用於測量dna聚合作用的方法及其應用的製作方法

2023-04-24 08:54:51

專利名稱：用於測量dna聚合作用的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於測量DNA聚合作用的方法及其應用。更準確地講，本發明涉及一種用於測量依賴DNA的DNA聚合作用的方法。
背景近幾十年來用於測量逆轉錄即依賴RNA的DNA聚合作用的新方法已經歷了快速演變。迄今為止，關於定量測定依賴DNA的DNA聚合作用的更複雜問題，受到的關注卻少得多。
經典DNA聚合酶活性測定涉及用DNA酶處理的DNA(「活化DNA」)作為引物/模板並將放射性標記核苷酸摻入到DNA中(Aposhian和Kornberg，1962)。對酸可沉澱的放射性的測量使得可以計算出所摻入的核苷酸量和存在的酶單位數。然而，放射性的應用目前在許多實驗室受到限制並感到悲觀，這是由於擺脫基於放射性的技術的總傾向而造成的。
對於DNA聚合酶，一種基於ELISA來檢測摻入到新製備的DNA的毛地黃毒苷標記核苷酸的商業測定是可利用的(Roche MolecularBiochemicals Cat.no 1468120，US5635350)。該測定由於要使用兩種不同的具有大基團的核苷酸底物類似物-作為標記的毛地黃毒苷和用於產物固定化的生物素而受到阻礙。結果，聚合反應速度和後續檢測靈敏度均降低。高度偏離動力學特性的底物類似物的應用使該系統與對不同聚合酶藥物敏感性研究的相關性降低。
另一個更有吸引力的替代方法是DNA聚合酶全酶的基於螢光的測定，該測定基於染料PicoGreen與雙鏈DNA的特異性反應(Seville等，1996)。後一方法最近已加以改進，使其適合於範圍更寬的不同DNA聚合酶(Tveit和Kristensen，2001)。該測定技術上簡單並且基於天然核苷酸的應用。然而，檢測靈敏度仍在與經典放射性DNA聚合酶測定的靈敏度相同的範圍內，並且已描述的應用證明，檢測範圍為0.05-0.5 U DNA聚合酶/樣品。
當前的HIV療法基於多藥療法。治療方案基於所有三種可利用藥物-核苷類似物、非核苷類似物和蛋白酶抑制劑的組合。該策略是將突變病毒存活的概率減至最小。
逆轉錄酶(RT)抑制劑或者是核苷類似物，或者是非核苷類似物。所述非核苷抑制劑與RT酶中活性部位附近但並不與其相鄰的疏水性口袋結合。HIV-1複製由於取代了與聚合酶結合部位相關的催化性天冬氨酸殘基而在變構水平上受到抑制。
當前所用的核苷抑制劑由於其缺乏3』-羥基而終止DNA鏈的延伸。用核苷抑制劑的長期療法通常導致產生抗性病毒。該方法與病毒pol基因中不斷出現的突變相關，每一突變都導致已確定胺基酸的取代(有關綜述參見Vandamme等，1998)。這些取代在酶水平上的作用是複雜的並且包括增強原始DNA的編輯功能。該反應是核苷酸依賴性的並且產生多磷酸二核苷和可延伸的DNA 3』端(Arion等1998，Meyer等1999)。
所述HIV-1 RT以及其它逆轉錄酶進行三種不同的酶促反應依賴RNA的DNA聚合作用、依賴DNA的DNA聚合作用和DNA-RNA雜合體中RNA的降解(RNA酶H)。由pol基因編碼的HIV逆轉錄酶是一種由一個p66亞基和一個p51亞基組成的異二聚體。依賴RNA的DNA聚合作用和依賴DNA的DNA聚合作用均通過位於所述p66亞基的同一活性部位進行(有關綜述參見Goff等，1990)。這些藥物的反應機制主要根據其對依賴RNA的DNA聚合作用的作用來確定。對依賴DNA的DNA聚合作用的作用研究得比較少。
假如反應機制和有效代謝藥物是已知和可利用的，則病毒藥物的表型敏感性可以在酶水平上進行確定。依靠酶測定的能力和所用的病毒分離技術，藥物敏感性測試在理論上可以用來自病毒培養繁殖的上清液、原代病毒分離物或者直接從患者中回收的病毒製備物來進行。常規RT活性測定是通過利用人工模板-引物的構建和標記脫氧核苷三磷酸作為核苷酸底物來進行的。所述模板/引物對poly(rA)/oligo(dT)是用於測定HIV以及其它逆轉錄病毒RT的最有效最常用的組合。當涉及藥物敏感性測試時該測定類型的一個缺點是僅可測試非核苷類似物或可以與rA鹼基配對的類似物。其它核苷酸鹼基的類似物將需要基於可變聚合物模板的測定。含有嘧啶鹼基的RNA聚合物對RNA酶敏感是眾所周知的，因而實際上不適合於生物樣品。因此，最好是以對可變DNA模板計劃用於藥物敏感性測試的聚合酶測定為根據，前提是所述測定系統得到的結果與抑制逆轉錄和藥物經典表型抗性試驗的那些結果有關。
當前所用的HIV療法是DNA聚合酶抑制劑效力的唯一實例。目前的情況是，涉及細菌和其它微生物中的抗性產生推動對新類別的抗微生物藥物的研究。DNA聚合酶是該項研究工作中的主要目標之一。因此，十分需要技術上簡單的聚合酶測定，而不引起潛在環境危險並且可以適用於針對各種各樣微生物DNA聚合酶同工酶的藥物篩選。藥物的毒性導致發現必須對相應的哺乳動物DNA聚合酶進行進一步評價。
可以用增殖相關聚合酶例如聚合酶-α和聚合酶-δ的定量測定來監測細胞增殖。在正文中可列舉目前用胸苷激酶-另一種細胞增殖相關酶的血清水平對惡性疾病進行預後和分類(US4637977)。胸苷的磷酸化正是為DNA合成提供胸苷三磷酸的兩種胞內合成途徑之一。與胸苷激酶活性或胸苷摻入相比，對DNA聚合酶本身的測量可能得到對總DNA合成給出更準確的估計。
發明的描述本發明提供一種微量滴定板形式的非放射性DNA聚合酶測定，使得能夠進行產物的比色或螢光檢測。
在一個優選的實施方案中，本發明利用作為核苷三磷酸底物的5-溴脫氧尿苷5』-三磷酸(BrdUTP)。BrdUTP中5』位溴和胸苷三磷酸中5』位甲基之間的範德華半徑的差異最小(1.95A和2.0A相近)，並且這兩種核苷酸的酶動力學特性十分相似。所述方法可以芳構化並且其檢測範圍低至3nU聚合酶活性/樣品。
本發明的應用之一是藥物敏感性測試。迄今所批准的所有抗逆轉錄病毒藥物都幹擾病毒蛋白酶或RT的酶促反應。另外在計劃中還有影響逆轉錄病毒整合酶功能的候選藥物。
具體地說，本發明提供一種測定各種各樣不同的依賴DNA的DNA聚合酶的方法。儘管所用的模板比較短，但是已證明甚至對於研究高度加工的DNA聚合酶系統也是適合的。證明了測定細菌聚合酶I和III的活性、哺乳動物DNA聚合酶α、β和γ的活性、人血清中增殖相關聚合酶活性和HIV RT的依賴DNA的DNA聚合作用反應的有效性，但所述方法可以用於研究基本上所有病毒和細胞的DNA聚合酶。其特徵之一是本發明的DNA聚合酶測定與現有技術的區別在於其突出的靈敏度，使檢測出低至3nU大腸桿菌DNA聚合酶I活性成為可能。
因此，本發明的一方面涉及一種用於測量生物樣品中依賴DNA的DNA聚合作用的方法，所述方法包括下述步驟a)提供一種與固相結合的引物，所述引物具有單鏈特異性短序列且不能進行內部鹼基配對，b)使所述引物構建體與含有其序列的一部分與所述引物互補的單鏈脫氧核苷酸模板和四種脫氧核苷三磷酸的反應混合物接觸，其中一種脫氧核苷三磷酸經修飾致使其為標記抗體所特異性識別，c)向b)的混合物中加入包含所述DNA聚合酶的生物樣品，d)讓所述聚合酶反應進行，e)將由d)產生的固定化反應產物與所述標記抗體一起溫育，f)藉助所用的標記檢測結合的標記抗體的量，和
g)藉助所述結合抗體的標記測量摻入的修飾脫氧核苷酸的量，作為所述DNA聚合作用的測量結果。
在一個實施方案中，通過逆轉錄病毒逆轉錄酶(RT)例如人免疫缺陷病毒(HIV)RT，進行所述DNA聚合反應。
在另一個實施方案中，所述經修飾的脫氧核苷三磷酸是5-溴脫氧尿苷5』-三磷酸(BrdUTP)，而所述標記抗體是鹼性磷酸酶(Ap)綴合的抗BrdU單克隆抗體。
在依照本發明方法的一個優選實施方案中，將所測量的DNA聚合作用用於藥物敏感性測試。
進行所述藥物敏感性測試以評價某一藥物在哺乳動物個體中是否有效，並且可以用測試結果來選擇該個體的藥物療法。實際上，對所述個體在數個時間點進行測試，以監控所述個體中藥物治療的發展。
本發明也涉及一種商業成套試劑(package)，所述商業成套試劑包括按照本發明用於測量依賴DNA的DNA聚合作用的書面說明和/或數據載體說明。所述成套試劑至少包括下列成分a)一種與固相結合的引物，所述引物具有單鏈特異性短序列且不能進行內部鹼基配對，b)一種單鏈脫氧核苷酸模板，所述模板具有與a)中的引物互補的序列的一部分，c)四種脫氧核苷三磷酸，其中一種脫氧核苷三磷酸經修飾致使其為標記抗體所特異性識別，和d)標記抗體，所述標記抗體識別c)中的修飾脫氧核苷三磷酸。
現在，通過下面非限制性描述本發明的實施方案和附圖，舉例說明本發明。
所引用文獻的公開內容通過引用結合到本文中。
附圖簡述

圖1證明模板序列的變異對DNA聚合酶III被TMAU抑制的影響。
圖2舉例說明DNA聚合酶測定的檢測靈敏度。HIV-1野生型RT(◆)，哺乳動物DNA聚合酶β(●)和大腸桿菌DNA聚合酶I(▲)。
圖3證明所述DNA聚合酶測定測量所述雙脫氧類似物抑制所有四種DNA鹼基的能力。符號說明ddATP(■)，ddGTP(◆)，ddCTP(●)和ddTTP(▲)。
圖4顯示作為對抗病毒藥替諾福韋的抗性基礎的生化機制基於增強依賴ATP的磷酸解反應。符號說明標準反應溶液中的HIV-1野生型RT(○)。含有ATP的反應溶液中的HIV-1野生型RT(●)，標準反應溶液中的HIV-1突變型RT(◇)，含有ATP的反應溶液中的HIV-1突變型RT(◆)。
圖5舉例說明用從HIV感染個體血漿中分離的RT測定對抗病毒藥奈韋拉平的敏感性。符號說明(□)、(■)和(▲)來自感染個體的RT，(●)由重組HIV-1野生型RT組成的對照，(◆)具有中等奈韋拉平抗性的由突變型(L100I)重組HIV-1 RT組成的對照。
實施方案的描述引物包被的微量滴定板的產生將1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)羧二醯亞胺鹽酸鹽(終濃度10mg/ml)加入到100mM 1-甲基咪唑緩衝液(pH7.0)中，並用所述混合物稀釋所述引物構建體至終濃度為1μg/ml。將100μl該引物緩衝液等分至由Nalge Nunc NucleoLink透明紙條(Cat no 248259)組成的微量滴定板的各孔中。將該板於37℃溫育6-8小時，用含有2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的2M NaOH溶液充分洗滌，然後浸泡在三個裝有水的5L管形瓶中。通過使板正面朝下放在吸水布或吸水紙上，除去各孔中的殘留液體。讓板在室溫下乾燥30分鐘，最後於-20℃冷凍貯存。
DNA-聚合酶測定的方案所述DNA-聚合酶測定基於一種具有與96孔微量滴定板各孔共價結合的特異性序列的短引物。所述反應混合物含有其序列的一部分與所述引物互補的單鏈脫氧核苷酸模板和四種脫氧核苷三磷酸。然而，胸苷三磷酸被5-溴脫氧尿苷5』-三磷酸(BrdUTP)取代。在所述聚合酶反應期間摻入到DNA中的溴脫氧尿苷一磷酸(BrdUMP)的量用鹼性磷酸酶(Ap)綴合的抗BrdU單克隆抗體進行檢測。用Ap底物4-甲基傘形基磷酸酯進行螢光產物檢測。
向引物包被的微量滴定板的各孔中加入100μl DNA聚合酶反應混合物。樣品用DNA聚合酶鹼性緩衝液稀釋，通過將50μl樣品稀釋液轉移到板的各孔中，起始聚合酶反應。將微量滴定板於33℃溫育規定時間後，通過用含有1.5％(v/v)辛基苯氧基聚乙氧乙醇(TritonX-100)的3mM硼酸鹽緩衝液(pH8.9)洗滌該板，而終止反應。通常溫育2次即4小時和過夜(16小時)，以檢查聚合反應的線性化程度。該板用含有2mM EDTA的2M NaOH溶液充分洗滌，然後浸泡在三個裝有水的5L管形瓶中。
接著，將該板與以下組分於33℃溫育90分鐘100μl鹼性磷酸酶(Ap)綴合的抗BrdU單克隆抗體(用含有50mM NaCl的25mM(雙[2-羥乙基]亞氨基三[羥甲基]甲烷、2-雙[2-羥乙基]氨基-2-[羥甲基]-1，3-丙二醇)(Bis Tris)緩衝液(pH7.2)稀釋至4.8μg/ml)、37.5mM(NH4)2SO4、1mg/ml硫酸葡聚糖、1％Triton X-100和25mg/ml Sigma脫脂奶粉。
此後，該板再次用含有1.5％(v/v)Triton X-100的3mM硼酸鹽緩衝液(pH8.9)洗滌，以除去未結合的標記抗體。用溶於Tris緩衝液(pH8.9)中的4-甲基傘形基磷酸酯底物測定所述鹼性磷酸酶活性。用Wallac Victor 2讀出儀，在規定間隔讀出460nm的螢光(激發波長355nm)。
抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案在改進的DNA聚合酶測定中進行所述抑制研究。所述藥物分5個步驟進行連續稀釋，且將25μl等份樣品轉移至微量滴定板的各孔中，與100μl DNA聚合酶反應混合物混合，通過加入25μl酶稀釋液起始酶反應。在標準反應條件下對非核苷類似物進行研究，而在dNTP競爭性抑制劑的研究中，將所有四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)的濃度降至1μM。讓所述聚合酶反應進行過夜(16-24小時，33℃)。此後，通過洗滌所述板終止反應。將IC50值定義為所研究的聚合酶活性達到50％抑制的藥物濃度。
RT活性的測定方案用改進的比色RT測定(CavidiLenti RT活性試劑盒)(可得自Cavidi Tech，Uppsala，瑞典)，測定在所研究的病毒製劑中的RT活性水平。所述方法已有描述(Ekstrand等，1996)。簡而言之，用與96孔微量滴定板各孔共價結合的poly(rA)作為模板，從而在逆轉錄步驟中於33℃摻入5-溴脫氧尿苷5』-三磷酸(BrdUTP)。用鹼性磷酸酶(Ap)綴合的抗BrdU單克隆抗體檢測摻入到DNA中的溴脫氧尿苷一磷酸(BrdUMP)的量。最後，用Ap底物4-甲基傘形基磷酸酯進行螢光檢測。
抑制逆轉錄的測定方案在改進的Cavidi HS-kit Lenti RT測定中進行所述抑制研究。所述抑制劑分5個步驟進行連續稀釋，然後將25μl等份樣品轉移至微量滴定板的各孔中，與100μl RT反應混合物混合，通過加入50μl酶稀釋液起始酶反應。所述核苷三磷酸底物(BrdUTP)的終濃度為16μM，而引物(odT22)的含量為12ng/孔。讓所述RT反應進行過夜(16-24小時，33℃)。此後，通過洗滌所述板而終止反應。將IC50值定義為所研究的RT活性達到50％抑制的藥物濃度。基於可溶性細胞酶破壞後從微型柱中分離病毒RT而從含有RT封閉性抗體的材料中分離病毒RT的方案1)標記要使用的4.5ml塑料管。將其置於Nalgene盒中。向每支標記管中加入1ml樣品(例如來自HIV感染個體的EDTA血漿)。加入100μl 66mM 5，5』-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)的緩衝水溶液，渦旋混合，將所述樣品在室溫下溫育1小時。
游離的血漿酶活性在該步驟中遭到破壞，而病毒體內所含的酶則仍保持完整。然後可以通過幾個分離步驟，從5，5』-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)、酶活性封閉性抗體和其它可能干擾病毒RT定量的物質中純化所述病毒體。下述方案基於FractogelEMD TMAE Hicap凝膠的應用。
2)小心地懸浮分離膠，並轉移1500μl凝膠漿至每支樣品預處理管中。
3)將樣品與凝膠漿在室溫下溫育90分鐘，其中將所述管以水平方向放在定軌搖床上。
4)標記所需數目的10ml塑料微型柱，以識別要分析的樣品。將該柱固定在柱洗滌裝置即Supelco Visiprep固相抽真空歧管上。轉移結合管中的內容物至其相應的柱中。轉移前，將管渦旋一會兒，以使凝膠均勻分布。
5)當所有的柱都填滿時，抽真空並將凝膠吸乾。關掉真空，並通過將每個柱裝入9ml緩衝液A開始洗滌。當所有的柱已裝滿時，抽真空並將凝膠吸乾。
6)重複步驟5三次以上，總共洗滌4次。每次洗滌後都將凝膠吸乾。在第4次洗滌後且將凝膠吸乾後，關掉真空，進行步驟7。
所述洗滌步驟除去系統中未結合的RT封閉性抗體和5，5』-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)。
7)向所有幹凝膠中加入9ml調節緩衝液(B)。1分鐘後，抽真空並將凝膠吸乾。
8)重複步驟7，在關掉真空之前，檢查是否已從所有凝膠中除去所有調節緩衝液(B)。
9)卸下柱洗滌裝置的上層部分。將裝有標記管的管固定器固定在清潔的容器中。重新裝上該裝置的上層部分。控制各柱的小管落入其相應管中。
10)向每個柱中加入600μl裂解緩衝液(C)。讓所述緩衝液在所述柱中停留5分鐘。然後緩慢抽真空並將凝膠吸乾。這將在每支管中得到來自相關凝膠的約600μl病毒裂解液。
從步驟10的裂解液中回收的RT活性基本上無RT封閉性抗體、藥物和細胞聚合酶活性，並且可以用靈敏的RT活性測定，即基於Ekstrand等人描述的方法的Cavidi HS-kit Lenti RT[7]進行定量。按照所述方法獲得的25μl裂解液足以測定所述樣品中的RT活性。餘下的575μl樣品應於-70℃或-70℃以下冷凍貯存，以供以後用於藥物敏感性試驗。
請注意對半胱氨酸修飾劑不敏感的RT酶例如野生型HIV 1 RT可以任選地在存在高達5mM 5，5』-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)的情況下進行測定。另一方面，敏感酶例如MULV RT和來自某些療法的HIV1抗性株(含有例如突變Y181C)的RT要求向所述裂解緩衝液中加入巰基還原劑即半胱氨酸或半胱胺。
材料用於DNA聚合酶測定的引物/模板引物序列是18個鹼基的5』-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3』(SEQ ID NO12)且在5』端通過C6間隔臂與伯胺連接。
模板構建體含有三個不同的功能部分。從5』端起一種(A)n聚合物，用於擴增BrdU信號；一個可變部分(GTCA)m，以獲得依賴於四種脫氧核苷三磷酸的聚合酶反應；和一個與所述引物互補的序列。
在本實驗中，實施例中包括n＝12且m＝5，除非另有說明。
核苷、酶抑制劑和抗病毒藥物ddATP，2』3』雙脫氧腺苷三磷酸；ddGTP，2』3』雙脫氧鳥苷三磷酸；ddCTP，2』3』雙脫氧胞苷三磷酸；ddTTP，2』3』雙脫氧胸苷三磷酸。TMAU，6-([3，4-亞丙基]苯胺基)尿嘧啶。
替諾福韋，(R)-9-(2-膦醯甲氧基-丙基)腺嘌呤；奈韋拉平，(11-環丙基-5，11-二氫-4-甲基-6H-二吡啶並[3，2-b2』，3』-f]二氮雜-6-酮)(NVP)；和依法韋侖，(-)6-氯-4-環丙基乙炔基-4-三氟甲基-1，4-二氫-2H-3，1-苯並噁嗪-2-酮)(EFV)。
酶DNA聚合酶I(大腸桿菌)購自Amersham Bioscience。來自金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)的重組DNA聚合酶III如已描述的方法(Brown等，1998)生產。哺乳動物DNA聚合酶α(小牛胸腺)和β(人)購自CHIMERx(Milwaukee)。DNA聚合酶γ如已描述的方法(Pileur等，2000)從牛心中純化。
產生NNRTI抗性突變形式的HIV-1 RT(L100I，K103N，L100I/K103N，Y181C)。用從BH10分離株構建的pETRT表達載體作為突變模板。用市售定點誘變試劑盒QuikChange(Stratagene)產生各種突變。所述突變通過DNA序列分析加以證實。突變形式和天然形式的RT如先前描述的方法(Lindberg等，2000)進行分離。
產生重組HIV-1 RT的方法與AZT特定突變的方法是相似的，只是將突變引入HXB2-D分離株的RT編碼區中。
來自HIV感染個體的血漿樣品追溯既往地選出來自治療原初患者的血漿樣品或用常規聯合療法治療的患者的血漿樣品。通過標準HIV 1 RNA PCR(Cobas，RocheDiagnostica)，測量各樣品中的HIV-1 RNA含量。罹患淋巴組織增生性疾病的患者血清樣品得自the Department of Internal Medicine，Uppsala University，Akademiska sjukhuset，Uppsala。
分離膠例如FractogelEMD TMAE或FractogelEMD TMAEHicap，在314mM(2-(N-嗎啉代)乙磺酸)(MES)pH5.1、413mM碘化鉀和0.5mg/ml肝素溶液中。
微型柱，例如Biorad Poly-Prep(7311553)微型柱洗滌裝置，即Supelco Visiprep固相抽真空歧管。
塑料管，例如Nunc 4.5ml低溫管。
具有固定化prA的微量滴定板，即Nalge Nunc NucleoLinck。
半胱氨酸修飾劑，例如用0.87M三羥甲基氨基甲烷(pH8.3)緩衝的66mM 5，5』-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)水溶液。
溫和巰基還原劑，例如33mM半胱胺水溶液。
所用的緩衝液A)洗滌緩衝液20mM MES pH5.4，500mM醋酸鉀(KAc)B)調節緩衝液適合於RT測定的緩衝液，例如50mM(N-(2-羥乙基哌嗪-N』-(2-乙磺酸))(Hepes)pH7.6，25mM KAc，20mM氯化鎂(MgCl2)，0.2mM乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N』，N』-四乙酸(EGTA)，2mM精胺和0.5mg/ml熱滅活牛血清白蛋白(BSA)。
C)裂解緩衝液適合於RT測定的緩衝液，包含去汙劑如1.25％聚氧乙烯4十二烷基醚(Brij 30)，13ng/ml odT22和與調節緩衝液(B)中組分相同的組分。巰基還原劑，即當用對SH氧化/修飾敏感的RT加工病毒時任選加入0.2mM半胱胺。
RT反應混合物11.7mM(N-(2-羥乙基哌嗪-N』-(2-乙磺酸))(Hepes)pH7.6，28.3μM BrdUTP，120ng/ml odT22，4mM MgCl2，0.05g/l硫酸葡聚糖，2mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM乙二醇-雙(β-氨基乙醚)N，N，N』，N』-四乙酸(EGTA)和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
DNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶鹼性緩衝液50mM Hepes pH8.0，8mM MgCl2，，1.5μg/l硫酸葡聚糖，1mM精胺，0.5％(v/v)Triton-X 100，0.2mM EGTA，1.5mM二硫蘇糖醇(DTT)和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
DNA聚合酶III鹼性緩衝液40mM (2-(N-嗎啉代)乙磺酸)(MES)pH6.8、40mM醋酸鉀(KAc)，10mM MgCl2，2mM精胺，0.5％(v/v)聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(Tween 20)，0.1mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇和50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)。
DNA聚合酶β鹼性緩衝液20mM 3-[(1，1-二甲基-2-羥乙基)氨基]-2-羥基-1-丙磺酸(AMPSO)pH8.3，1mM MgCl2，3mM亞精胺，1μg/ml BSA，10μM EDTA，0.1mM DTT，0.01％Tween 20。
DNA聚合酶反應混合物。補充的24μM BrdUTP，49.5μMdGTP、49.5μM dATP、49.5μM dCTP和500ng模板/ml的DNA聚合酶鹼性緩衝液。
含有ATP的逆轉錄DNA聚合酶反應混合物。所述DNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶的反應混合物補充3.2mM ATP且將pH調至7.1。
實施例實施例1.利用不同的模板通過HIVRT進行第二鏈合成按照「引物包被的微量滴定板的產生」，具有固定化引物的微量滴定板各孔中包含始於200ng/ml的指定模板構建體的兩步稀釋系列。向各孔中加入100fg重組HIV 1 RT，且所述RT反應的持續時間為18小時。按照「DNA-聚合酶測定的方案」，使用DNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶鹼性緩衝液，測定各模板的聚合酶活性。在抗BrdU單克隆抗體結合期間使用50mM NaCl或者使用100mMNaCl。將所獲得的活性對模板濃度作圖，根據各圖平穩段的值，計算出各模板類型所達到的最大信號。
結果概述於表1中。發現A-尾的長度和所述聚合酶測定中可獲得的最大信號之間存在明確的相關性。A-尾的長度在離子強度增加的情況下的確影響產物檢測所用的抗體結合的能力。
實施例2.模板序列對用TMAU抑制DNA聚合酶III的影響6-苯胺基尿嘧啶是來自革蘭氏陽性菌的DNA聚合酶III選擇性抑制劑。所述苯胺基尿嘧啶分子通過將其螯合成無活性DNA-藥物-蛋白複合物而抑制其聚合酶III靶(Tarantino等，1990)。所述藥物TMAU可以被認為是GTP的類似物。按照「抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案」，用或者(CTGA)6-A12(SEQ ID NO10)(■)或者(CTG)6-A3(SEQ ID NO11)(▲)作為模板，測定指定濃度的TMAU對1.25ng/孔重組DNA聚合酶III的抑制能力。該聚合酶反應時間為1小時，並將所述DNA聚合酶III反應混合物中的GTP濃度降至2.5M。將指定模板上所獲得的聚合酶活性換算成在沒有抑制劑的情況下與同一聚合酶一起溫育所獲得活性的百分比(％)。
結果示於圖1。這種高特異性抑制劑根據所用的模板序列而表現出不同的抑制能力。本發明提供的一個容易改變所用DNA模板的系統，以計算出所研究的酶或抑制劑所需的特異性條件。
實施例3.DNA聚合酶測定的檢測靈敏度按照「DNA-聚合酶測定的方案」，利用最適於指定酶的鹼性緩衝液，測量連續稀釋的HIV 1野生型RT(◆)、哺乳動物DNA聚合酶β(●)和大腸桿菌DNA聚合酶I(▲)的活性。所用的聚合酶反應時間為過夜(18小時)。結果示於圖2。這三種酶製劑中的每種在所用的酶量和所回收的產物量之間都表現出線性關係。所述測定的本底為3800rfu/小時。用雙本底作為明顯信號檢測的截止值，有可能檢測出低至10nU HIV 1野生型RT、6nU哺乳動物DNA聚合酶β和3nU大腸桿菌DNA聚合酶I。
實施例4. 5種DNA聚合酶在不同的測定系統中的活性按照「DNA-聚合酶測定的方案」和「RT活性的測定方案」，使用基於指定聚合酶鹼性緩衝液的反應溶液，測量連續稀釋的DNA聚合酶α、DNA聚合酶β、DNA聚合酶γ、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)患者血清和HIV-1 RT的活性。所用的聚合酶反應時間為2小時。將所獲得的活性換算成每種酶在最適反應條件下於可變DNA模板上的活性的百分比(％)。結果示於表2。所研究的五種酶製劑中的每種對與最適反應條件有其獨特的偏愛。然而，DNA聚合酶α和人血清聚合酶均表現出相似的模式。僅HIV-1 RT和DNA聚合酶γ在所述逆轉錄酶測定中得到顯著性活性。
實施例5.證明DNA聚合酶測定測量雙脫氧類似物抑制所有四種DNA鹼基的能力按照「抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案」，測定指定濃度的ddATP(■)、ddGTP(◆)、ddCTP(●)和ddTTP(▲)對80fg重組野生型HIV 1 RT活性的抑制能力。將在不同抑制劑濃度下的聚合酶活性換算成在沒有抑制劑的情況下對照活性的百分比(％)。結果示於圖3。
發現用模板(CTGA)6-A12(SEQ ID NO10)的聚合酶反應對雙脫氧類似物抑制所有四種DNA鹼基敏感。所獲得的IC50值在對於ddCTP為20nM至對於ddATP為80nM的範圍內變動。
實施例6.非核苷抑制劑對第一鏈和第二鏈DNA合成受HIV 1 RT的影響的比較分別按照「抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案」和「抑制逆轉錄的測定方案」，使用DNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶鹼性緩衝液，測定3種非核苷抑制劑對指定重組HIV 1 RT的影響。聚合反應的持續時間分別是對於在(CTGA)6-A12(SEQ ID NO10)上的第二鏈合成為19小時，而對於在prA上的第一鏈合成為2小時。將所獲得的RT活性換算成在沒有抑制劑的情況下與同一RT一起溫育所獲得的活性的百分比(％)。
結果概述於表3。兩個測定系統均具有鑑別抗性RT(Y181C，V179D)和敏感RT的能力。任何抑制劑的IC50值在這兩個測定系統的任一個中不因為所用酶量的5倍差異而被顯著影響。此外，通過測量對第一鏈或第二鏈DNA合成的抑制，所獲得的IC50值之間沒有顯著性差異。
實施例7.證明作為對抗病毒藥替諾福韋的抗性基礎的生化機制用核苷類似物長期治療HIV感染個體導致產生抗性病毒。該過程與不斷出現的病毒pol基因突變相關。這些取代在酶水平上的影響是複雜的並且包括增強原始DNA的編輯功能。該反應是核苷酸依賴性的並且產生二核苷多磷酸和可延伸的DNA 3』端。
按照「抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案」，使用基於DNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶鹼性緩衝液的標準反應溶液和補充ATP的相同反應溶液，測定連續稀釋的三磷酸替諾福韋對4pg/孔指定重組HIV 1 RT的影響。聚合反應的持續時間為19小時。將所獲得的RT活性換算成在沒有抑制劑的情況下溫育的同一RT活性的百分比(％)。圖4顯示所得結果。
符號說明標準DNA聚合酶反應溶液中的HIV-1野生型RT(○)。含有ATP的DNA聚合酶反應溶液中的HIV-1野生型RT(●)，標準DNA聚合酶反應溶液中的T69S→SS/L210W/T215Y HIV-1突變型RT(◇)，含有ATP的DNA聚合酶反應溶液中的T69S→SS/L210W/T215Y HIV-1突變型RT(◆)。
圖4所示的結果證明，當使用能夠支持ATP依賴性磷酸解反應的反應溶液時，野生型RT和突變型RT之間的藥物敏感性差異大約增加10倍。
實施例8.用血漿源性RT測定對奈韋拉平的敏感性按照「基於可溶性細胞酶破壞後從微型柱中分離病毒RT而從含有RT封閉性抗體的材料中分離病毒RT的方案」，處理來自瑞典斯德哥爾摩(Stockholm，Sweden)的3位HIV感染個體的血漿樣品各1ml。按照「抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案」，使用「DNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶鹼性緩衝液」，讓每種血漿RT和兩種對照酶對一組連續稀釋的奈韋拉平溶液進行滴定。參見圖5。
符號說明(□)患者1的RT，140000基因組拷貝/ml；(■)患者2的RT，180000基因組拷貝/ml；(▲)患者3的RT，390000基因組拷貝/ml；(●)由重組HIV-1野生型RT組成的對照；和(◆)具有中等奈韋拉平抗性的重組HIV-1突變型RT(L100I)組成的對照。
發現患者RT對奈韋拉平的IC50值的變動範圍為0.7-1.2μM。將對照野生型RT的0.5μM和具有中等奈韋拉平抗性的突變型RT(L100I)的＞10μM進行比較。
實施例9.淋巴組織增生性疾病患者血清中DNA聚合酶活性的檢測4位非霍奇金淋巴瘤患者血清和6位健康供血者血清用DNA聚合酶III鹼性緩衝液連續稀釋。按照「DNA-聚合酶測定的方案」，使用2小時和6小時的聚合酶反應時間，測量各稀釋步驟的聚合酶活性。
計算出所述稀釋範圍的DNA聚合酶活性/μl血清樣品和小時聚合酶測定，在該範圍內，在所形成的產物量和加入到所述測定中的血漿量之間存在線性關係(參見表4)。
非霍奇金淋巴瘤患者的每個血清樣品都含有不同量的DNA聚合酶活性，其特性與DNA聚合酶α相似(參見表3)。活性量的範圍為健康供血者中所獲得的平均值的約2-190倍。
表1.用不同的模板通過HIV RT進行第二鏈合成100mM NaCla最大信號*本底
(rfu/小時) (rfu/小時) 的信號(最大所用的模板 信號的％)SEQ ID NO(CTGA)5 89444162920SEQ ID NO1(CTGA)5-A 63694195825SEQ ID NO2(CTGA)5-AA 184421 613 33SEQ ID NO3(CTGA)5-AAAA239688 256544SEQ ID NO4(CTGA)5-A8 198894 154458SEQ ID NO5(CTGA)6 60627128522SEQ ID NO6(CTGA)6-AAA 835551009NDSEQ ID NO7(CTGA)6-A5 119326 914 NDSEQ ID NO8(CTGA)6-A9 202668 963 NDSEQ ID NO9(CTGA)6-A12 226062 726 NDSEQ ID NO10(CTG)6-A3 124334 814 NDSEQ ID NO11*具有固定化引物的微量滴定板各孔中包括從200ng/ml開始的兩步稀釋系列的指定模板。向各孔中加入100fg重組HIV 1 RT且RT反應的持續時間為18小時。在抗BrdU單克隆抗體結合期間使用50mM。將所獲得的活性對模板濃度作圖，並計算各模板所達到的最大信號。
aRT反應條件和計算與「最大信號」中的相同，但在抗體結合期間使用100mM NaCl。
表2. 4種哺乳動物DNA聚合酶和HIV RT在不同測定系統中的表觀活性DNA聚合酶同工酶在指定測定中的活性(％*)鹼性緩衝液 DNA polαDNA polβ DNA polγ 血清DNAp HIV RTPol III 100 170 1000DNA polβ 40100 5 3033DNA polγa1 131009 100prA/Lentib0 0 10 0 2175*用指定同工酶的最適鹼性緩衝液對可變DNA模板活性的百分比(％)
aDNA聚合酶γ和逆轉錄DNA聚合酶鹼性緩衝液。
b在RT測定中用prA/odT作為引物模板的活性。
表3.非核苷抑制劑對第一鏈和第二鏈DNA合成受HIV 1 RT的影響的比較RT酶模板的IC50(μm)*抑制劑 類型含量(fg)(CTGA)6-A12prA奈韋拉平wt100 2.02.2wt202.02.5Y181C 100 ＞500 200Y181C 20＞500 180V179D 100 8 7V179D 2012 8依法韋侖wt100 0.04 0.02wt200.03 0.02Y181C 100 0.12 0.15Y181C 200.14 0.13V179D 100 0.50.7V179D 200.40.6膦甲酸 wt100 0.50.7wt200.50.6*分別按照「抑制可變DNA模板上第二鏈合成的測定方案」和「抑制逆轉錄的測定方案」，測定3種非核苷抑制劑對指定重組HIV 1 RT的影響。聚合反應的持續時間分別是對於在(CTGA)6-A12(SEQ ID NO10)上進行第二鏈合成為19小時，而對於在prA上進行第一鏈合成為2小時。將所獲得的RT活性換算成在沒有抑制劑的情況下與同一RT一起溫育所獲得的活性的百分比(％)。
表4.淋巴組織增生性疾病患者血清中DNA聚合酶活性的檢測血清編號血清來源聚合酶活性(rfu/小時/μl血清/小時聚合酶反應)T1 NHL患者a158521T2 NHL患者 1305T3 NHL患者 3405T4 NHL患者 16619B1-B6 供血者 841±180a非霍奇金淋巴瘤患者。
*NS，無顯著性。
4位非霍奇金淋巴瘤患者血清和6位健康供血者血清用DNA聚合酶III鹼性緩衝液連續稀釋。按照「DNA-聚合酶測定的方案」，測量各稀釋步驟的聚合酶活性。根據稀釋範圍計算出列入表的DNA聚合酶活性，在該範圍內，在所形成的產物量和加入的血漿量之間存在線性關係。所有值都減去測定的本底854flu/h。
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序列表110Cavidi Tech AB120用於測量DNA聚合作用的方法及其應用130110063501140
141
150US 60/297,7731512001-06-1416012170PatentIn Ver.2.1210121120212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4001ctgactgact gactgactga 20210221121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4002ctgactgact gactgactga a 21210321122212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4003
ctgactgact gactgactga aa22210421124212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4004ctgactgact gactgactga aaaa 24210521128212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4005ctgactgact gactgactga aaaaaaaa 28210621124212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4006ctgactgact gactgactga ctga 24210721127212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4007ctgactgact gactgactga ctgaaaa 27
210821129212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4008ctgactgact gactgactga ctgaaaaaa 29210921133212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板4009ctgactgact gactgactga ctgaaaaaaa aaa332101021136212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板40010ctgactgact gactgactga ctgaaaaaaa aaaaaa 362101121121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述模板40011ctgctgctgc tgctgctgaa a 212101221118
212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物40012gtccctgttc cggcgcca 18
權利要求
1.一種用於測量生物樣品中依賴DNA的DNA聚合作用的方法，所述方法包括下述步驟a)提供一種與固相結合的引物，所述引物具有單鏈特異性短序列且不能進行內部鹼基配對，b)使所述引物構建體與含有其序列的一部分與所述引物互補的單鏈脫氧核苷酸模板和四種脫氧核苷三磷酸的反應混合物接觸，其中一種脫氧核苷三磷酸經修飾致使其為標記抗體所特異性識別，c)向b)的混合物中加入包含所述DNA聚合酶的生物樣品，d)讓所述聚合酶反應進行，e)將由d)產生的固定化反應產物與所述標記抗體一起溫育，f)藉助所用的標記檢測結合的標記抗體的量，和g)藉助所述結合抗體的標記測量摻入的修飾脫氧核苷三磷酸的量，作為所述DNA聚合作用的測量結果。
2.權利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶是逆轉錄病毒逆轉錄酶(RT)。
3.權利要求2的方法，其中所述逆轉錄病毒RT是人免疫缺陷病毒(HIV)RT。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述經修飾的脫氧核苷三磷酸是5-溴脫氧尿苷5』-三磷酸(BrdUTP)，而所述標記抗體是鹼性磷酸酶(Ap)綴合的抗BrU單克隆抗體。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中將所測量的DNA聚合作用用於藥物敏感性測試。
6.一種商業成套試劑，所述商業成套試劑包括依照權利要求1-4中任一項用於測量依賴DNA的DNA聚合作用的書面說明和/或數據載體說明，所述商業成套試劑包括下列組分a)一種與固相結合的引物，所述引物具有單鏈特異性短序列且不能進行內部鹼基配對，b)一種單鏈脫氧核苷酸模板，所述模板具有與a)中的引物互補的序列的一部分，c)四種脫氧核苷三磷酸，其中一種脫氧核苷三磷酸經修飾致使其為標記抗體所特異性識別，和d)標記抗體，所述標記抗體識別c)中的修飾脫氧核苷三磷酸。
全文摘要
描述了一種用於測量生物樣品中依賴DNA的DNA聚合作用的方法。所述方法包括下述步驟提供一種與固相結合的引物，所述引物具有單鏈特異性短序列且不能進行內部鹼基配對；使所述引物構建體與含有其序列的一部分與所述引物互補的單鏈脫氧核苷酸模板和四種脫氧核苷三磷酸的反應混合物接觸，其中一種脫氧核苷三磷酸經修飾致使其為標記抗體所特異性識別；向所述混合物中加入包含所述DNA聚合酶例如逆轉錄病毒逆轉錄酶(RT)的生物樣品；讓所述聚合酶反應進行；將所述固定化反應產物與所述標記抗體一起溫育；檢測結合標記抗體的量；並且測量摻入的修飾脫氧核苷三磷酸的量，作為所述DNA聚合作用的測量結果，可將其用於藥物敏感性測試。也公開了一種商業成套試劑。
文檔編號C12N15/09GK1541276SQ02815605
公開日2004年10月27日 申請日期2002年6月14日 優先權日2001年6月14日
發明者C·凱蘭德爾, I·彼得松, S·格羅諾維茨, 邵興無, C 凱蘭德爾, 夼滴 , 盟 申請人:卡維迪技術有限公司