰蛋白酶抑制劑例如乳鐵蛋白等。
[0012]本發明的抗組胺抑制劑主要針對速發變態反應過程中由肥大細胞釋放出的一種組胺介質，可引起毛細血管擴張及通透性增加、平滑肌痙攣、分泌活動增強等。組胺必須首先與細胞上的組胺受體或酶原物質結合才能發揮作用。組胺受體有Hl和H2兩類。一般說的抗組胺藥是指Hl受體拮抗劑，可拮抗組胺對毛細血管、平滑肌、呼吸道分泌腺、唾腺、淚腺的作用。H2受體拮抗劑主要抑制胃液分泌。常用的Hl受體拮抗劑包括但不限於:馬來酸氯苯那敏、羥嗪、桂利嗪、非那根、賽庚啶、阿司咪唑、特非那丁、西替利嗪、氯雷他定、阿化斯丁、苯海拉明、曲吡那敏、酮替芬、特非那定、美喹他嗪、鹽酸左卡巴斯汀。常用的H2受體拮抗劑包括但不限於:甲氰咪呱、雷尼替丁 (西米替丁)等。
[0013]本發明應用肥大細胞抑制劑與抗流感病毒藥物的組合成藥物組合物，可完全保護流感病毒感染造成的死亡。藥物聯合使用效果明顯好於單獨使用，這是由於不同藥物可以作用於病毒複製過程的不同階段或病毒致病的不同方面。在實施例中，通過聯合使用脫顆粒抑制劑酮替芬(10mg/kg)和抗病毒藥物達菲(10mg/kg),可以100%保護感染流感小鼠。
[0014]本發明的抗流感病毒藥物包括，但不限於:金剛烷胺(Amamtadine)、金剛乙胺(Rimatadine)、瑞樂沙(Relenza)和達菲(Tamiflu)等。
[0015]本發明的抗流感病毒藥物組合物可以利用小鼠感染模型進行實驗驗證。實驗指標包括:動物存活率、組織病理改變、血清LDH水平檢測、肺上皮細胞凋亡、肥大細胞激活狀態，包括肥大細胞脫顆粒水平、類胰蛋白酶水平、相關細胞因子釋放(IL-6、TNF-a、IFN-Y、IL-1 - β 和 IL-12 等)。
[0016]本發明首次證明肥大細胞在Η5Ν1流感病毒感染中起到關鍵作用，利用肥大細胞抑制劑可顯著地提高現有抗流感病毒藥物的療效，從而提供了一種藥物治療流感的藥物組合物和方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是H5N1流感病毒感染小鼠的病理學特徵示意圖。其中，A顯示感染5天後肺組織的組織病理(HE或NP單克隆抗體染色):a所示為HE染色的正常肺組織；b所示為流感病毒感染5天後HE染色的肺組織，空箭頭指示肺間質水腫和小血管周邊的炎症細胞侵潤，黑箭頭指示在支氣管管腔中脫落的黏膜上皮細胞和炎性細胞；(3所示為無NP陽性的正常肺組織；d所示為流感病毒感染5天後NP單克隆抗體染色的肺組織，箭頭指示NP陽性細胞。B和C分別是感染小鼠在第1、3、5天處死，實時定量PCR測定肺組織中的病毒RNA水平(B)和噬斑形成實驗測定病毒滴度(C)。
[0018]圖2顯示了 H5N1流感病毒感染鼠中肥大細胞的分布。鼻黏膜(nasal mucosa)、氣管(trachea)、肺門淋巴結(hilar lymph node)、肺(lung)組織中的肥大細胞以甲苯胺蘭染色識別，箭頭表明肥大細胞。整個組織切面的肥大細胞數表示在右方的柱狀圖(n=5)。
[0019]圖3顯示了 H5N1流感病毒感染鼠中類胰蛋白酶和TNF- α在鼻黏膜、氣管、肺門淋巴結、肺組織中的表達水平。
[0020]圖4顯示了 Η5Ν1流感病毒感染鼠後1、3、5天組胺在鼻黏膜和肺組織中的水平(*Ρ〈0.05)。
[0021]圖5顯示了小鼠傳代肥大細胞系Ρ815細胞表面唾液酸受體的表達情況。
[0022]圖6顯示了大鼠腹腔原代肥大細胞表面唾液酸受體的表達情況。
[0023]圖7顯示了人肺臟原代肥大細胞表面唾液酸受體的表達情況。
[0024]圖8是流式細胞術檢測小鼠傳代肥大細胞系Ρ815細胞表面唾液酸受體的表達情況，其中從左到右三個圖SNA-FITC (異硫氰酸螢光素)和MAA-FITC的濃度分別為5 μ g/ml、10 μ g/ml和20 μ g/ml，圖中曲線①，②和③分別代表未染色細胞、MAA-FITC和SNA-FITC。
[0025]圖9是用H5N1、H7N2、H1N1三種亞型的A型流感病毒在小鼠傳代肥大細胞P815上進行攻毒試驗，攻毒後取細胞上清液測定的病毒血凝效價結果。
[0026]圖10是用H5N1、H7N2、HlNl三種亞型的A型流感病毒在小鼠傳代肥大細胞P815上進行攻毒試驗，攻毒後進行反轉錄和螢光定量PCR的結果。
[0027]圖11是用H5N1、H7N2、HlNl三種亞型的A型流感病毒在小鼠傳代肥大細胞P815上進行攻毒試驗，攻毒後取細胞上清液進行噬斑分析的結果。
[0028]圖12是用H5N1、H7N2、HlNl三種亞型的A型流感病毒在小鼠傳代肥大細胞P815上進行攻毒試驗後，透射電鏡觀察結果，其中A =HlNl, B:H5N1, C:H7N2。
[0029]圖13是H5N1、H7N2、HlNl三種亞型的A型流感病毒誘導小鼠傳代肥大細胞P815細胞凋亡的FACS檢測結果。
[0030]圖14是H5N1、H7N2、HlNl三種亞型的A型流感病毒誘導小鼠傳代肥大細胞P815細胞凋亡的透鏡觀測結果，其中A、B、C和D分別對應細胞對照、H5N1、H7N2和H1N1。
[0031]圖15顯示了受酮替芬處理和未處理的小鼠肺組織病理和細胞凋亡情況。A:感染5天後接受酮替芬(右)和未接受酮替芬(左)小鼠肺組織病理。B:感染1、3、5天後肺組織細胞凋亡(TUNEL染色)。
[0032]圖16A至圖16E顯示體外H5N1流感病毒激活肥大細胞的情況。其中，圖16A:使用Mast Cell Degranulation Assay Kit檢測肥大細胞P815的脫顆粒水平；圖16B:使用流式細胞儀檢測經P815細胞上清處理的LA795和A549細胞凋亡水平；圖16C:H5N1流感病毒感染誘導的P815細胞IL-6、TNF-a ,IL-1-β、IL_12表達水平；圖16D:H5N1流感病毒感染誘導的P815細胞IFN- Y表達水平；圖16E:經IFN- Y抗體處理的P815肥大細胞上清與LA795細胞作用，引起的細胞凋亡降低。
[0033]圖17顯示酮替芬單獨或與抗病毒藥物達菲合用對H5N1流感病毒感染小鼠的治療作用。A:不同劑量酮替芬處理的存活實驗；B:酮替芬與抗病毒藥物達菲合用的存活實驗；C:小鼠體重變化記錄。
[0034]圖18是H5N1亞型A型流感病毒對小鼠攻毒後3天和8天，取小鼠肺組織提取RNA並進行實時定量PCR檢測的結果。
[0035]圖19是H5N1亞型A型流感病毒對小鼠攻毒後3天和8天，取小鼠肺組織，進行噬斑形成實驗測定病毒滴度的結果。
[0036]圖20是H5N1亞型A型流感病毒對小鼠攻毒後3天和8天，採用實時定量PCR分別檢測PBS、酮替芬組、達菲組、酮替芬+達菲組肺組織中IFN-Y水平的結果。
[0037]圖21是H5N1亞型A型流感病毒對小鼠攻毒後3天和8天分別檢測PBS、酮替芬組、達菲組、酮替芬+達菲組肺泡灌洗液中乳酸脫氫酶(LDH)水平的結果。
[0038]圖22是H5N1亞型A型流感病毒對小鼠攻毒後8天觀察各組肺組織病理學改變情況，a:PBS組，b:酮替芬組，c:達菲組，d:酮替芬+達菲組。空箭頭指示水腫和炎性細胞浸潤，黑箭頭指示支氣管內黏膜損傷及脫落的黏膜上皮細胞和炎性細胞，黑三角指示淤血、出血。
【具體實施方式】
[0039]以下通過實施例進一步詳細描述本發明，但不以任何方式限制本發明的範圍。
[0040]實施例1:肥大細胞在流感病毒感染中的重要作用
[0041]使用H5N1感染的小鼠模型研究肥大細胞作用。這些小鼠在感染流感病毒5天後出現典型的臨床症狀，如精神萎靡、被毛零亂、食欲不振、體態消瘦、呼吸困難。感染小鼠肺部嚴重水腫，呈瀰漫性出血(圖lAd)。H5N1感染小鼠肺部出現間質性水腫、小血管周圍炎性細胞浸潤、細支氣管上皮細胞剝離、肺泡壁增厚與肺泡腔中上皮細胞、紅細胞及炎性細胞引起的混合水腫(圖1Ab)。能夠在肺部脫落的肺泡細胞和黏膜上皮細胞檢測到H5N1病毒抗原(NP)的廣泛存在(圖1Ad)。通過real time RT-PCR方法檢測發現感染後H5N1病毒複製增強(圖1B)。
[0042]在感染模型中，感染後1、3、5天鼻黏膜、氣管、肺門淋巴竇和肺部肥大細胞數量顯著提高(P <0.05)(圖2)。在感染小鼠鼻黏膜、氣管中發現脫顆粒現象。之後，我們檢測活化肥大細胞釋放的介質水平。如圖3所示，相比對照組，在感染後1、3、5天，胰蛋白酶、TNF-α在感染小鼠的鼻黏膜、氣管、肺門淋巴竇和肺部的表達水平顯著升高。如圖4所示，感染後1、3、5天，感染小鼠鼻黏膜中組胺的水平顯著升高，與鼻黏膜中肥大細胞的數目升高趨勢一致。感染小鼠肺部組胺水平在感染後I天達到峰值，在感染後第2天下降，在感染後第5天降到基本水平(圖4)。
[0043]以上結果表明，在流感病毒感染中，肥大細胞的數量和其釋放的介質均顯著升高，證明了肥大細胞在感染中的重要作用。
[0044]實施例2:肥大細胞表面表達流感病毒受體(唾液酸受體SNA&MAA)
[0045]流感病毒HA蛋白與宿主細胞表面的唾液酸受體特異性結合是流感病毒感染宿主的第一步。本實驗通過唾液酸受體免疫螢光染色證明肥大細胞(小鼠傳代肥大細胞P815、大鼠腹腔原代肥大細胞、人肺臟原代肥大細胞)表面存在MAA和SNA受體(圖5至圖7)，同時通過流式細胞術檢測肥大細胞表面MAA和SNA受體螢光強度發現，SNA受體的表達高於MAA受體(圖8)。
[0046]實施例3:流感病毒在肥大細胞內的活躍複製
[0047]選擇H5N1、H7N2、H1N1三種亞型的A型流感病毒，在小鼠傳代肥大細胞P815上進行攻毒試驗。攻毒後分別進行細胞上清中病毒血凝效價的檢測和噬斑分析，用螢光定量PCR技術分析了攻毒後的P815細胞中病毒RNA的複製情況。
[0048]首先，在6孔板中接種P815細胞，待細胞密度約達70%時分別接種2000PFU HlNl(A/WSN/33,簡稱 WSN)、H5N1 (A/chicken/Henan/1/2004,簡稱 H5)、H7N2 (簡稱 H7)三種亞型的A型流感病毒，攻毒後12h、24h和48h取細胞上清液測定病毒血凝效價，初步確定P815對三種亞型流感病毒的易感性，實驗結果見圖9。進一步的，P815細胞常規攻毒，分別於攻毒後不同時間點收取樣品，細胞加TRIZOL提取RNA，反轉錄後進行螢光定量PCR分析病毒含量，結果如圖10所示；同時，細胞上清液進行噬斑分析，實時監測肥大細胞內A型流感病毒的複製情況，結果如圖11所示。上述實驗結果顯示，這三種亞型的A型流感病毒均可以在肥大細胞P815中進行複製。
[0049]同時，我們採用透 射電鏡的方法，直接在感染的P815細胞中觀察到了病毒粒子(圖12)，電鏡結果顯示:攻毒後，P815細胞釋放大量HlNl和H5N1亞型IAV病毒粒子(病毒粒子直徑約80-90納米)，釋放少量Η7亞型IAV病毒粒子(病毒粒子直徑約110-120納米)。這一結果進一步證實了 A型流感病毒可以感染肥大細胞。
[0050]實施例4:Α型流感病毒激活肥大細胞後胞內TLR3和RIG-1的表達
[0051]將Ρ815 細胞分別用 poly1:C, polyl: C+Lip2000 (轉染試劑)，H1N1、H5N1、H7N2 處理，未經處理的細胞作為對照，處理後30min、lh、2h、4h、6h、8h、12h和24h收取樣品，細胞加Trizol提取RNA，螢光定量PCR分析TLR3和RIG-1的表達情況。具體結果如表I和表2所示:
[0052]表1:攻毒後P815細胞中TLR3表達的動態觀察
30min Ih 2h 4h6h 12h 24h
ControliIiiiiI
polyl:C 15 26 203.29 0.4 3943.84 0 54 908.8 9.16
[0053]polyl:C+Lip2000 0.81 167.84 0.79 4654.96 6.99 502.87 17.35
HI NI0.63 5.73 Un 143.24 112.23 4.58 Un
H5N11.68 9.6 0.34 176.75 0.84 0.11 12.65
H7N21.46 2.38 0.06 1538.71 193.75 10.41 2.71
[0054]表2:攻毒後P815細胞中RIG_1表達的動態觀察
[0055]
【權利要求】
1.肥大細胞抑制劑在製備預防和治療流感病毒感染的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述肥大細胞抑制劑是肥大細胞脫顆粒抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑和/或抗組胺類抑制劑。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述肥大細胞脫顆粒抑制劑是酸性脫顆粒抑制劑或鹼性脫顆粒抑制劑；所述類胰蛋白酶抑制劑是針對酶活性中心的類胰蛋白酶抑制劑和/或拮抗肝素作用的類胰蛋白酶抑制；所述抗組胺抑制劑是Hl受體拮抗劑和/或H2受體拮抗劑。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述酸性脫顆粒抑制劑是色甘酸二鈉；所述鹼性脫顆粒抑制劑是酮替芬；所述針對酶活性中心的類胰蛋白酶抑制劑選自下列藥物中的一種或多種:N-(1-羥基-2-萘醯)-L-精氨醯基-L-脯氨醯胺、分泌性白細胞蛋白酶抑制劑和β_類胰蛋白酶抑制劑TdPI ;所述拮抗肝素作用的類胰蛋白酶抑制劑是乳鐵蛋白；所述Hl受體拮抗劑選自下列藥物中的一種或多種:馬來酸氯苯那敏、羥嗪、桂利嗪、非那根、賽庚啶、阿司咪唑、特非那丁、西替利嗪、氯雷他定、阿化斯丁、苯海拉明、曲吡那敏、酮替芬、特非那定、美喹他嗪和鹽酸左卡巴斯汀；所述Η2受體拮抗劑是甲氰咪呱和/或雷尼替丁。
5.預防和治療流感病毒感染的藥物組合物，包括肥大細胞抑制劑與抗流感病毒藥物。
6.如權利要求 5所述的藥物組合物，其特徵在於，所述肥大細胞抑制劑是肥大細胞脫顆粒抑制劑、類胰蛋白酶抑制劑和/或抗組胺類抑制劑。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，所述肥大細胞脫顆粒抑制劑是酸性脫顆粒抑制劑或鹼性脫顆粒抑制劑；所述類胰蛋白酶抑制劑是針對酶活性中心的類胰蛋白酶抑制劑和/或拮抗肝素作用的類胰蛋白酶抑制；所述抗組胺抑制劑是Hl受體拮抗劑和/或Η2受體拮抗劑。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，其特徵在於，所述酸性脫顆粒抑制劑是色甘酸二鈉；所述鹼性脫顆粒抑制劑是酮替芬；所述針對酶活性中心的類胰蛋白酶抑制劑選自下列藥物中的一種或多種:Ν-(1-羥基-2-萘醯)-L-精氨醯基-L-脯氨醯胺、分泌性白細胞蛋白酶抑制劑和β_類胰蛋白酶抑制劑TdPI ;所述拮抗肝素作用的類胰蛋白酶抑制劑是乳鐵蛋白；所述Hl受體拮抗劑選自下列藥物中的一種或多種:馬來酸氯苯那敏、羥嗪、桂利嗪、非那根、賽庚啶、阿司咪唑、特非那丁、西替利嗪、氯雷他定、阿化斯丁、苯海拉明、曲吡那敏、酮替芬、特非那定、美喹他嗪和鹽酸左卡巴斯汀；所述Η2受體拮抗劑是甲氰咪呱和/或雷尼替丁。
9.如權利要求5所述的藥物組合物，其特徵在於，所述抗流感病毒藥物選自下列藥物中的一種或多種:金剛烷胺、金剛乙胺、瑞樂沙和達菲。
10.如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物含有酮替芬和達菲。
【文檔編號】A61K45/00GK103446587SQ201210580079
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年12月27日 優先權日:2011年12月28日
【發明者】汪明, 孫侖泉, 胡豔欣 申請人:汪明, 孫侖泉, 胡豔欣