在浮萍中表達生物活性多肽的製作方法

2023-04-23 21:23:46 3

專利名稱：在浮萍中表達生物活性多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及由遺傳改造的浮萍表達和分泌生物活性多肽的方法和組合物。
背景技術：
浮萍是水萍科單子葉類植物唯一成員。浮萍的四個屬和34種都是小的，自由漂動的，淡水植物，其地理分布橫跨全球(Landolt(1986)浮萍科的生物系統調查水萍科-專論研究GeobatanischenInstitut ETH，Stiftung Rubel，蘇黎世)。儘管浮萍為已知的形態學最減化(reduced)的植物，但是多數的浮萍種類具有較大植物的所有組織和器官，包括根，莖，花，種子和葉。人們已經對浮萍種類進行廣泛地研究，存在大量文獻詳細描述它們的生態學，系統，生活周期，代謝，疾病和害蟲易感性，它們的生殖生物學，基因結構和細胞生物學。(Hillman(1961)Bot.Review 27221；Landolt(1986)浮萍科植物的生物系統調查水萍植物科-專論研究Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，蘇黎世)。
浮萍的生長習性對於微生物的培養方法是非常理想的。植物通過新葉的營養出芽快速增殖，宏觀方式類似於酵母中無性生殖。通過從分生組織細胞營養出芽而進行增殖。分生組織區域很小，位於葉腹側表面。分生組織細胞處於兩個囊(pocket)中，兩個囊分別位於葉中脈(midvein)兩側。小的中脈區域也是根發生及莖生長而將每篇葉子連接到母葉的地方。分生組織囊受到組織瓣保護。葉從囊中交替發芽。不同的的種類倍增時間不同，短至20-24小時(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67271；Chang等人(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.2419；Datko和Mudd(1970)Plant Physiol.6516；Venkataraman等人(1970)Z Pflanzenphysiol.62316)。
浮萍大量的培養導致單位時間生物量高速聚集(Landolt和Kandeler(1987)水萍科-專論研究，第二卷植物化學，生理學，應用，參考數目Veroffentlichungen des GeobotanischenInstitutes ETH，Stiftung Rubel，蘇黎世)，乾重累積為鮮重的6-15％(Tillberg等人(1979)Physiol.Plant.465；Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67271；Stomp，未發表數據)。已報導在不同條件下生長的大量浮萍種類的蛋白含量範圍在乾重的15-45％(Chang等人(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.2419；Chang和Chui(1978)Z Pflanzenphysiol.8991；Porath等人(1979)Aquatic Botany 7272；Appenroth等人，(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177251)。使用這些數值，浮萍中每升培養基蛋白產量的水平和酵母基因表達系統處於相同數量級。
浮萍中的有性生殖受到培養基成分和培養條件的控制，包括光周期和培養密度。一些浮萍種類的花誘導為常規實驗室步驟。植物通常自花授粉，在實驗室中自花授粉可以通過輕輕搖動培養物來完成。通過這種方法發展了Lemna gibba的同系繁殖系。已經鑑定了自發突變體(Slovin和Cohen(1988)Plant Physiol.86，522)，且化學及伽馬射線突變(使用EMS或者NMU)已經用來生產具有特定特徵的突變體。L.gibba的異型雜交非常繁瑣但是能夠通過受控的人工授粉完成。浮萍的基因組大小為0.25-1.63pg DNA/2C染色體數目從20到80條，在浮萍科中(across the Lemnaceae)平均數目為40條。Landolt(1986)浮萍科植物的生物系統調查水萍植物科-專論研究Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，蘇黎世)。估計倍性水平為2-12C.Id。使用次生產物，同工酶和DNA序列調查水萍科植物內部的遺傳多樣性(McClure和Alston(1966)Nature4916311；McClure和Alston(1966)Amer.J.Bot.53849；Vasseur等人(1991)Pl Syst.Evol.177139(1991)；Crawford和Landolt(1993)Syst.Bot.10389)。
用含有目的核苷酸序列的表達盒能夠有效的轉化浮萍植物或者浮萍節結培養物，轉化方法可以是包括土壤桿菌介導的基因轉化，彈道轟擊(ballistic bombardment)，或者電穿孔等大量方法中的任意一種方法。穩定的浮萍轉化株可以通過用帶有目的核苷酸序列和提供選擇試劑抗性的基因轉化浮萍細胞，然後將轉化的細胞在含有選擇試劑的培養基中培養而分離得到。見美國授予Stomp等人的專利6,040,498。
浮萍基因表達系統提供用於大量研究和商業應用的關鍵技術。對於植物分子生物學研究整體，以酵母的實驗室便利性操作的分化的植物體系提供分析分離的基因的發育和生理學作用的非常快速體系。對於商業生產有價值的多肽，浮萍基礎的體系相對於現存的微生物或者細胞培養體系具有很多優點。植物顯示出其翻譯後處理和哺乳動物相似，克服了微生物細胞生產生物活性哺乳動物多肽所具有的一個主要問題，其他方面(Hiatt(1990)Nature334469)顯示植物系統具有裝配多亞基蛋白的能力，這種能力在微生物系統中是缺乏的。浮萍生物量增加到重組蛋白商業生產水平比哺乳動物細胞類似的增加更快且成本效益更高，而且不同於其它建議的植物生產系統，例如大豆和菸草，浮萍可以在全滿的而且完全受控制的生物質生產容器中生長，使得該系統更加容易整合到現存的蛋白生產工業的下部構造中。
這些特徵使得浮萍成為開發作為生產重組蛋白的有效的植物基礎體系的理想選擇。因此，本發明提供增加作為生物活性多肽生產工具的浮萍基因表達系統有效性的方法和組合物。
發明概述本發明涉及使用浮萍作為表達系統的表達和回收生物活性重組多肽的方法和組合物。本發明的一方面提供提高生物活性多肽在浮萍中的表達水平的方法，導致多肽產量增加，並使得該系統能生產有用量的有價值的生物活性多肽。本發明的另外一個方面公開從遺傳改造的浮萍植物或者浮萍節結培養物定向分泌生物活性多肽的方法。表達的多肽的分泌促進其回收並防止可能由機械摩擦或者浮萍組織酶的溶解導致的多肽活性喪失。
在一個實施方案中，本發明包含在浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物中生產生物活性重組多肽的方法，包括步驟(a)在浮萍培養基中培養浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物穩定地被轉化而表達生物活性重組多肽，其中生物活性重組多肽由含有多肽編碼序列和操作性連接的指導多肽分泌入培養基的信號肽編碼序列的核苷酸序列表達得到的；以及(b)從浮萍培養基中收集生物活性多肽。在該方法的一些實施方案中，核苷酸序列具有至少一種特徵選自(a)多肽的編碼序列中使用浮萍優選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列使用浮萍優選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側為植物優選的翻譯起始背景(context)核苷酸序列；以及(d)操作性連接的核苷酸序列含有插在編碼序列上遊的植物內含子。在該方法的一些實施方案中，生物活性重組多肽分泌到浮萍培養基中。
在另一個實施方案中，本發明包含在浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物中分泌生物活性重組多肽的方法，包括步驟(a)在浮萍培養基中培養浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物穩定轉化而表達生物活性重組多肽，其中生物活性重組多肽由含有多肽編碼序列和操作性連接的指導多肽分泌入培養基的信號肽編碼序列的核苷酸序列表達得到的；以及(b)從浮萍培養基收集生物活性多肽。在該方法的一些實施方案中，核苷酸序列具有至少一種特徵選自(a)多肽的編碼序列中使用浮萍優選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列使用浮萍優選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側為植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(d)操作性連接的核苷酸序列含有插在編碼序列上遊的植物內含子。在該方法的一些實施方案中，生物活性重組多肽分泌到浮萍培養基中。
在以上方法的一些實施方案中，信號肽序列選自(a)人體α-2b-幹擾素信號序列；(b)擬南芥(Arabidopsis thaliana)殼多糖質酶信號序列；(c)水稻α-澱粉酶信號序列；(d)改良的水稻α-澱粉酶序列；(e)浮萍信號序列；以及(f)生物活性重組多肽的天然的信號序列。本方法的一個實施方案中，信號肽為水稻α-澱粉酶信號肽，其序列為SEQ ID NO3所列。
以上方法的一些實施方案中，浮萍優選的密碼子為浮萍屬(Lemna-)優選的密碼子。進一步的實施方案，浮萍優選的密碼子為Lemna gibba優選的密碼子或者浮萍(Lemna minor)優選的密碼子。在進一步的實施方案，其中選自多肽編碼序列和信號肽編碼序列的編碼序列中至少一種含有70％-100％的Lemna gibba-優選的密碼子或者Lemna minor-優選的密碼子。
在另一個實施方案中，本發明包含生產生物活性重組多肽的方法，包括步驟(a)培養浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物被穩定轉化而表達生物活性重組多肽，其中編碼生物活性重組多肽的核苷酸序列已經經過改進以提高在浮萍中的表達，以及(b)從所述浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物中收集生物活性多肽。在該方法的一些實施方案中，已經改進核苷酸序列以提高在浮萍中的表達，其有至少一種特徵選自(a)所述生物活性重組多肽的編碼序列使用浮萍優選的密碼子；(b)翻譯起始密碼子兩側為植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(c)操作性連接的核苷酸序列含有插在編碼序列上遊的植物內含子。
該方法的一些實施方案中，浮萍優選的密碼子為浮萍屬優選的密碼子。進一步的實施方案，浮萍優選的密碼子為Lemna gibba優選的密碼子或者Lemna minor優選的密碼子。在進一步的實施方案，編碼序列含有70％-100％的Lemna gibba-優選密碼子或者Lemna minor-優選密碼子。
在以上方法的一些實施方案中，植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列由核苷酸序列「ACC」或者「ACA」組成，其中背景位置緊接著翻譯起始密碼子5′末端。
在以上方法的一些實施方案中，操作性連接的含有所述植物內含子的核苷酸序列為SEQ ID NO1所列的序列。
在以上任何方法的一些實施方案中，浮萍葉培養物或者浮萍節結培養物表達並組裝生物活性多聚蛋白所有亞單位。在進一步的實施方案中多聚蛋白選自膠原蛋白，血色素，P450氧化酶，以及單克隆抗體。
在以上任何方法的一些實施方案中，生物活性重組多肽為哺乳動物多肽。在進一步的實施方案，哺乳動物多肽為治療性多肽。在一些實施方案中，哺乳動物多肽選自胰島素，生長激素，α-幹擾素，β-幹擾素，β-葡糖腦苷脂酶，β-glucoronidase，成視網膜細胞瘤蛋白，p53蛋白，制管張素，leptin，單克隆抗體，細胞因子，受體，人體疫苗，動物疫苗，植物多肽，和血清白蛋白。
在以上任何方法的一些實施方案中，生物活性重組多肽為α-2b-幹擾素。進一步的實施方案，α-2b-幹擾素為人α-2b-幹擾素。進一步的實施方案，人體α-2b-幹擾素胺基酸序列為SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5所列的序列。
在以上任何方法的一些實施方案中，生物活性重組多肽為α-2b-幹擾素生物活性變體，其中所述生物活性變體序列和SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5有80％序列一致性。
在以上任何方法的一些實施方案中，生物活性重組多肽為酶。
在其它實施方案中，本發明包括以上任何方法穩定轉化的浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物。進一步的實施方案中，穩定轉化的浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物選自紫萍(Spirodela)屬，蕪萍屬，Wolfiella屬和浮萍屬。進一步的實施方案中，穩定轉化的浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物選自乳萍，Lemna miniscula，Lemnaaequinoctialis和Lemna gibba。
在其它實施方案中，本發明包括含有編碼胺基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，其中胺基酸序列選自(a)SEQ ID NO4所列的胺基酸序列；(b)SEQ ID NO5所列的胺基酸序列；(c)SEQ INNO4所示胺基酸序列的生物活性變體的胺基酸序列，其中生物活性變體胺基酸序列和SEQ ID NO4所列的序列具有至少80％的序列一致性；以及(d)SEQ IN NO5所示胺基酸序列的生物活性變體的胺基酸序列，其中生物活性變體胺基酸序列和SEQ ID NO5所列的序列具有至少80％的序列一致性；其中核苷酸序列包含浮萍優選的密碼子。進一步的實施方案中，核苷酸序列為SEQ ID NO2所列的核苷酸序列。
在其它的實施方案中，本發明包括含有編碼選自以下信號肽的核苷酸序列的核酸分子(a)SEQ ID NO6所列的水稻α-澱粉酶信號肽胺基酸序列；以及(b)SEQ ID NO7所列的改進的水稻-澱粉酶信號肽胺基酸序列；其中核苷酸序列包含浮萍優選的密碼子。在進一步的實施方案中，核苷酸序列為SEQ ID NO3所列的核苷酸序列。
在其它的實施方案中，本發明包括用於在浮萍中表達和分泌人α-2b-幹擾素的核酸分子，該核酸分子包含SEQ ID NO3給出的編碼信號肽的核苷酸序列以及SEQ ID NO5給出的編碼成熟人α-2b-幹擾素的核苷酸序列，其中編碼信號肽的核苷酸序列和編碼成熟人α-2b-幹擾素的核苷酸序列操作性相連接。在進一步的實施方案中，核酸分子，還包括SEQ ID NO1給出的包含內含子的核苷酸序列，其中該含有內含子的核苷酸序列與所述編碼信號肽的核苷酸序列和所述編碼成熟的人α-2b-幹擾素的核苷酸序列操作性相連。
本發明的這些及其它方面更加詳細的內容在以下給出的發明詳述中公開。
附圖簡述

圖1圖1顯示在轉化的浮萍培養物的培養基和組織中的幹擾素水平(通過固相夾心式(sandwich)免疫測定確定)，如實施例1所述。
圖2圖2顯示在培養基和轉化的浮萍培養物組織中的幹擾素水平(通過固相夾心式免疫測定確定)，如實施例2所述。
發明詳述本發明中，公開提高遺傳改造的浮萍植物和浮萍節結培養物中生物活性多肽的表達和回收的方法。這些方法包括以下步驟(1)培養穩定轉化的浮萍植物或者浮萍節結培養物，它們表達至少一種生物活性多肽，其中編碼多肽的核苷酸序列已經經過改造以使其在浮萍中的表達提高，以及從浮萍培養物中回收生物活性多肽。本發明包含的核苷酸序列的改造包括，但並不限於，對編碼序列採用浮萍優選的密碼子，對翻譯起始密碼子採用植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列，以及在多肽編碼序列的上遊插入包含植物內含子序列的核苷酸序列。
(2)培養穩定轉化的浮萍植物或者浮萍節結培養物，它們表達至少一種含有信號序列的生物活性多肽，該信號序列指導多肽分泌到培養基中，隨後從培養基中回收生物活性多肽。該方法的一個實施方案，改造編碼生物活性多肽的核苷酸序列用以提高其在浮萍中的表達。或者，在另一種實施方案中，改造編碼信號肽的核苷酸序列用以提高浮萍中的表達。在一個實施方案中，改造生物活性多肽及信號肽的核酸編碼序列以提高其在浮萍中的表達。
另一方面，本發明包括根據以上方法生產生物活性多肽的轉化的漂浮植物或者浮萍節結培養物。
另一方面，本方面公開在浮萍中生產生物活性人α-2b-幹擾素的方法的和核酸序列。
定義「多肽」是指單體或者多聚蛋白或者肽。
「生物活性多肽」是指具有一種或者多種生物功能或者一系列在生物學中多肽通常具有的活性的多肽。本領域的技術人員意識到術語「生物活性」包括和天然蛋白相比生物活性有所改變的多肽(例如活性受到抑制或者增加)，只要蛋白在用於工業或者化學處理或者作為治療，疫苗，或者診斷試劑時具有充分的活性就是具有生物活性。可用本領域的任何方法來確定生物活性。例如，幹擾素家族的蛋白成員的生物活性可通過很多方法來確定，包括它們和幹擾素特異性抗體的相互作用，它們增加病毒感染抗性的能力，或者它們調節幹擾素調控基因靶轉錄的能力。
此處使用的「目的核酸序列」是指任何詣在浮萍中表達的多肽的核苷酸編碼序列。例如，可用根據本發明的轉化的浮萍進行表達的治療性(例如獸醫用或者醫用)或者免疫原性(例如用來接種)多肽的核苷酸編碼序列。
術語「表達」或者「生產」是指基因產品的生物合成，包括轉錄，翻譯和該基因產物的組裝。術語「浮萍」是指水萍科成員。該科目前分為4個屬和34個種的浮萍，如下浮萍屬(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，浮萍，L miniscula，L.obscura，稀脈浮萍(L.perpusilla)，L.tenera，品藻(L.trisulca)，L.turionifera，L.valdiviand)；紫萍屬(S.intermedia，S.polyrrhiza，S.punctata)蕪萍屬(Wa.angusta，蕪萍(Wa.arrhiza)，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglectd)和Wolfiella屬(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda，和Wl.neotropica)。如果存在任何水萍科植物其它屬或者種，也屬於本發明方面。可以使用Landolt(1986)所述分類學方案對Lemna各種進行歸類浮萍科生物系統調查水萍科-專論研究GeobatanischenInstitut ETH，Stiftung Rubel，蘇黎世。
此處使用的術語「浮萍節結培養物」是指含有浮萍細胞的培養物，其中至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，或者100％的細胞為分化的細胞。此處使用的「分化的細胞」為具有至少一種表型性狀(例如，顯著的細胞形態或者標記的核酸或者蛋白的表達)的細胞，該表型性狀可以將其同未分化的細胞或者在其它組織類型中發現的細胞區分開來。此處描述的浮萍節結培養物的分化的細胞形成相互連接的細胞的平鋪的光滑表面，相互連接的細胞在它們相鄰的細胞壁處融合，開始組織成葉原基的節結分散於整個組織。節結培養物的組織表面具有通過原生質網(plasmadesmata)相互連接的表皮細胞。
此處使用的″浮萍優選密碼子″是指在浮萍中使用頻率大於17％的密碼子。
此處使用的″浮萍屬優選密碼子″是指在浮萍屬中使用頻率大於17％的密碼子。
此處使用的″Lemna gibba優選密碼子″是指在Lemna gibba中使用頻率大於17％的密碼子。此處Lemna gibba中的密碼子使用頻率來自密碼子使用資料庫(GenBank Release 113，0；網址為http∥www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi？species＝Lemna+gibba+[gbpln])。
「翻譯起始密碼子″是指啟動從目的核苷酸序列轉錄得到的mRNA的翻譯的密碼子。
此處使用的″翻譯起始背景核苷酸序列″是指緊接翻譯起始密碼子5′的三個核苷酸的特性。
此處使用的″分泌″是指多肽橫跨宿主細胞的質膜和細胞壁的遷移。
此處使用的″操作性連接的″是指核苷酸序列彼此放置的位置處於功能關係。通常，操作性連接的DNA序列為相鄰的，且其位置必需以符合閱讀框連接兩個蛋白的編碼區域。
A.表達盒根據本發明，穩定轉化的浮萍是通過用包含於表達盒內的目的核苷酸序列轉化得到。表達盒包括連接有目的核酸或者基因的轉錄起始區。提供的表達盒具有多個可以插入一個或幾個目的基因的(例如，一個目的基因，兩個目的基因等等)限制性酶切位點，目的基因受到調控區域的轉錄調控。表達盒可以編碼單個目的基因。在本發明的具體實施方案中，轉移的核酸含有2個或者多個的表達盒，其中每個表達盒編碼至少一個目的基因。
轉錄起始區域，(例如啟動子)可以是宿主本身或者和宿主同源的或者外來的或者異源的，或者可以是天然序列或合成的序列。外來的轉錄起始區域就意味在野生型的宿主中不存在這種轉錄起始區，而是向其中引入的。此處使用的嵌合基因包含操作性連接與其異源的轉錄起始區的編碼序列。
根據本發明可以應用本領域已知的合適的啟動子(包括細菌，酵母，真菌，昆蟲，哺乳動物和植物的啟動子)。例如，可以使用植物啟動子，包括浮萍啟動子。典型的啟動子包括但並不僅限於花椰菜花葉病毒35S啟動子，冠癭鹼合成酶啟動子(例如，nos，mas，ocs，等等)，泛素啟動子，肌動蛋白啟動子，核酮糖雙磷酸(RubP)羧化酶小亞基啟動子，和乙醇脫氫酶啟動子。浮萍RubP羧化酶小亞基啟動子為本領域已知(Silverthorne等人(1990)Plant Mol.Biol.1549)。感染植物(優選感染浮萍)的病毒的其它啟動子也是合適的，這些啟動子包括但是並不僅限於芋頭(Dasheen)花葉病毒，小球藻(Chlorella)病毒(例如，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶啟動子；Mitra等人(1994)Plant Mol.Biol.2685)，番茄點狀萎蔫病毒，菸草脆裂病毒，菸草壞死病毒，菸草環斑病毒，番茄環斑病毒，黃瓜花葉病毒，花生殘株(stump)病毒，紫花苜蓿花葉病毒，甘蔗杆狀badnavirus等病毒分離出來的啟動子。
最終，選擇啟動子達到要求的調控水平。例如，在一些實例中，使用導致組成型表達的啟動子是有利的，(例如來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露鹼合成酶)。或者，在另外一種情況下，對特異性環境刺激反應而激活的誘導型啟動子是有利的(例如，熱休克基因啟動子，乾燥誘導型基因啟動子，病原體誘導型基因啟動子，創傷誘導型基因啟動子，和光/暗誘導型基因啟動子)或者使用對植物生長調節劑反應而激活的啟動子是有利的(例如，受到脫落酸，植物生長素，細胞分裂素，和赤黴素誘導的基因啟動子)。作為進一步的選擇，可以選擇導致組織特異性表達的啟動子(例如，根，葉，花特異的啟動子)。
給定啟動子的總強度受到順式作用核苷酸序列的組合及空間組織的影響，這種核苷酸如上遊激活序列。例如，根癌土壤桿菌章魚鹼合成酶基因的激活核苷酸序列能夠提高根癌土壤桿菌甘露鹼合成酶基因的啟動子(見Gelvin等人的美國專利5,955,646)的轉錄。本發明中，表達盒能包括啟動子序列上遊插入的激活核苷酸序列，以增強目的核苷酸序列的表達。在一個實施方案中，表達盒包括來自根癌土壤桿菌章魚鹼合成酶基因的3個上遊的激活核苷酸序列，該序列操作性連接於根癌土壤桿菌甘露鹼合成酶基因的啟動子(見美國專利5,955,646，此處引作參考)。
轉錄盒包括5′-3′方向的轉錄，轉錄和翻譯起始區，目的核苷酸序列，以及植物中轉錄和翻譯終止功能區。根據本發明，可以使用任何本領域已知的合適的終止序列。終止區可以對轉錄起始區是天然的(be native with)，可以對目的基因是天然的，也可以來自另外的來源。合宜的終止區來自根癌土壤桿菌Ti-質粒，例如章魚鹼合成酶和胭脂鹼合成酶的終止區。見Guerineau等人(1991)Mol.Gen.genet.262141；Proudfoot(1991)Cell 64671；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5141；Mogen等人(1990)Plant Cell21261；Munroe等人(1990)Gene 91151；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.177891；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.159627。另外典型的終止序列為豌豆RubP羧化酶小亞基終止序列和花椰菜花葉病毒35S終止序列。對於本領域技術人員其它適當的終止序列是顯而易見的。
或者，也可在本領域已知的任何其它合適的表達盒上提供目的基因。
表達盒可以含有超過一個轉移並在轉化的植物中表達的基因或者核酸序列。這樣，每個核酸序列可以操作性連接5′和3′調節序列。或者，也可以提供多個表達盒。
通常，表達盒包括用於選擇轉化的細胞或者組織的選擇性標記基因。選擇性標記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新黴素磷酸轉移酶lI(NEO)和潮黴素磷酸轉移酶(HPT)的基因，以及提供對除草劑化合物抗性的基因。除草劑抗性基因通常編碼對除草劑不敏感的經過修飾的靶蛋白，或者編碼在除草劑起作用之前降解除草劑或者除去其毒性的酶。見DeBlock等人(1987)EMBOJ.62513；DeBlock等人(1989)Plant Physiol.91691；Fromm等人(1990)BioTechnology 8833；Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell2603。例如，使用編碼突變靶酶5-烯醇丙酮醯莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合成酶(EPSPS)和乙醯乳酸合成酶(ALS)的基因獲得磷酸甘氨酸或者磺醯脲除草劑抗性。通過使用編碼去除相應除草劑毒性的phosphinothricin乙醯轉移酶，一種腈水解酶或者2，4-二氯苯氧基乙酸單加氧酶的細菌的基因獲得glufosinate銨，boromoxynil，和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性。
本發明的各種用途中，選擇性標記基因包括但是並不僅限於編碼新黴素磷酸轉移酶II的基因(Fraley等人(1986)CRC CriticalReviews in Plant Science 41)；氨腈水合酶(Maier-Greiner等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884250)；天氡氨酸激酶；二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶(Peri等人(1993)Biotechnology 11715)；bar基因(Toki等人(1992)Plant Physiol.1001503；Meagher等人(1996)Crop Sci.361367)；色氨酸脫羧酶(Goddijn等人(1993)Plant Mol.Biol.22907)；新黴素磷酸轉移酶(NEO；Southern等人(1982)J.Mol.Appl.Gen.1327)；潮黴素磷酸轉移酶(HPT或者HYG；Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.61074)；二氫葉酸還原酶(DHFR；Kwok等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834552)；hosphinothricin乙醯轉移酶(DeBlock等人(1987)EMBOJ.62513)；2，2-二氯丙酸脫滷素酶(Buchanan-Wollatron等人(1989)J.Cell.Biochem.13D-.330)；乙醯羥酸(acetohydroxyacid)合成酶(Anderson等人的美國專利4,761,373 Haughn等人(1988)Mol.Gen.Genet.221266)；5-烯醇丙酮醯莽草酸-磷酸合成酶(aroA；Comai等人(1985)Nature317741)；滷代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(WO 87/04181Stalker等人)；乙醯輔酶A羧化酶(Parker等人(1990)PlantPhysiol.921220)；二氫孕酮合成酶(sull；Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15127)；和32kDa光系統II多肽(psbA；Hirschberg等人(1983)Science 2221346(1983)。
也包括所有編碼以下抗性的基因慶大黴素(例如，aacCI，Wohlleben等人(1989)Mol.Gen.Genet.217202-208)；氯黴素(Herrera-Estrella等人(1983)EMBOJ.2987)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella等人(1983)Nature 303209；Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16807)；潮黴素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.5103；Zhijian等人(1995)Plant Science108219；Meijer等人(1991)Plant Mol.Bio.16807)；鏈黴素(Jones等人(1987)Mol.Gen.genet.21086)；大觀黴素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5131)；博來黴素(Hille等人(1986)Plant Mol.Biol.7171)；磺胺藥物(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Bio.15127)；bromoxynil(Stalker等人(1988)Science 242419)；2，4-D(Streber等人(1989)BioTechnology7811)；phosphinothricin(DeBlock等人(1987)EMBO J.62513)；大觀黴素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5131)。
Bar基因提供對glufosinate-類型除草劑(例如phosphinothricin(PPT)或者bialaphos，等等)的除草劑抗性。正如上述，其它可以在載體構建中使用的選擇性標記基因包括但並不僅限於pat基因，也用於bialaphos和phosphinothricin抗性，用於咪唑啉酮抗性的ALS基因，用於潮黴素抗性的HPH或者HYG基因，用於glyphosate抗性的EPSP合成酶基因，用於Hc-毒素抗性的Hml基因和其它常規使用以及本領域普通技術人員已知的選擇試劑。見Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3506；Chistopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896314；Yao等人(1992)Cell 7163；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.62419；Barkley等人(1980)操縱子The Operon 177-220；Hu等人(1987)Cell 48555；Brown等人(1987)Cell 49603；Figge等人(1988)Cell 52713；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865400；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 862549；Deuschle等人(1990)Science 248480；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.103343；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893952；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 885072；Wyborski等人(1991)Nuc.Acids Res.194647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10143；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.351591；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry 271094；Gatz等人(1992)Plant J.2397；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36913；Hlavka等人(1985)藥物學實驗手冊78；和Gill等人(1988)Nature334721.這些公開內容此處引入作為參考。
以上選擇性標記基因列表並不意在限制，任何選擇性標記基因都可以在本發明中使用。
B.修飾核苷酸序列以提高其在浮萍中的表達本發明提供表達的核苷酸序列的修飾以增加其在浮萍中的表達。一種修飾為使用浮萍優選的密碼子合成的目的核苷酸序列。本領域中有用植物優選密碼子合成核苷酸序列的方法。見例如，美國專利5,380,831和5,436,391；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 153324；lannacome等人(1997)Plant Mol.Biol.34485；及Murray等人，(1989)Nucleic Acids.Res.17477，此處引入作為參考。優選密碼子由在浮萍表達蛋白中最高使用頻率的密碼子來決定。例如，Lemna gibba密碼子的使用頻率可以在以下網頁找到http∥www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝Lemna+gibba+[gbpln]，而Lemnaminor密碼子使用頻率可以在以下網頁找到http∥www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi？species＝Lemna+minor+[gbpln]。在浮萍和其它單子葉植物中表達經過優化的基因被認為可以在本發明的方法中使用。見例如，EP 0 359 472，EP 0 385 962，WO 91/16432；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324；lannacome等人(1997)Plant Mol.Biol.34485；和Murray等人(1989)Nuc.Acids Res.17477，等等，此處引入作為參考。進一步認為所有基因序列或者基因序列的任何部分都可以優化或者合成。換言之，可以使用完全優化或者部分優化的序列。例如，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，87％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或者100％的密碼子可為浮萍的優選密碼。在一個實施方案中，有90至96％密碼子為浮萍優選密碼子。目的核苷酸序列的編碼序列可包含在Lemna gibba使用頻率至少為17％的密碼子。在一個實施方案中，修飾的核苷酸為在SEQ ID NO2顯示的人α-2B-幹擾素的編碼核苷酸序列，其中包含了93％的浮萍優選的密碼子。
目的核苷酸也進行其它的修飾以提高其在浮萍中的表達。這些修飾包括但是並不僅限於，去掉編碼的假多腺苷酸化信號的核苷酸序列，外顯子-內含子拼接位點信號的序列，轉座子類重複序列，以及其特徵已知為可能不利於基因表達的其它序列。序列的G-C含量可以調節到給定細胞宿主的平均水平，該水平由參考該宿主細胞內表達的已知基因計算而得。如果可能，可以修飾序列以避免預測的髮夾二級mRNA結構。
在動物和植物中翻譯起始密碼子的最佳的翻譯起始背景核苷酸序列之間存在已知的差別，這些翻譯起始背景核苷酸序列的組成影響翻譯起始的效率。見例如，Lukaszewicz等人(2000)Plant Science15489-98；和Joshi等人(1997)；Plant Mol.Biol.35993-1001。在本發明中，用於目的核苷酸序列翻譯起始密碼子的翻譯起始背景核苷酸序列可以修飾以提高在浮萍中的表達。在一個實施方案中，這樣修飾核苷酸序列，而使目的核苷酸序列的翻譯起始密碼子上遊緊接的三個核苷酸為「ACC」。在另一個實施方案中，這些核苷酸為「ACA」。
通過使用5′前導序列也能提高浮萍中轉基因的表達。該前導序列也能產生增強翻譯的效果。翻譯前導序列在本領域是已知的，包括但是並不僅限於，微小RNA病毒前導序列，例如，EMCV前導序列(腦心肌炎5′非編碼區；EIroy-Stein等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 866126)；馬鈴薯Y病毒前導序列，例如，TEV前導序列(Tobacco Etch Virus；Allison等人(1986)Virology 1549)；人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP；Macajak and Sarnow(1991)Nature35390)；苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA不翻譯的前導序列(AMVRNA4；Jobling和Gehrke(1987)Nature 325622)；菸草花葉病毒前導序列(TMV；Gallie(1989)Molecular Biology of RNA，2356)；馬鈴薯蝕刻病毒前導序列(Tomashevskaya等人(1993)J.Gen.Virol.742717-2724)；Fed-1 5′非翻譯區(Dickey(1992)EMBO J.112311-2317)；RbcS 5′非翻譯區(Silverthorne等人(1990)J.Plant.Mol.Biol.1549-58)；以及玉米萎黃斑點病毒前導序列(MCMV；Lommel等人(1991)Virology 81382)。並見文獻，DellaCioppa等人(1987)Plant Physiology 84965。包括植物內含子序列的前導序列也顯示增加植物中的翻譯效率，其中植物內含子序列包括來自玉米脫氫酶1基因的，來自蓖麻子過氧化氫酶基因或者擬南芥屬色氨酸途徑基因PAT1的內含子序列。(Callis等人(1987)GenesDev.11183-1200；Mascarenhas等人(1990)Plant Mol.Biol.15913-920)。本發明的一個實施方案中，將SEQ ID NO1中所列玉米乙醇脫氫酶1基因(GenBank編號X04049)核苷酸1222-1775對應的核苷酸序列插入到目的核苷酸序列上遊以增加其翻譯效率。
以上描述的任何一種增加浮萍表達的核苷酸序列修飾都可以在本發明中使用，包括任何一種修飾或者任何可能的修飾的組合。此處使用的短語″修飾用於提高浮萍中表達″是指含有任何一種修飾或者任何幾種修飾組合的核苷酸序列。
C.信號肽分泌蛋白通常從含有「信號肽」的前體多肽開始翻譯，前體肽包括一種和內質網膜(ER)上受體相互作用來指導正生成的多肽鏈跨膜位移且進入內質網膜進行細胞分泌的「信號肽」。通常從前體肽切下信號肽產生缺乏信號肽的「成熟」多肽。在本發明的一個實施方案中，在浮萍中表達的生物活性多肽的核苷酸序列和編碼信號肽的的核苷酸序列連接，信號肽指導多肽分泌入培養基。在本領域中指導目標蛋白移位到內質網(用於向胞外分泌)的植物信號肽是已知的。見例如，Lee等人的美國專利6,020,169。在本發明中，使目標多肽表達到ER中可以使用任何植物信號肽。在一些實施方案中，信號肽為擬南芥(Arabidopsis thaliana)鹼性內切殼多糖酶(basicendochitinase)信號肽(SEQ ID NO8；NCBI蛋白質編號BAA82823的胺基酸14-34)，伸展蛋白信號肽(Stiefel等人(1990)Plant Cell 2785-793)，水稻α-澱粉酶信號肽(SEQ ID NO6；NCBI蛋白質編號AAA33885的胺基酸1-31)，或者經修飾的水稻α-澱粉酶信號序列(SEQ ID NO7)。在另外一個實施方案中，信號肽對應於分泌的浮萍蛋白的信號肽。
或者，使用哺乳動物信號肽在遺傳改造的浮萍中引導表達的重組多肽進行分泌。已經證明植物細胞識別哺乳動物中以內質網為靶位點的信號肽，而且這些信號肽能夠指導多肽分泌不僅能夠通過質膜而且也能夠通過植物細胞壁。見Hiatt等人美國專利5,202,422和5,639,947。在本發明的一個實施方案中，引導多肽分泌的哺乳動物信號肽為人α-2b-幹擾素信號肽(NCBI蛋白質編號AAB59402的胺基酸1-23和SEQ ID NO4)。
在一個實施方案中，編碼信號肽的核苷酸序列經過修飾用來提高浮萍中的表達，使用B部分公開的目的核酸序列的任何一種修飾或者幾種修飾的組合。在另外一個實施方案中，水稻α-澱粉酶信號肽由SEQ ID NO3所列修飾核苷酸序列編碼，該序列含有大約93％浮萍優選的密碼子。
用本領域已知的常規方法從培養基中收穫分泌的生物活性多肽並通過層析，電泳，透析，溶劑-溶劑萃取，等方法來純化。
D.轉化的浮萍植物和浮萍節結培養物本發明使用的穩定轉化的浮萍是通過本領域已知的任何方法獲得的。在一個實施方案中，通過Stomp等人的美國專利6,040,498，(此處引入作為參考)公開的基因轉移方法之一獲得穩定轉化的浮萍。這些方法包括用包有含目的核苷酸序列的核酸的微射彈進行彈道轟擊來轉移基因，電穿孔轉移基因，和用含由目的核苷酸序列組成的載體的土壤桿菌介導的基因轉移。在一個實施方案中，通過任何一種在Stomp等人的美國專利6,040,498中公開的土壤桿菌介導的方法獲得穩定轉化的浮萍。使用的土壤桿菌為根癌土壤桿菌或者髮根土壤桿菌。
優選使用這些方法穩定轉化的浮萍植物表現正常的形態，並可通過有性生殖增殖。優選的，本發明轉化的植物含有單拷貝轉化的核酸，以及轉化的核酸中間沒有明顯的重排。也優選在浮萍中轉化的核酸以低拷貝數存在(即，每個轉化的細胞內核酸不超過5個拷貝，或者，不超過3個拷貝，進一步作為選擇，核酸少於3個拷貝)。
穩定轉化的浮萍表達生物活性蛋白激素，生長因子，或者細胞因子，胰島素，或者生長激素(尤其是人生長激素)。或者，浮萍表達生物活性β-葡糖醛酸糖苷酶。浮萍可以表達生物活性的α-2b-幹擾素，例如人α-2b-幹擾素前體(NCBI蛋白質編號AAB59402；SEQ IDNO4所列)或者成熟的人α-2b-幹擾素(NCBI蛋白質編號AAB9402第24-188位胺基酸；SEQ ID NO5所列)或者其生物活性變體。
人的α-2b-幹擾素「生物活性變體」是指通過在天然蛋白的N-末端和/或C-末端刪除(也稱為截短)或增加一個或者幾個核苷酸；在天然蛋白的一個或者多個位點刪除或者增加一個或者多個胺基酸；或在天然蛋白的一個或者多個位點替換一個或者多個胺基酸而從天然多肽衍生的得到的多肽。本發明包括的生物活性變體α-2b-幹擾素多肽具有生物活性，即，它們繼續擁有所需的天然α-2b-幹擾素生物活性，包括增加對病毒感染抗性的能力，調節受α-2b-幹擾素調節的靶基因轉錄的能力。如基因多態性或者人為操作可產生這種生物活性變體。本發明的天然α-2b-幹擾素的生物活性變體和SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5顯示的胺基酸序列至少具有50％，60％，65％，70％，一般至少為約75％，80％，85％，優選地至少為約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，更加優選至少約98％，99％或者更高的序列一致性。這樣，本發明的α-2b-幹擾素的生物活性變體和該蛋白的區別小至1-15個胺基酸殘基，小至1-10個胺基酸殘基，如6-10個，小至5個，小至4個，3個，2個，甚至一個胺基酸殘基。人α-幹擾素的生物活性變體在本領域是已知的。見例如，歐洲專利EP211148B1，和美國專利 4,748,233，4,801,685，4,816,566，4,973,479，4,975,276，5,089,400，5,098,703，5,231,176，和5,869,293；此處引入作為參考。
序列的比較和一致性百分比的確定以及兩種序列的相似性百分比的確定可通過數學運算法則得到。在優選的實施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.45444-453運算法則確定兩個胺基酸序列間的一致性百分比，在GCG軟體包(網站www.accelrys.com可下載)的GAP程序包含該法則，或者使用BLOSSUM62矩陣或者PAM250矩陣，並且16，14，12，10，8，6，或者4的缺口重量(gap weight)以及1，2，3，4，5，或者6的長度重量(length weight)。在另外一個優選的實施方案中，兩個核苷酸序列的一致性百分比用GCG軟體包中的GAP程序來確定，使用BLOSUM62記分(scoring)矩陣(見Henikoff等人(1989)Proc.Nati Acad Sci.USA 8910915)以及缺口重量為40，50，60，70，或者80及長度重量的1，2，3，4，5，或者6。特別優選的一套參數(而且也是當技術人員不能確定應該選擇哪些參數來確定分子是否在本發明的序列一致性限制範圍之內時使用的參數)是使用BLOSUM62記分矩陣，以缺口長重量為60以及長度重量為3)。
胺基酸或者核苷酸序列的一致性百分比還可以通過E.Meyers和W.Miller(1989)CABIOS 411-17的法則來確定。該法則包含在ALIGN程序中(版本2.0)，使用PAM120重量殘基(weight residue)表，缺口長度罰分(penalty)為12和缺口罰分為4。
在一個實施方案中，穩定轉化的浮萍或者浮萍節結培養物表達由於受到成本或者合理性或者這兩者共同的限制，現存的基因表達系統不能有效地進行商業生產的生物活性多肽。例如，由於蛋白在哺乳動物細胞內幹擾細胞生存，細胞生殖，細胞分化或者蛋白質組裝，一些蛋白不能在哺乳動物系統中表達。這些蛋白包括但是並不僅限於成視網膜細胞瘤蛋白，p53，制管張素，和leptin。可以有利地應用本發明來生產哺乳動物調節蛋白；由於高等植物和哺乳動物之間具有大的進化距離這些蛋白不可能干擾浮萍中的調控過程。轉基因浮萍也用來生產大量的蛋白如血清白蛋白(尤其是人血清白蛋白)，血色素，和膠原蛋白，挑戰現存的表達系統的生產能力。
最終，可以改造高等植物系統，使之要比哺乳動物系統更加容易地生產生物活性多聚體蛋白(例如，單克隆抗體，血色素，P450氧化酶和膠原蛋白等等)。一種在浮萍中生產生物活性多聚體蛋白典型的方法為使用含有所有多肽亞基編碼基因的表達載體。例如.During等人(1990)Plant Mol.Biol.15281和van Engelen等人(1994)Plant Mol.Biol.261701。將這種載體通過任何已知方法，例如彈道轟擊或者土壤桿菌介導的轉化方法引入到浮萍細胞。這種方法導致表達所有裝配多聚體蛋白所必需的多肽的無性細胞系。這種方法的變化為構建單基因構建體，將這些構建體的DNA混合在一起，然後用彈道轟擊或者土壤桿菌介導的轉化將DNA的混合物打入植物細胞。作為進一步的改變，一些或者所有載體可以編碼多聚體蛋白的一個以上的亞基(即，以便交叉的浮萍克隆要少於多聚體蛋白亞基的數量)。在另一個實施方案中，每個浮萍克隆至少表達多聚體蛋白的一個亞基，且分泌每個亞基的浮萍克隆在一起培養，由不同的分泌的亞基的在培養基中組裝成多聚體蛋白。在一些情況中，需要在浮萍植物或者浮萍節結培養物中產生的亞基要少於多聚體蛋白所有的亞基，或者僅僅產生單個蛋白亞基，例如，用於工業或者化學處理或者用於診斷，治療，或者接種疫苗目的。
實驗提供以下實施例用於說明目的，而不是為了限制。
表達載體在一些實施例中使用的表達載體pBMSP-1在美國專利5,955,646中做過描述，此處引入作為參考。pBMSP-1轉錄盒包含來自根癌土壤桿菌章魚鹼合成酶的轉錄激活核苷酸序列，和額外的來自根癌土壤桿菌甘露鹼合成酶基因的轉錄激活核苷酸序列，來自根癌土壤桿菌甘露鹼合成酶基因的啟動子區域，用於插入編碼目的多肽的核苷酸序列的多接頭位點，以及來自土壤桿菌根癌胭脂鹼合成酶基因的終止序列。pBMSP-1表達載體也含有作為可選標記的編碼新黴素磷酸轉移酶II的核苷酸序列。選擇性標記序列的轉錄由來自根癌土壤桿菌胭脂鹼合成酶基因的啟動子驅動。
也用於以下實施例的表達載體pBMSP-3含有以上所述的pBMSP-1表達載體的成分並附加含有和玉米乙醇脫氫酶基因(GenBank編號X04049)核苷酸1222-1775位相對應的核苷酸序列，該基因插於啟動子和多接頭之間。
用於在浮萍中生產人α-2b-幹擾素的表達構建體以下表達構建體使用本領域熟知的方法構建。見例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.分子克隆實驗手冊第二版，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室發行，冷泉港，紐約，1989。
表1
*編碼經過修飾的水稻α-澱粉酶信號肽的核苷酸序列對應GenBank編號M24286的第34-126位核苷酸，只是將97-102位核苷酸從″CTTGGC″改變為″ATCGTC″。
浮萍轉化使用上述的表達構建體用土壤桿菌介導的轉化方法轉化浮萍葉或者浮萍節結培養物(在這些實施例中來自浮萍株8627)。根癌土壤桿菌株C58Z707，一種解除毒性的(disarmed)，廣泛宿主範圍的C58株(Hepburn等人(1985)J.Gen.Microbiol.1312961-2969)用於這些實施例的轉化。上述的表達構建體通過電穿孔或者三親株雜交程序轉移到根癌土壤桿菌，三親株雜交程序使用含有移動(mobilizing)質粒pRK2013的大腸桿菌MM294(Hoekema等人(1983)Nature 303179-180；Ditta等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 777347-7350)。含有上述表達構建體的C58Z707株在AB最小培養基(Chilton等人，(1974)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 713672-3676)或者含有鏈黴素500mg/L，奇大觀黴素50mg/L以及硫酸卡那黴素50mg/L的YEB培養基(1g/L酵母提取物，5g/L牛肉汁提取物，5g/L蛋白腖，5g/L蔗糖，0.5g/LMgSO4)上劃線，並在28℃過夜培養。
儘管可以使用任何浮萍屬株，但在這些實施例中使用浮萍株8627來轉化。葉子在液體Schenk和Hildebrandt培養基(Schenk andHildebrandt(1972)Can.J.Bot.50199)中生長，該培養基含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸，培養溫度23℃，光周期為光照下培養16小時/陰暗條件下培養8個小時，光強度大約為40μM/m2sec。用於接種，將單個葉子從叢中分開並漂浮在接種培養基上持續大約2-20分鐘。接種培養基為Schenk和Hildebrandt培養基(pH5.6)，附加0.6M甘露醇和100μM乙醯基丁香酮，適當的根癌土壤桿菌株包含表達構建體的濃度為1×109細胞/毫升。然後將這些葉子轉移到含有1％蔗糖，0.9％瓊脂以及20mg/L乙醯丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養基(pH5.6)並在23℃於陰暗處共培養3-4天。
共培養之後，轉移葉子到Schenk和Hildebrandt培養基或者附加200μg/ml硫酸卡那黴素的Murashige和Skoog培養基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473)用以回收。每隔2-4天將感染的組織轉移到含有抗生素的新鮮的培養基中來去除葉子感染土壤桿菌的汙染。葉子在低光強(1-5μM/m2sec)的條件下在該培養基上培養大約4周。
用於轉化的浮萍節結培養物生產如下。分離浮萍葉子，用無菌手術刀切去根，將葉子腹側面朝下置於附加5μM2，4-二氯苯氧基乙酸，0.5μM 1-苯基-3(1，2，3-thiadiazol-5-基)脲thidiazuron(SigmaP6186)，3％蔗糖，0.4 Difco Bacto-瓊脂(Fisher Scientific)，和0.15％ Gelrite(Sigma)的Murashige和Skoog培養基中(目錄號M-5519；Sigma化學公司，St.Louis，MO)pH5.6。葉子生長5-6周。此時，節結(小的微黃色細胞團)出現，通常從腹側中心部分出現。將節結組織從母葉中分離並在附加3％蔗糖，0.4％ DifcoBacto-瓊脂，0.15％ Gelrite，1μM2，4-二氯苯氧基乙酸，和2μM苄基腺嘌呤的Murashige和Skoog培養基中進行培養。
浮萍節結培養物轉化如下。合適的根癌土壤桿菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂或者含有50mg/L卡那黴素和100μM乙醯丁香酮的YEB瓊脂上生長，並在附加0.6M甘露醇和and 100μM乙醯丁香酮的Murashige和Skoog培養基中重懸。通過將重懸的細菌浸入溶液1-2分鐘，移去剩餘的液體，並鋪於共培養培養基中來接種節結培養組織，該培養基含有Murashige和Skoog培養基並附加植物生長素和優化的促進節結生長細胞分裂素和100μM乙醯丁香酮。
用於選擇，將節結培養物組織轉移到再生培養基Murashige和Skoog培養基含有3％蔗糖，1μM2，4-二氯苯氧基乙酸，2μM苄基腺嘌呤，0.4％ Difco Bacto-瓊脂，0.15％ Gelrite，500mg/L頭孢氨噻，和200mg/L硫酸卡那黴素，並在連續光照(20-40μM/m2sec)下培養大約4周。每7天將結節組織轉移到新鮮培養基中。當結節組織在篩選劑中生長旺盛時，篩選結束。在某些實施例中，直接將轉化的浮萍結節組織培養物轉移到用於篩選的再生培養基中，而不是在共培養培養基中進行篩選。
對於轉化浮萍的再生，將篩選得到的結節培養物轉移到再生培養基(0.5×Schenk和Hildebrandt培養基添加1％的蔗糖和200mgs/L的卡那黴素)中組織並產生植物。結節培養物在再生培養基上以充足的光照孵育約3周時間，直到葉出現。將充分組織好的葉轉移到加有1-3％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養基中並在充足的光照下孵化進行克隆增殖。
檢測由浮萍葉或者浮萍結節培養物產生的生物活性幹擾素利用多種分析方法檢測生物活性幹擾素，包括Staehlin等人(1981年)酶學方法(Methods Enzymol.)79589-594和Kelder等人(1986年)酶學方法(Methods Enzymol.)119582-587，描述的固相夾心式免疫實驗，此處引入作為參考，以及Tovey等人(1978年)自然(Nature)276270-272所描述的細胞病變作用抑制實驗(cytopathic effect inhibition assay)，此處引入作為參考。從浮萍培養基中收集分泌型幹擾素，從浮萍植物或者浮萍結節組織的研磨或者裂解物中收集非分泌型幹擾素。
根據生產商的使用說明使用PBL實驗室(New Brunswick，新澤西州)的試劑盒進行幹擾素的固相夾心式免疫分析。簡而言之，幹擾素被結合在微量滴定板孔中的抗體捕獲。接著用二抗顯示結合的抗體。然後使用結合有辣根過氧化物酶(HRP)的抗二抗標記幹擾素。四甲基對二氨基聯苯(TMB)啟動過氧化物酶催化的顏色變化以便可以觀察幹擾素的水平並與標準比較。在本實施例中使用對α-2b-幹擾素特異的單克隆抗體(目錄號11105，PBI實驗室)進行此項分析。
按照Tovey等人(1978年)自然(Nature)276270-272的方法進行細胞病變作用抑制分析。簡而言之，將待分析的樣品的連續兩倍稀釋樣用100微升添加2％的胎牛血清的Eagles基本培養基(Life Technologies公司)稀釋到96孔微量滴定板(Falcon公司)中，使用美國國家衛生研究院人IFNα國際參考樣品(G-002-901-527)的連續兩倍稀釋樣進行平行實驗。然後，在包含100微升有2％的胎牛血清的培養基的微量滴定板的每個空中加入2萬個人羊膜細胞(WISH系)。將細胞在5％CO2和37℃的條件下培養過夜，用200微升有2％的胎牛血清並且含有感染複製指數為0.1的水泡性口炎病毒的培養基換液。將細胞進一步在5％CO2和37℃的條件下培養過夜，然後在光學顯微鏡下估計由於病毒複製的細胞病變作用。幹擾素的滴度表示為能夠對病毒的細胞病變作用提供50％的保護的IFN的稀釋度的倒數。通過參考參照樣品的滴度，幹擾素的滴度用國際參考單位的形式表示。
如下實施例說明在浮萍中表達生物活性幹擾素。
實施例1進行這一研究旨在確定同一批培養物中在不同時間點存在於培養基和組織中的培養的IFN的水平。第0天在一套24至30毫升175盎司的培養瓶中接種20片同一品系經先預鑑定為表達可檢測水平的人α-2b-幹擾素(IFN)的葉。培養物在自給營養，緩衝環境中生長並且由植物/水生物螢光生長燈泡提供連續的強光。在每一時間點-第5、7、13、15和18天-測量四個培養物的鮮重和培養基體積。對於每一培養物，取其培養基和組織樣品並且加入植物蛋白酶抑制劑混合物。將組織樣品研磨並且冷凍離心。收集上清液。培養基和組織提取物保存在零下70℃直到準備好所有的樣品。在同一天使用上述固相夾心式免疫實驗測定培養基和組織提取物中的IFN的水平。將測量的IFN的濃度分別乘以培養基的體積和培養物的鮮重計算培養基和組織中培養的IFN的總量。圖1表示了在第7、13、15和18天與第5天相比的相對IFN水平。在最後一個時間點，由於失去一個培養物，所表示的是三個培養物的平均值而不是四個培養物的平均值。
實施例2進行這一研究旨在確定同一批培養物中在不同時間點存在於培養基和組織中的培養IFN的水平。第0天在一套24至30毫升175盎司的培養瓶中接種20片同實施例1中同一品系的葉。培養物在自給營養，非緩衝液環境中生長並且由植物/水生物螢光生長燈泡提供連續的強光。在每一時間點-第7、10、12、14、17和19天-測量四個培養物的鮮重和培養基體積。對於每一培養物，取其培養基和組織樣品並且加入一植物蛋白酶抑制劑混合物。將組織樣品研磨並且冷凍離心。收集上清液。培養基和組織提取物保存在零下70℃直到準備好所有的樣品。在同一天使用上述固相夾心式免疫實驗測定培養基和組織提取物中的IFN的水平。將測量的IFN的濃度分別乘以培養基的體積和培養物的鮮重計算培養基和組織中培養IFN的總量。圖2表示了在第14、17和19天與第12天相比的相對IFN水平。在第7天和第10天培養基中的IFN水平低於進行免疫實驗流程的延伸範圍的範圍。
實施例3表1中所列表達載體轉化的浮萍用上述方法產生。轉化的浮萍系在自給營養的條件下生長14天。生長培養基中包括濃度為0.2毫克/毫升的牛血清白蛋白。在第14天，如實施例1中所述準備培養基和組織提取物，並用上述的固相夾心式免疫實驗方法測定這些提取物中幹擾素的水平。
表2給出了所分析的克隆浮萍系的數量和每個表達載體的平均培養基幹擾素濃度。表3表示了對於經不含信號肽的幹擾素表達載體(IFN01，IFN10和IFN12)轉化的浮萍系，在其組織中幹擾素的水平。並且表示了所分析的全部克隆品系對指定構建體的平均幹擾素水平，以及最高表達品系的幹擾素水平。
表2
表3
這些轉化的浮萍系生產的幹擾素的生物活性使用上述細胞病變作用實驗方法檢測。表4給出了每個構建體的高表達系的結果。並且表明了那些包含信號肽的構建體的培養基中的幹擾素的活性和那些無信號肽的構建體在組織中的幹擾素的活性。
表4
由此實施例中的數據可以注意到如下特徵(1)僅在轉化有包含信號肽的表達構建體的浮萍系中檢測到幹擾素的分泌。例如，將IFN02，IFN03，IFN05，IFN07，IFN08，IFN09和IFN011培養基中的幹擾素濃度與IFN01，IFN10，和IFN12的相比較。(2)對於所有包含信號肽的表達構建體，均檢測到幹擾素的分泌，而加入天然的人幹擾素信號肽序列的產生最高水平的分泌型幹擾素。例如，將IFN02產生的幹擾素水平與IFN03和IFN05產生的那些相比較。(3)使用浮萍優選的密碼子可以增強幹擾素的表達。例如，將IFN09產生的幹擾素水平與IFN05產生的相比較。(4)不僅僅對信號肽優化密碼子獲得更高的表達水平。例如，比較IFN08和IFN09。(5)包含玉米乙醇脫氫酶的內含子序列的表達構建體可以產生更高水平的幹擾素表達。例如，比較IFN09和IFN11，及IFN10和IFN12。(6)比較包含修飾的α-澱粉酶信號肽(IFN05)與含有野生型α-澱粉酶信號肽(IFN07)構建體的幹擾素表達水平，沒有觀察到統計學顯著的差異。
在說明書中提及的所有的出版物和專利申請資料指示本發明相關領域技術人員的水平。所有出版物和專利申請資料在此引入作為參考，程度等同於特定並單獨指出每份單獨出版物或者專利申請資料在此引入作為參考。
為了清楚的理解儘管前述發明通過圖例和實施例在某些細節上做過描述，但是在附加的權利要求範圍內進行某些改變和修飾是顯而易見的。
序列表110Biolex，Inc.
Stomp，Anne-MarieDickey.LynnGasdaska，John120在浮萍中表達生物活性多肽13040989/237187150US 60/293,3301512001-05-23150US 60/221,7051512000-07-311608170FastSEQ for Windows Version 4.02101211554212DNA213玉蜀黍4001gatcaagtgc aaaggtccgc cttgtttctc ctctgtctct tgatctgact aatcttggtt 60tatgattcgt tgagtaattt tggggaaagc ttcgtccaca gttttttttt cgatgaacag 120tgccgcagtg gcgctgatct tgtatgctat cctgcaatcg tggtgaactt atgtctttta 180tatccttcac taccatgaaa agactagtaa tctttctcga tgtaacatcg tccagcactg 240ctattaccgt gtggtccatc cgacagtctg gctgaacaca tcatacgata ttgagcaaag 300atctatcttc cctgttcttt aatgaaagac gtcattttca tcagtatgat ctaagaatgt 360tgcaacttgc aaggaggcgt ttctttcttt gaatttaact aactcgttga gtggccctgt 420ttctcggacg taaggccttt gctgctccac acatgtccat tcgaatttta ccgtgtttag 480caagggcgaa aagtttgcat cttgatgatt tagcttgact atgcgattgc tttcctggac 540ccgtgcagct gcgg 554210221498212DNA213人工序列
220
223由浮萍密碼子優化的人a-2B-幹擾素的核苷酸編碼序列221CDS222(1)...(498)4002tgc gac ctc ccc cag acc cac agc ctc ggg tcc cgc cgc acc ctc atg 48Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15ctg ctg gcg cag atg cgc cgc atc tcg ctc ttc agc tgc ctg aag gac 96Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30cgc cac gac ttc ggc ttc ccg cag gag gag ttc ggc aac cag ttc cag 144Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45aag gcc gag acg atc ccc gtg ctc cac gag atg atc cag cag atc ttc 192Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60aac ctg ttc agc acc aag gac agc tcg gcc gcc tgg gac gag acc ctg 240Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80ctc gac aag ttc tac acc gag ctg tac cag cag ctc aac gac ctg gag 288Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95gcg tgc gtg atc cag ggg gtt ggg gtt acg gag acg ecg ctg atg aag 336Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110gag gac agc atc ctc gcc gtg cgc aag tac ttc cag cgc atc acg ctc 384Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125tac ctc aag gag aag aag tac agc ccg tgc gcc tgg gag gtc gtt cgc 432Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140
gcc gag atc atg cgc tcc ttc agc ctg agc acc aac ctc cag gag agc480Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160ctc cgc tcc aag gag taa498Leu Arg Ser Lys Glu *165210321196212DNA213稻4003accatgcagg tcctgaacac gatggtcaac aagcacttcc tctccctgtc cgtcctcatc60gtcctcctcg ggctgagcag caacctcacc gccggc 962104211188212PRT213人4004Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu20 25 30Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His65 70 75 80Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160
Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu165 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 1852105211165212PRT213人4005Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1 5 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65 70 75 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu85 90 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140A1a Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Leu Arg Ser Lys Glu165210621131212PRT213稻4006Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu Ser1 5 10 15
Val Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly20 25 30210721131212PRT213人工序列220
223改造的水稻a-澱粉酶信號肽4007Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu Ser1 5 10 15Val Leu Ile Val Leu Thr Val Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly20 25 30210821121212PRT213擬南芥4008Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Ser Ala Glu20
權利要求
1.在浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物中生產生物活性重組多肽的方法，其包括以下步驟(a)在浮萍培養基中培養浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中該浮萍植物培養物或者該浮萍節結培養物被穩定轉化以表達所述的生物活性重組多肽，且其中生物活性重組多肽由含有多肽編碼序列和操作性連接的指導多肽分泌入培養基的信號肽的編碼序列的核苷酸序列表達。(b)從浮萍培養基收集所述生物活性多肽。
2.權利要求1的方法，其中生物活性多肽分泌到浮萍培養基中。
3.權利要求1的方法，其中核苷酸序列有至少一種特徵選自(a)該多肽的編碼序列中有浮萍優選的密碼子；(b)該信號肽的編碼序列中有浮萍優選的密碼子；(c)翻譯起始密碼子兩側為植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(d)操作性連接的核苷酸序列含有插入編碼序列上遊的植物內含子。
4.根據權利要求3的方法，其中所述浮萍優選密碼子為Lemnagibba-優選的密碼子或者浮萍(Lemna minor)-優選的密碼子。
5.根據權利要求4的方法，其中選自所述多肽編碼序列和所述信號肽編碼序列的至少一種編碼序列含有70％-100％的Lemnagibba-優選的密碼子或者浮萍-優選的密碼子。
6.根據權利要求3的方法，其中所述植物優選的翻譯起始背景的核苷酸序列由核苷酸序列「ACC」或者「ACA」組成，其中該背景定位緊接著翻譯起始密碼子5′末端。
7.根據權利要求3的方法，其中包含所述植物內含子的操作性連接的核苷酸序列為SEQ ID NO1所列序列。
8.生產生物活性重組多肽的方法，包括以下步驟(a)培養浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中該浮萍植物培養物或者該浮萍節結培養物被穩定轉化以表達所述生物活性重組多肽，且其中生物活性重組多肽由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列經過修飾而提高其在浮萍中的表達，以及(b)從所述浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物收集生物活性多肽。
9.權利要求8的方法，其中經過修飾以提高其在浮萍中表達的核苷酸序列有至少一種特徵選自(a)該生物活性重組多肽的編碼序列中有浮萍優選的密碼子；(b)翻譯起始密碼子兩側為植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列；以及(c)操作性連接的核苷酸序列包含被插入編碼序列上遊的植物內含子。
10.根據權利要求9的方法，其中該浮萍優選密碼子為Lemnagibba-優選的密碼子或者浮萍優選的密碼子。
11.根據權利要求10的方法，其中編碼序列含有70％-100％的Lemna gibba-優選的密碼子或者浮萍-優選的密碼子。
12.根據權利要求9的方法，其中所述植物優選的翻譯起始背景核苷酸序列由核苷酸序列「ACC」或者「ACA」組成，其中背景定位緊接著翻譯起始密碼子5′末端。
13.根據權利要求9的方法，其中包含所述植物內含子的操作性連接的核苷酸序列為SEQ ID NO1所列序列。
14.根據權利要求1的方法，其中該浮萍葉培養物或者浮萍節結培養物表達並裝配生物活性多聚蛋白所有的亞基。
15.根據權利要求14的方法，其中該生物活性多聚蛋白選自膠原蛋白，血色素，P450氧化酶，以及單克隆抗體。
16.根據權利要求1的方法，其中生物活性重組多肽為哺乳動物多肽。
17.根據權利要求16的方法，其中哺乳動物多肽為治療多肽。
18.根據權利要求16的方法，其中哺乳動物多肽選自胰島素，生長激素，α-幹擾素，β-幹擾素，β-葡糖腦苷脂酶，β-glucoronidase，成視網膜細胞瘤蛋白，p53蛋白，制管張素，leptin，單克隆抗體，細胞因子，受體，人用疫苗，動物疫苗，植物多肽，和血清白蛋白。
19.根據權利要求1的方法，其中生物活性重組多肽為α-2b-幹擾素。
20.根據權利要求19的方法，其中所述α-2b-幹擾素為人α-2b-幹擾素。
21.根據權利要求20的方法，其中所述人α-2b-幹擾具有SEQID NO4或者SEQ ID NO5所列素胺基酸序列。
22.根據權利要求1的方法，其中生物活性重組多肽為α-2b-幹擾素的生物活性變體，其中所述生物活性變體和SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5有至少80％的序列一致性。
23.根據權利要求1的方法，其中生物活性重組多肽為酶。
24.根據權利要求1的方法，其中所述信號肽序列選自(a)人α-2b-幹擾素信號肽；(b)擬南芥殼多糖酶信號肽；(c)水稻α-澱粉酶信號肽；(d)修飾的水稻α-澱粉酶肽；(e)浮萍信號肽；以及(f)生物活性重組多肽的本身的信號肽。
25.根據權利要求24的方法，其中信號肽為具有SEQ ID NO3所列序列的水稻α-澱粉酶的信號肽。
26.根據權利要求1的穩定轉化的浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物。
27.根據權利要求26的穩定轉化的浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中該浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物選自紫萍屬，蕪萍屬，Wolfiella屬和浮萍屬。
28.根據權利要求27的穩定轉化的浮萍植物培養物或者浮萍節結培養物，其中該浮萍植物培養物和浮萍節結培養物選自浮萍，Lemnaminiscula，Lemna aequinoctialis和Lemna gibba。
29.核酸分子，其包括編碼選自以下胺基酸序列的核苷酸序列(a)SEQ ID NO4所列胺基酸序列；(b)SEQ ID NO5所列胺基酸序列；(c)SEQ IN NO4所示胺基酸序列的生物活性變體的胺基酸序列，其中該生物活性變體和SEQ ID NO4所列序列具有至少約80％的序列一致性；以及(d)SEQ IN NO5所示胺基酸序列的生物活性變體的胺基酸序列，其中該生物活性變體和SEQ ID NO5所列序列具有至少約80％的序列一致性；其中該核苷酸序列包含浮萍優選的密碼子。
30.權利要求29的核酸分子，其中該核苷酸序列為SEQ ID NO2所列核苷酸序列。
31.核苷酸分子，其包括編碼選自以下信號肽的核苷酸序列(a)SEQ ID NO6所列的水稻α-澱粉酶信號肽的胺基酸序列；以及(b)SEQ ID NO7所列的修飾的水稻-澱粉酶信號肽的胺基酸序列；其中該核苷酸序列包含浮萍優選的密碼子。
32.權利要求31的核酸分子，其中該核苷酸序列為SEQ ID NO3所列核苷酸序列。
33.權利要求29的核酸分子，其中該核酸分子包括SEQ ID NO5所列核苷酸序列並進一步包括SEQ ID NO3給出的編碼信號肽的核苷酸序列且SEQ ID NO5所述的核苷酸序列和SEQ ID NO3給出的該編碼信號肽的核苷酸序列操作性相連接。
34.權利要求33的核酸分子，額外包括SEQ ID NO1給出的包含內含子的核苷酸序列，其中所述含有內含子的核苷酸序列，所述編碼信號肽的核苷酸序列和所述編碼成熟的人α-2b-幹擾素的核苷酸序列操作性相連接。
全文摘要
本發明提供用於從遺傳改造的浮萍表達和分泌生物活性多肽的方法，核酸序列和轉化的浮萍植物或者浮萍節結的培養物。通過修飾編碼多肽的表達盒的核苷酸序列來提高在浮萍中的表達，改進重組多肽在浮萍中的表達。通過將生物活性多肽連接到指導多肽向培養基分泌的信號肽改善從浮萍中回收生物活性多肽。
文檔編號C12N15/67GK1840667SQ20061005968
公開日2006年10月4日 申請日期2001年7月26日 優先權日2000年7月31日
發明者A-M·斯湯普, L·迪奇, J·加斯達斯卡 申請人:比奧萊克斯公司