一種用於植物源蛋白的益生菌發酵劑的製備方法
2023-04-23 15:52:51
專利名稱：一種用於植物源蛋白的益生菌發酵劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵技術領域，尤其是關於一種用於發酵豆粕、 棉籽粕和花生粕等植物蛋白原料的益生菌發酵劑的製備方法。
背景技術：
益生菌(Probiotic)被定義為含有足夠數量活菌、組成明確的微生 物製劑或產品，能通過定殖作用改變宿主某一部位菌群組成、從而有 利於宿主的健康作用。除了定殖作用外，益生菌的代謝產物從簡單的 短鏈脂肪酸到一些人體必需，結構複雜的有機酸如葉酸、乳清酸等， 這些化合物能使消化道的pH值降低，形成一種酸性環境，並且對宿主 的一系列生理過程進行調節。益生菌在腸腔內釋放的各種酶可以對消 化過程起協同作用，減緩部分腸道吸收不良的症狀。此外，益生菌產 生的細菌素等抗菌物質能提高益生菌在體內的抗菌作用，增加了其作 為生物治療方法的應用潛力。益生菌的保健作用主要體現在以下方面-①抑制腸道致病菌，調節腸道免疫功能，防治多種類型腹瀉；②刺激 腸道蠕動、防止便秘和胃腸脹氣；③促進生長，控制感染與增強營養 素的消化率；④促進鈣、鎂、鐵、鋅和維生素D的吸收；⑤減輕乳糖 不耐受症狀；⑥降血壓作用；⑦抗腫瘤作用等。目前用作益生菌的微 生物均是來源於人或動物，人們研究和應用比較多的是乳酸桿菌和雙 歧桿菌這些可以產生乳酸的腸道菌，因此益生菌製品也經常使用這兩 個屬的細菌，如植物乳桿菌，噬酸乳桿菌，長雙歧桿菌、嬰兒雙歧杆 菌等。大豆肽是大豆蛋白經水解後，由3~6個胺基酸組成的低肽混合物， 分子量為1000Da左右。大豆肽的胺基酸組成雖與大豆蛋白十分相似, 但卻具大豆蛋白所沒有的許多獨特的理化作用，如良好的溶解性、低 粘度、抗凝膠形成性，而且在體內具有良好的消化吸收性。近年來的 營養生理學的研究證明，蛋白質在胃和小腸中基本上水解成肽，小肽 作為蛋白質的主要消化產物，在胺基酸消化、吸收及營養代謝中起著 重要作用。許多小分子量的肽在經人體消化道時不被水解，而是直接 被人體吸收利用，而且吸收速度和吸收率均比大分子蛋白(如大豆蛋 白、酪蛋白)和小分子胺基酸高，且不存在游離胺基酸之間的競爭性抑 制問題[5]。同時，除了易消化吸收外，與大分子蛋白相比，大豆肽還具有大豆 蛋白所不具備的多種生物活性，如促進能量代謝以及減肥作用，消除 疲勞效果，增強肌肉作用，低抗原性，降膽固醇作用，抗氧化作用， 降血壓效果，調節胰島素等。此外，大豆肽對一些微生物如乳酸菌、 雙歧桿菌，以及酵母等的生長有一定促進效果，可以調節人和動物體 腸道內微生態平衡。正因為大豆肽不僅能提供人體生長發育所需的營 養物質，同時還具有防病、治病、調節人體生理機能的功效，可以作 為食品添加劑或強化劑，添加到食品或飲料中。例如製成嬰幼兒特製 多肽奶粉，孕婦、中老年保健多肽粉劑、衝劑、片劑，多肽護肝、保 腎、抗癌、減肥、抗血栓、防動脈硬化、防糖尿病食品，多肽補鈣、 鋅、鐵等微量元素食品等。近年來，大豆肽的保健及醫療作用日益引 起世界各國營養學家和食品科學家的普遍關注，將大豆肽分離、純化， 以提高生物活性、推動產品的開發應用已成為生物活性肽研究的熱門 課題。多肽的生產方法有化學法、酶解法、微生物發酵法等。其中，以 微生物發酵法最有前途，它在產生多肽的同時，還能修飾肽中的苦味 因子，增加發酵產物中還原型異黃酮等生理活性物質的含量。但目前 微生物發酵生產多肽採用的菌種多為黑麴黴、米麴黴等真菌菌種，產 品本身不具有益生價值。目前國內已有製備含乳酸菌多肽產品的技術，如申請號為02156830. 8 二次發酵大豆降解酸奶的專利，採用兩步液體 發酵的方法，生產工藝複雜，操作條件要求嚴格，生產成本較高。因 此，開發一種簡單有效的用於固態發酵植物蛋白原料的益生菌發酵劑， 其發酵產品富含多肽和益生菌的產品，使多肽的營養價值和益生菌的 益生作用相結合，從而顯著增強植物蛋白原料的營養價值，將會產生 巨大的經濟和社會效益。發明內容本發明的目的是提供一種通過菌種篩選，分離純化得到在植物蛋 白原料中具有較強生長和產酸性能的益生菌菌株，菌種經過培養、濃 縮、乾燥得到益生菌乾粉，再與適量的蛋白酶混合，建立一種密閉靜 止厭氧固態發酵的方式，使豆粕、花生粕等植物蛋白原料中大分子蛋 白降解為小肽，得到的用於發酵植物蛋白製造活性肽的益生菌發酵劑。本發明的技術方案是通過以下方式實現的 一種用於發酵植物源 蛋白製造活性肽的益生菌發酵劑製備方法，包括以下步驟1)、 菌種活化所採用的菌株為植物乳桿菌(Za"o&"7/w ; /fl"tan/m ) LP8，將保藏的菌種接入MRS培養基斜面，37。C培養至 出現菌落，然後再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落後重 復以上操作，連續轉接3次，即得活化菌種；上述所用的MRS培養基組成為蛋白腖10g/L;酵母提取物5 g/L; 檸檬酸二銨2g/L;葡萄糖20g/L;牛肉膏10g/L;吐溫80 1 mL/L; K2HP042 g/L; MgS04 7H20 0.58 g/L; MnS04 4H20 0.25 g/L，瓊脂 15—20g/L， pH 6.2—6.5， 121'C滅菌15分鐘;2) 、種子培養將步驟1)中所得到的乳酸菌活化菌種，接種於 乳酸菌三角瓶液體培養基(w/v)中，於37。C培養18—20小時，得到 乳酸菌發酵種子；上述所用的培養基(w/v)組成為大豆蛋白腖10g/L;乳糖5g/L; 牛肉膏5 g/L;酵母膏3g/L;NaCl 4 g/L;溴甲酚紫3 g/L;吐溫一80 lmL; L-HC1半胱氨酸lg/L; pH值7.0, 121'C滅菌15分鐘；3) 、發酵罐培養將培養好的種子以5%的接種量接種到發酵培 養基中，於35—38。C培養24-48小時，攪拌速度為150—200 r/min， 通風量為lvvm，待pH值下降到5.0左右時，停止發酵;4) 、濃縮將上述培養物經轉速4000—5000 r/min、離心濃縮20 一30min，得到活性植物乳桿菌的濃縮物；5) 、乾燥添加20%的含1.5%甘油+ 10%脫脂乳的水溶液做保 護劑，與菌體沉澱物均勻混合製成懸浮液，將菌懸液置於一4(TC的冰 箱中冷凍3 — 5小時後，取出放入冷凍乾燥機中，調冷阱溫度至一59 °C，乾燥24—36小時後取出，得到含活性益生菌數為10"CFU/g左右 的菌粉；6) 混合將步驟5)得到的益生菌菌粉，與植物蛋白原料的酸性 蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、e—葡聚糖酶中的一種或幾種相混 合，製成含活性菌101(}CFU/g，酸性蛋白酶含量10 — 50%，中性蛋白 酶10—20%,纖維素酶5 — 10%、 葡聚糖酶10—20%的發酵劑。本發明所用的植物蛋白原料為大豆餅粕、花生餅粕、芝麻餅粕、 菜籽餅粕、向日葵餅粕、玉米蛋白粉及小麥蛋白粉及其相應蛋白中的 一種或幾種。採用本發明的發酵劑在發酵豆粕、花生粕等植物源蛋白後，可使發酵產品的益生菌活菌數達108CFU/g,粗蛋白含量增加3%—5%，蛋 白質水解度達到12% —15%， pH值降低到3.8—4.0，乳酸含量5%—6 %。本發明中所得的發酵劑發酵原料所得產物經測定表明，益生菌活 菌數達108CFU/g以上。發酵後提高幹物質中的粗蛋白含量4一5%， 蛋白水解度達15%以上，畜禽發病率降低10—15%。
具體實施方式
實施例1:1)菌種活化所採用的菌株為植物乳桿菌(丄"cto6ac/〃w / /awtor, ) LP8， 該菌株已在Journal of animal feed science and technology發表，將保藏的菌種接入MRS培養基斜面，37匸培養至出 現菌落，然後再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落後重複 以上操作，連續轉接3次，即得活化菌種。所用的MRS培養基組成為 蛋白腖10g/L;酵母提取物5g/L;檸檬酸二銨2g/L;葡萄糖20 g/L;牛肉膏10 g/L;吐溫80 1 mL/L; K2HP042 g/L; MgS04 '71120 0.58 g/L; MnS04 4H20 0.25 g/L,瓊脂15—20g/L， pH 6.2—6.5， 121。C滅菌15 分鐘。2)、種子培養將步驟1)中所得到的乳酸菌活化菌種，接種於 乳酸菌三角瓶液體培養基中，於37t:培養18—20小時，得到乳酸菌發酵種子。所用的培養基組成為(W/V):大豆蛋白腖10g/L;乳糖5g/L;牛肉膏5g/L;酵母膏3g/L;NaC14g/L;溴甲酚紫3g/L;吐溫一80 lmL; L-HC1半胱氨酸lg/L; pH值7.0， 12rC滅菌15分鐘。3) 、發酵罐培養將培養好的種子以5%的接種量接種到發酵培 養基中，於35—38。C培養24-48小時，攪拌速度為150—200 r/min， 通風量為lvvm，待pH值下降到5.0左右時，停止發酵。4) 、濃縮將上述培養物經轉速4000—5000 r/min離心濃縮20— 30min，得到活性植物乳桿菌的濃縮物。5) 、乾燥添加20%的含1.5%甘油+ 10%脫脂乳的水溶液做保 護劑，與菌體沉澱物均勻混合製成懸浮液，將菌懸液置於一40'C的冰 箱中冷凍3—5小時後，取出放入冷凍乾燥機中，調冷阱溫度至一59 'C，乾燥24—36小時後取出，得到含活性益生菌數為10"CFU/g左右 的菌粉。6) 、混合將步驟5)得到的益生菌菌粉，與酸性蛋白酶、中性 蛋白酶、纖維素酶，P—葡聚糖酶，按重量比10:50:25:10:5相混合， 製成含活性菌101QCFU/g的發酵劑。實施例2:步驟1到5同實施例1，將益生菌粉與酸性蛋白酶、P —葡聚糖酶按 重量比10:80:10相混合，製成發酵劑。採用本發酵劑發酵植物蛋白原料，既可使原料中大分子的蛋白降 解為小肽，消除原料中的胰蛋白酶抑制因子、脹氣因子等對健康不利 的成分，使產品更有利於消化吸收。同時，發酵產物中含多種有機酸、 酯類等風味物質和細菌素，分解原料中的異黃酮和酚類等生理活性物 質。利用本發酵劑所得的富含益生菌的植物蛋白多肽可用於人類保健和營養滋補品，各種家畜日糧，魚蝦日糧或其它養殖動物日糧。本發 明發酵劑中添加酶的種類和數量，可根據生產中所發酵的植物蛋白原 料的營養成分的不同而進行調節。
權利要求
1、一種用於發酵植物源蛋白製造活性肽的益生菌發酵劑製備方法，包括以下步驟1)、菌種活化所採用的菌株為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LP8，將保藏的菌種接入MRS培養基斜面，37℃培養至出現菌落，然後再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落後重複以上操作，連續轉接3次，即得活化菌種；2)、種子培養將步驟1)中所得到的乳酸菌活化菌種，接種於乳酸菌三角瓶液體培養基(w/v)中，於37℃培養18-20小時，得到乳酸菌發酵種子；3)、發酵罐培養將培養好的種子以5％的接種量接種到發酵培養基中，於35-38℃培養24-48小時，攪拌速度為150-200r/min，通風量為1vvm，待pH值下降到5.0左右時，停止發酵；4)、濃縮將上述培養物經轉速4000-5000r/min、離心濃縮20-30min，得到活性植物乳桿菌的濃縮物；5)、乾燥添加20％的含1.5％甘油+10％脫脂乳的水溶液做保護劑，與菌體沉澱物均勻混合製成懸浮液，將菌懸液置於-40℃的冰箱中冷凍3-5小時後，取出放入冷凍乾燥機中，調冷阱溫度至-59℃，乾燥24-36小時後取出，得到含活性益生菌數為1011CFU/g左右的菌粉；6)混合將步驟5)得到的益生菌菌粉，與植物蛋白原料的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶中的一種或幾種相混合，製成含活性菌1010CFU/g，酸性蛋白酶含量10-50％，中性蛋白酶10-20％，纖維素酶5-10％、β-葡聚糖酶10-20％的發酵劑。
2、 根據權利要求1所述的一種用於發酵植物源蛋白製造活性肽的 益生菌發酵劑製備方法，其特徵在於所述的步驟l)中的MRS培養基組成為蛋白腖10g/L;酵母提取物5g/L;檸檬酸二銨2 g/L;葡萄糖20 g/L;牛肉膏10 g/L;吐溫80 1 mL/L; K2HP042 g/L; MgS04 '71120 0.58 g/L; MnS04 4H20 0.25 g/L，瓊脂15—20g/L， pH 6.2—6.5， 121t:滅菌i5分鐘。
3、 根據權利要求1所述的一種用於發酵植物源蛋白製造活性肽的 益生菌發酵劑製備方法，其特徵在於所述的步驟2)上述所用的培養基組成為(W/V):大豆蛋白腖10g/L;乳糖5g/L;牛肉膏5g/L;酵母膏3g/L; NaC14g/L;溴甲酚紫3g/L;吐溫一80 lmL; L-HC1半 胱氨酸lg/L; pH值7.0， 121'C滅菌15分鐘。
4、 根據權利要求1所述的一種用於發酵植物源蛋白製造活性肽的 益生菌發酵劑製備方法，其特徵在於所述的步驟6)中的植物蛋白 原料包括大豆餅粕、花生餅粕、芝麻餅粕、菜籽餅粕、向日葵餅粕、 玉米蛋白粉及小麥蛋白粉及其相應蛋白中的一種或幾種。
5、 根據權利要求1所述的一種用於發酵植物源蛋白製造活性肽的 益生菌發酵劑製備方法，其特徵在於所述的步驟6)中的發酵劑是得到的益生菌菌粉，與酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶，3—葡聚糖酶，按重量比10:50:25:10:5相混合，製成發酵劑。
6、 根據權利要求1所述的一種用於發酵植物源蛋白製造活性肽的 益生菌發酵劑製備方法，其特徵在於所述的步驟6)中的發酵劑是 得到的益生菌粉與酸性蛋白酶、e—葡聚糖酶按重量比10:80:10相混 合，製成發酵劑。
全文摘要
一種用於植物源蛋白的益生菌發酵劑的製備方法，屬於生物發酵技術領域，本發明的工藝步驟為菌種篩選、活化、培養、離心濃縮、乾燥和與酶復配，製成含活性益生菌和酶的複合發酵劑。採用本發酵劑發酵植物蛋白原料，可使原料中大分子的蛋白降解為小肽，發酵產品的益生菌活菌數達108CFU/g，粗蛋白含量增加3％-5％，蛋白質水解度達到12％-15％，pH值降低到3.8-4.0，乳酸含量5％-6％。發酵產品可用於人類保健和營養滋補品，各種家畜日糧，魚蝦日糧或其它養殖動物日糧等。
文檔編號C12N9/42GK101240255SQ20081001982
公開日2008年8月13日 申請日期2008年3月18日 優先權日2008年3月18日
發明者李春陽, 徵 閆, 陳玉良 申請人:江蘇雲海辰龍生物科技有限公司;江蘇省農業科學院農產品加工研究所