一種產抗真菌蛋白菌株的篩選方法及應用的製作方法

2023-04-24 08:12:26 2

專利名稱：一種產抗真菌蛋白菌株的篩選方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株產抗真菌蛋白的菌株，命名為Aspergillus giganteus AF-11，已 於2010年11月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北 京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC NO. 4342。同時涉及獲得該菌的誘變篩 選方法和利用該菌株發酵抗真菌蛋白並在啤酒大麥制麥中的應用的方法，屬於微生物制麥 技術領域。
背景技術：
AFP(antifungal protein) Aspergillus giganteus 白勺/J、^>〒fiiJ^§M 白，可有效抑制絲狀真菌的生長，尤其是動植物致病真菌。近幾年的研究發現AFP對抑制 絲狀真菌具有安全、高效、廣譜、穩定的特點，而這些顯著的特點使其最有希望成為新的抗 真菌抗生素、安全的天然食品防腐劑、可靠的生物農藥和基因工程目的基因載體。1965年， Olson等從美國密西根州農場土壤中分離篩選得到的一株Aspergillus giganteus菌株並 發酵液中分離得到一種由51個胺基酸組成的小分子鹼性蛋白——AFP(抗真菌蛋白)，並證 明對絲狀真菌具有明顯的抑制作用。研究還發現AFP可高效抑制許多人類和動植物致病黴 菌，而對細菌和酵母菌無抑制作用，這種選擇性抑制作用在醫學和應用生物技術上引起了 人們的廣泛興趣和高度關注。2006年，kappanos等研究分析了 AFP對哺乳動物細胞功能 的影響，通過實驗發現AFP對哺乳動物細胞無細胞毒素效應和免疫反應，並認為AFP是具有 很好應用前景和開發研究價值的新的抗真菌抗生素。目前，啤酒大麥在制麥過程由於潮溼的環境容易汙染鐮刀黴、煙麴黴和根黴等真 菌。這些受汙染的麥芽不但影響釀造性能還影響食品安全，目前一般採用制麥過程中加入 石灰水來抑制菌的汙染，但是這樣也會帶來食品安全的隱患。利用微生物自身產生的抗真 菌蛋白來抑制汙染很少有報導，尤其是關於Aspergillus giganteus的研究更是幾乎沒有看到。

發明內容
本發明的目的是提供一株能廣譜抗真菌的高產AFP菌株及其篩選方法。同時利用 該菌株發酵生產AFP的方法在制麥過程中進行有害微生物控制。本發明的目的可以通過以 下措施達到1、土壤樣品取樣及前處理取鹼性土壤2g，用水浴、乙醇和蛋白腖處理。2、真菌培養在觀°C，篩選培養基(葡萄糖10g，NH4N03lg/L,酵母膏lg/L， K2HPO4O. 5g/L，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/L，孟加拉紅 0. 006g/L,鏈黴素 0. 003g/L,瓊脂 20g/L。)培 養4-5天後，挑選可以抑制其它黴菌生長的菌株。3、馴化誘變30°C條件下，將篩選的菌株YPD培養基上馴化培養4-5天，然後經 EMS誘變，挑選抑菌圈較大的菌株作為復篩菌株。4、搖瓶復篩搖瓶發酵，採用紙片法或者牛津杯法檢測發酵液菌株抑菌圈大小。5、選出抑菌能力最強的菌株，發酵生產AFP，用考馬斯亮藍比色法測定AFP含量。
6、將AFP用於啤酒大麥的制麥過程中，抑制菌的汙染。本發明取得以下優點和顯著進步1、得到了一株高產抗真菌蛋白的菌株，保藏號為CGMCC NO. 4342。2、將該菌株發酵生產AFP用於啤酒大麥的制麥過程中，抑制菌的汙染，減少了食 品加工過程中化學試劑石灰水的加入，用生物的手段更加安全環保的解決了制麥汙染問題。
具體實施例方式實施例1產抗真菌蛋白菌株的篩選l、1.5g 土樣加入IOml無菌生理鹽水，在60°C條件下，水浴30min2、去除無菌水，加入65%乙醇處理lOmin，加入0. 濃度的蛋白腖溶液處理 IOmin03、將0. Iml溶液接種到肌氨酸蔗糖培養基，25°C條件下，培養7天。4、挑選不同形態特徵的單菌落，轉接到MEA(蔗糖25g/L，硝酸鈉1. 5g/L，磷酸氫二 鉀0. 6g/L，氯化鉀0. 4g/L，硫酸鎂0. 3g/L，硫酸亞鐵0. 08g/L,瓊脂20g/L)斜面固體培養基 上。5、用10%甘油收集並保藏單菌落的孢子。6、分離的單菌落在MEA培養基pH4. 525°C條件下培養4天。7、打孔器挖取直徑25mm的菌苔，移至已滅菌的培養皿中，每皿三塊。8、MEA培養基冷卻至50°C，加入供試菌孢子1 X 106/ml，25°C，培養48h9、測量抑菌能力大小，將抑菌圈最大的Aspergillus giganteus AF-11接種保存。實施例2AFP發酵生產將AF-Il接種到斜面固體培養基上，28°C，培養4天，用無IOml菌水衝洗斜面，制 成孢子菌懸液用於種子培養。按10%接種量，將孢子菌懸液接種到種子培養液(葡萄糖 13g/L，蛋白腖3g/L，酵母浸膏3g/L，NaCl 5g/L)中，28°C，220rpm培養4天。按10%接種 量，將種子液接種到2L發酵培養中，30°C，220rpm培養，4天。陽離子交換層析分離純化提 取AFP，採用考馬斯亮藍比色法測定得到的AFP為10. 2mgo實施例3AFP制麥微生物控制稱取IOOOg大麥，在4000ml無菌水中浸泡4小時。經浸泡的大麥在15°C，發芽3 4天。AFP用水稀釋到16 μ g/g大麥濃度，加入到大麥中。經4天後，檢測大麥發芽汙染情 況，可以看到汙染情況明顯改善，與對照樣相比，汙染黴菌總數減少90%。
權利要求
1.一種抗真菌蛋白生產菌株，其分類命名為Aspergillus giganteus AF-11，已保藏於 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO 4342。鑑定其為巨 大麴黴的一個亞種，與一般巨大麴黴存在形態上存在明顯差異，具體表現為分生孢子囊短 而小，長度約為一般巨大麴黴的2/3 ；體積同樣比一般巨大麴黴小；分生孢子梗比一般巨大曲毒短ο
2.如權利要求1所述一種抗真菌蛋白生產菌的選育方法，包括以下步驟(1)土樣處理將土樣進行水浴，乙醇，蛋白腖選擇性富集處理。(2)真菌培養經富集處理的樣品條件下，在篩選培養基上培養4-5天(3)菌種篩選挑選可以抑制其他黴菌生長的菌落。(4)菌種馴化30°C在YPD培養基上馴化培養4-5次。(5)誘變篩選經EMS誘變，挑選抑菌圈較大的菌株，作為復篩菌株。(6)菌種復篩搖瓶發酵，檢測發酵液的對靶標菌抑菌圈大小。(7)培養優化溫度，碳源，氮源，檢測抗真菌蛋白(AFP)產量和效價。
3.如權利要求2所述(1)中土樣處理方法，其處理步驟為(1)採集土壤樣品，烘乾，4°C冰箱保存。(2)取2g土壤樣品研碎，勻質，加入IOmL無菌生理鹽水，混勻，50°C條件下水浴45min。(3)去除生理水，加入5mL65%乙醇處理lOmin。(4)將處理的樣品加入0.濃度的蛋白腖溶液處理lOmin。
4.如權利要求2所述O)中所用篩選培養基組成如下葡萄糖 10g, NH4N03lg/L，酵母膏 lg/L，K2HPO4O. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L， 孟加拉紅0. 006g/L,鏈黴素0. 003g/L,瓊脂20g/L。
5.一種通過權利要求1所述菌種發酵生產AFP的方法，其特徵在於該方法由以下步驟 組成(1)斜面培養菌種在條件下，培養4 5天，待孢子成熟後，用無菌水洗脫孢子， 製成孢子懸液用於種子培養。(2)種子培養種子培養基滅菌後，冷卻後按5% 10%的接種量，置於30°C、轉速為 150 220rpm的搖床上。培養48 60小時後的菌株用於發酵培養基接種。(3)發酵培養搖瓶發酵培養發酵培養基滅菌後，冷卻後按照10 25%的接種量接 入種子培養的菌株，置於32°C、轉速為150 220rpm的搖床上，發酵培養72 96小時後， 分離提取AFP。
6.如權利要求5所述的方法(1)中斜面培養基組成如下蔗糖20 30g/L,硝酸鈉1 2g/L，磷酸氫二鉀0. 5 lg/L,氯化鉀0. 2 0. 5g/L，硫 酸鎂0. 2 0. 5g/L，硫酸亞鐵0. 005 0. Olg/L，瓊脂20g/L。發酵培養基牛肉膏10 15g/L蛋白腖15 20g/L玉米澱粉10 20g/L NaCl 5 10g/L
7.如權利要求5所述的方法(2)種子培養基組成如下葡萄糖12 15g/L，蛋白腖2 5g/L，酵母浸膏2g 5/L，NaCl 6 10g/L。
8.權利要求1-7所述菌種和篩選方法和抗真菌蛋白(AFP)的發酵生產用於啤酒大麥制 麥的用途。
全文摘要
本發明公開了一種產抗真菌蛋白菌株和該菌株的篩選方法以及利用該菌發酵生產抗真菌蛋白的方法。利用該方法篩選獲得的菌株命名為巨大麴黴Aspergillus giganteus AF-11，保藏號為CGMCC NO.4342，該菌株具有更高的抗真菌蛋白產量。使用本發明提供的篩選菌種及方法生產的抗真菌蛋白能夠高效抑制啤酒制麥過程的黴菌，尤其是鐮刀黴屬，提高麥芽質量，和常規處理方法相比較，更安全，更有效。具有很好的應用前景。
文檔編號C12C1/16GK102086440SQ20101056530
公開日2011年6月8日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者唐坤甜, 孫志偉, 宋濤, 宋緒磊, 李建飛, 江偉, 陳洪元 申請人:中國食品發酵工業研究院