與高穀氨酸生產相關的基因及其應用的製作方法

2023-04-24 06:27:51

專利名稱：與高穀氨酸生產相關的基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程，更具體而言，本發明涉及包含與L-高穀氨酸(或叫做L-2-氨基己二酸或者L-α-氨基己二酸)生產相關的基因的DNA以及應用它來生產L-高穀氨酸(以下簡稱為高穀氨酸)的體系。
背景技術：
高穀氨酸廣泛存在於生物界，如霍亂弧菌(Cholera vibrio)等細菌、以玉米屬(Zea mays)為代表的植物、蛙胚等中。它是真菌類賴氨酸生物合成中的中間產物，是β-內醯胺類抗生素生物合成中的前體物質。此外，高穀氨酸作為以氨甲蝶呤(WO 92/09436)為代表的各種藥物合成的中間產物也很有用處。
但是，由於用化學合成進行製備時有必要進行光學分割和多階段反應，所以從消耗上講這並不是有效的手段。另一方面，已知有應用土壤桿菌屬(Agrobacterium)、克黴伯桿菌屬(Klebsiella)、產鹼桿菌屬(Alcaligens)、短桿菌屬(Breribacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物來製備L-賴氨酸的方法。(特開平6-181787號公報)。另外，本發明者們中的部分人提出應用黃桿菌屬(Flavobacterium)的微生物由L-賴氨酸生產高穀氨酸的方法(WO96/31616)。但是，即便是有應用這些微生物的方法，仍殷切希望有更有效地製備高穀氨酸的方法。
因此本發明者們的目標是增強上述任何應用微生物的高穀氨酸生產體系，例如通過基因工程來達到增強目的。進行這樣的操作時要依具體情況而論，例如研究頭孢黴素C的生物合成途徑時要確認頭孢黴素生產菌帶小棒鏈黴菌(Streptomyces Clavuligerus)中與從L-賴氨酸轉換為α-氨基己二酸(或高穀氨酸)相關的賴氨酸-6-氨基轉移酶和Δ-1-哌啶-6-羧酸脫氫酶的存在，或者對於前者要確認編碼該酶的基因存在的位置(Fuente等，Biochem.J.(1997)327,59-64)。
已知用於L-賴氨酸生物鑑定的暗褐黃桿菌(由Flavobacteriumfuscum進行再鑑定的)IFO 3084中存在催化以下途徑的2-酮或二酸6-氨基轉移酶[或賴氨酸6-氨基轉移酶(以下叫做LAT)](Soda等，Biochemistry 7(1968),4102-4109,同4110-4119)。 L-賴氨酸+2-酮戊→2-氨基己二+L-穀氨酸L-Δ』-哌啶高穀氨酸二酸酸-6-半醛 -6-羧酸上述生物測定中，用與o-氨基苯甲醛反應得到的生成物的吸光度來測定哌啶-6-己二酸(以下叫做P6C)。另外，L-賴氨酸其它的生物測定中利用L-賴氨酸6-脫氫酶活性(Misono等，J.Biochem.(Tokyo)105(1989),1002-1008)。
上述的IFO 3084株在上述L-賴氨酸的每一生物測定中常用，且已建立了使用方法。因此，除LAT之外該IFO 3084株具有編碼P6C(或者在生物體內使量上達到平衡狀態的2-氨基己二酸半醛)脫氫酶(以下簡稱為脫氫酶)活性蛋白的基因。所以本發明的目的就是提供與高穀氨酸的生產相關的基因，同時獲得基因克隆用的候選菌株。
但是出乎意料的是本發明者們發現若使用最終選擇地宿主-載體體系，通過鳥槍法克隆技術，至少可克隆出與高穀氨酸產生相關的的基因，更具體而言，可克隆出編碼對P6C具有脫氫酶活性的蛋白質的基因。另外還發現與該基因具有一定同源性(或相同性)的變異體具有同樣的功能。
另一方面，上述Soda等，Biochemistry、7(1968)、4110～4119中記載了從液態無色桿菌(Achromobactor liquidum)(=Flavobacterium lutescence)獲得分子量為116,000 LAT結晶體的方法，在Yagi等，J.Biochem.87(1980),1395-1402中記載了從泥色黃桿菌而來的LAT由A、B1、B2和C4個非同一性的亞基構成。在這些文獻的基礎上，應用純化的LAT蛋白質的胺基酸序列測定結果，克隆編碼具有LAT活性的蛋白質的基因，初期的研究失敗。但是，應用與先前的技術文獻完全不同的方法從泥色黃桿菌中純化出具有LAT活性的蛋白質，測定所得蛋白質的胺基酸序列，利用其測序結果來克隆目的基因時成功地克隆出編碼LAT的基因(Lat)、本發明是以上述發現為基礎的。
由此，本發明提供與高穀氨酸的生產相關的基因，它能從泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)獲得；或者本發明提供DNA，在嚴緊條件下它能與該基因雜交，並且它是從包含具有恢復缺乏高穀氨酸生產能力的突變體生產能力的突變體中分離純化出的。
更具體而言，上述與高穀氨酸的生產相關的基因是編碼具有LAT活性蛋白質及具有脫氫酶活性的蛋白質中至少1種蛋白質的一部分或全部的DNA，或其變異體。
本發明涉及具有上述DNA的自主複製性或整合複製性重組質粒，以及用該重組質粒轉化的轉化體、以及應用該轉化體的高穀氨酸的生產方法。
圖2是泥色黃桿菌突變株賴氨酸6-氨基轉移酶(LAT)的活性圖。Wild表示野生型，1st是第一突變侏，2nd是第二突變株，3rd是第三突變株的LAT活性。
圖3是用薄層層析分析質粒pCF213對高穀氨酸生產缺損突變株的高穀氨酸生產能力互補性的結果。
HG表示高穀氨酸的移動位置，Lys表示L-賴氨酸的移動位置，St是高穀氨酸標準品的TLC分析結果，1st是pCF213、2nd pCF213及3rd pCF213分別表示有pCF213的第一、第二和第三突變株培養物的TLC分析結果，Wild pCF213及Wild pCF704是分別具有pCF213和pCF704的野生型株培養物的TLC分析結果，1st pCF704及2ndpCF704是分別具有pCF704的第一和第二突變株培養物的TLC分析結果，1st pCF111是具有pCH111的第一突變株培養物的TLC結果。
圖4表示泥色黃桿菌IFO 3084(pCH213)(圖中以pCF213表示)和泥色黃桿菌IFO 3084(pCF704)(圖中以pCF704表示)隨時間變化時高穀氨酸的生產能力。
圖5是以pCF213插入區域的鹼基序列為基礎找到的ORF的存在位置。
圖6表示在實施例2的3(6)中用MonoQ HR5/5柱處理時洗脫級分與相對應的LAT活性間的關係。
圖7是在實施例2的3(7)中，用雙層膠4/20及10/20對LAT活性級分進行非變性PAGE(A)和SDS-PAGE(B)時的照片。圖中M是分子量標誌物，C是在實施例2的3(5)中得到的過濾液，數字分別表示各級分編號。
圖8表示各種質粒在高穀氨酸生產缺損性變株及野生型株中相對應的LAT活性。
圖9是用各種質粒轉化的泥色黃桿菌IFO 3084株隨時間變化時其高穀氨酸的生產能力。
本發明中所講的與高穀氨酸生產相關的基因是指關係從L-賴氨酸到P6C(LAT活性)或者經過與P6C有化學平衡關係的α-氨基己二酸-6-半醛到高穀氨酸(脫氫酶活性)2階段轉換關係中任一階段的基因。首先介紹最初獲得編碼後面轉換關係中有脫氫酶活性的蛋白質基因的具體情況，它是本發明者們應用以下列條件為基礎確立的宿主-載體體系而得到的。
為了進行泥色黃桿菌的基因操作，必須確立泥色黃桿菌的適當宿主-載體體系，也必須解決以下3個問題。
(1)得到在泥色黃桿菌內能自主複製的複製子。
(2)得到在泥色黃桿菌內能表達、且發揮功能的耐藥標誌。
(3)確立泥色黃桿菌的DNA導入方法。
幸運地是上述問題(1)和(2)由最近Mo Bi Tec公司出售的pBBR122得到解決，它在廣範圍內的革蘭氏陰性菌中自主複製，有卡那黴素、氯黴素耐性。上述問題(3)的解決首先以確立質粒pBBR 122的泥色黃桿菌導入方法為前提。可是用電穿孔法將DNA導入大腸埃希氏菌的方法進行檢測的結果發現將泥色黃桿菌的集落生長在含卡那黴素20μg/ml的L板上，將之液態培養，用鹼性SDS法抽提質粒後可確定pBBR 122穩定保持在泥色黃桿菌中。於是上述問題(3)也得到解決。該宿主-載體系統在以其它菌株作宿主時可以(a)轉化效率非常高，(b)將適當大小的DNA片段插入pBBR 122(J.Bac.178(1996),1053-1060)，但已闡明泥色黃桿菌也具有上述(a)、(b)的性能，獲得的基因不僅可以在泥色黃桿菌內擴增，而且可通過鳥槍法克隆技術獲得編碼對P6C具有脫氫酶活性的蛋白質的基因。取代所有的pBBR122的氯黴素耐藥基因，導入pUC19的多克隆位點，製成pCF704，用它作為以後的載體。
然後建立所得基因或擴增基因的評價系統，即用N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(NTG)誘發泥色黃桿菌IFO 3084的突變，用含有伊紅Y的MEM培養板(pH7.0)進行篩選。
如此獲得一點也不生產高穀氨酸的第一突變株和只稍微生產一點的第二、第三突變株。可以確認完全不生產高穀氨酸的第一突變株和野生型株具有相同的lat活性，只生產一點的第二、第三突變株只稍微有lat活性。也就是說第一突變株有可能是lat以外的與高穀氨酸的產生相關的基因受到一定損害，而第二和第三突變株可能是至少lat受到一定程度的損傷。
然後，用Sau Ⅲ AI部分消化野生型菌株的基因組DNA，將其6-8Kbp片段插入pCF704的BamHⅠ部位，製作DNA文庫。將之分別導入上述第一、第二和第三突變株中，篩選恢復了高穀氨酸生產能力的菌株。此時，挑選在篩選突變株應用的含伊紅Y的MEM平板(pH7.0)中變成黑色的克隆，應用TLC驗證高穀氨酸的生產能力。作為這些突變株的代表，第二突變株(Flavobacterium lutescens 2nd mutant)於平成10年7月6日保藏於工業技術院生命工學工業技術研究所，保藏號為FERM P-16874；第1突變株(Flavobacterium lutescens1st mutant)於平成11年6月10日保藏於同一研究所，保藏號為FERM P-17419。按布達佩斯條約該FERM P-16874株和FERM P-17419株於平成11年7月26日移交到同一研究所的國際保藏部，保藏號分別為FERM BP-6798和FERM BP-6799。
結果獲得有補充第一突變株高穀氨酸生產能力的質粒的菌株以及有部分補充第二突變株高穀氨酸生產能力的質粒的菌株。但是這些菌株，尤其是補充第二突變株的菌株的質粒容易缺失，所以為了獲得穩定的質粒有必要進行再篩選。用限制性酶處理而得到的DNA片段分析的結果是所得補充第一突變株、部分補充第二突變株的命名為pCF111的質粒與命名為pCF213的質粒看上去是同一質粒。
另一方面，用pCF111和pCF213再分別轉化第一、第二和第三突變株，用TLC檢測其高穀氨酸的生產能力。結果是這兩種質粒均補充第一突變株，而部分補充第二和第三突變株。
以該互補試驗為基礎，能充分恢復高穀氨酸生產能力缺損的突變株高穀氨酸生產能力的質粒中至少存在本發明中與高穀氨酸生產相關的基因，更具體而言，存在lat以外的任何基因。
因此，雖沒有限定，但作為本發明中講的「L-高穀氨酸生產相關基因中的一個，推選包含在質粒pCF213插入部分、編碼有脫氫酶活性蛋白質的基因。例如，該基因存在於序列號2所示的序列中。
另一方面，與前者的轉換相關的基因，即本發明的編碼有LAT活性蛋白質的基因，如下克隆。
在一定的培養條件下培養泥色黃桿菌，將所得菌體破碎後，將破碎液離心，除去菌體破碎物，得到細胞抽提液，然後經過超速離心、硫酸銨沉澱、脫鹽、離子交換色譜、親和色譜、超濾、電泳等分離純化目的蛋白質。
分析純化的蛋白質N末端胺基酸序列，根據其結果設計DNA引物，對泥色黃桿菌(IFO 3084)株的基因組DNA進行PCR。以PCR擴增的DNA片段為模板再進行PCR，獲得該DNA片段兩外側的周區域。如此獲得編碼本發明目的蛋白質的DNA。
因此可提供作為L-高穀氨酸生產相關基因之一的、編碼有LAT活性蛋白質的DNA。也就是說作為本發明的另一基因包括，例如有構成序列號1所示鹼基序列中編碼區域的序列的基因。可以認為所對應的純化蛋白質的N末端是序列號1中的Ser，其上遊基因編碼的到Met的胺基酸序列是經翻譯後加工而去除的。
再者，包含本發明中所講高穀氨酸生產相關基因的DNA包括包含編碼有上述脫氫酶活性蛋白質的基因和編碼有LAT活性蛋白質的基因各1個以上的DNA。
加之，本發明中所講的基因有上述二基因的變異體，在一定的雜交條件下它們能分別與二基因進行雜交，例如在60℃ 2×SSC(標準檸檬酸鹽溶液)中，優選60℃、0.5×SSC中，特別優選60℃、0.2×SSC中這樣嚴緊條件下有雜交的鹼基序列，且缺乏高穀氨酸的生產能力。也包含能恢復泥色黃桿菌突變體該生產能力的變異體。
更具體而言，編碼具有脫氫酶活性蛋白質的基因的變異體與序列號2中2855～4387的鹼基序列至少有70％的同一性。編碼具有LAT活性蛋白質的基因的變異體與序列號1中545～2658的鹼基序列(編碼區)至少有50％、優選70％、更優選93％的同一性。
該變異體是上述兩序列中5』末端或3』末端或其中的鹼基發生了去除或添加，或者鹼基的一部分被其它的鹼基所替換。鹼基中一部分被其它鹼基所轉換的變異體雖能編碼同一蛋白質，但伴隨遺傳密碼的縮合，也包含與上述二基因不同的鹼基序列。
伴隨遺傳密碼縮合之外的鹼基置換，分別參照上述二基因編碼的推算的胺基酸序列，以疏水性、親水性、電荷、大小等為基準觀測各胺基酸由來的側鏈的類似性，它們與蛋白質整體有類似的性狀。因此，變異體具有與上述二基因同等的功能，即它們能恢復高穀氨酸生產能力缺損的泥色黃桿菌突變株的這種生產能力，有相當高的準確率。
本發明的變異體可參考上述二基因的鹼基序列或參照它們編碼的推算的胺基酸序列，用核酸合成儀合成，或者通過誘導自身已知的點突變或部位特異性突變來製作。
本發明可提供持有上述基因或變異體的重組質粒。該質粒除含有上述基因或變異體以外，包含自主複製序列、啟動子序列、終止序列、耐藥基因等，能進行自主複製。並且質粒可是包含與預使用的宿主基因組的一定區域序列相同的、整合型質粒。例如含有編碼具有脫氫酶活性蛋白質的基因的具有自主複製性的重組質粒是將多克隆位點插入到質粒pBBR122和pBBR122的特定位點，或者用多克隆位點置換該部位或區域，通過多克隆位點來插入上述基因和變異體。該質粒的具體例是本說明書中叫做質粒pCF111和pCF213的質粒。pCF213於平成10年3月11日保藏於工業技術院生命工學工業技術研究所，保藏號為FERM9-16699，其後，如上所述按布達佩斯條約移交到國際保藏所，保藏號為FERM BP-6797，從Flavobacterium lutescens IFO3084(pCF213)，用其自身已知的質粒分離法可獲得其質粒。含有編碼具有LAT活性蛋白質的基因的DNA的重組質粒以及含有兩基因的DNA的重組質粒製作與上述pCF213的製作相同。
本發明還提供用上述重組質粒轉化作為宿主的黃桿菌屬的細菌而得到的轉化體。根據本發明的目的，屬於黃桿菌屬的宿主細菌可以是任何種的任何菌株，但優選泥色黃桿菌IFO 3084和泥色黃桿菌SP.7-1(FERM BP-5457)。
上述轉化體的具體例是用pCF213轉化泥色黃桿菌IFO 3084和泥色黃桿菌SP.7-1，泥色黃桿菌IFO 3084(pCF213)，上述FERMBP-6797，保藏於生命工學工業技術研究所的國際保藏單位。
本發明還提供用上述轉化體生產高穀氨酸的方法。該方法中，將用培養基培養中增殖了的轉化體與原始物質、L-賴氨酸或根據情況與P6C(或者2-氨基己二酸-6-半醛)接觸，或者與增殖了的轉化體或其處理菌體(例如有機溶劑處理物、菌體提取物、固化處理物)相接觸，原始物質轉換為高穀氨酸。
作為培養基中的碳源，只要是轉化體可利用的、任何物均行，應用泥色黃桿菌作宿主時可應用，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、葡聚糖等糖類、甘油、山犁糖醇等糖醇類，蘋果酸、檸檬酸等有機酸，這些碳源向培養基中的添加量通常希望在0.1～10％(重量百分比)(以下略作％)左右。
作為培養基中的氮源可應用，例如氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無機酸銨鹽和蘋果酸銨、檸檬酸銨等有機酸銨鹽，肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物等天然氮源，這些氮源向培養基中的添加量通常希望是1-10％左右。
另外，作為無機鹽類可應用，例如磷酸鈣、磷酸鈉等磷酸鹼金屬鹽和氯化鈣、氯化鈉等鹼金屬鹽酸鹽，硫酸鎂、硫酸鐵等硫酸金屬鹽，這些無機鹽向培養基中的添加量通常希望為0.001～1％左右。
這其中優選通常培養細菌用的液態培養基。碳源應用葡萄糖、甘露糖、澱粉等、氮源應用硫酸銨、蛋白腖、酵母提取物、大豆粉等。其它，無機鹽通常應用磷酸鈣、磷酸鎂、食鹽等。
微生物的培養是用上述培養基，在20-40℃、優選28-37℃，pH5～9、優選6～8，在通氣的條件下實施。
培養過程中，上面增殖了的轉化體與原始物質的接觸可通過預先向培養基中加入原始物質，或在培養過程中適時添加原始物質進行。培養終止後，將形成集落的菌體或處理過的菌體與原始物質加入培養基或適當的緩衝液中，必要時加入適當的輔酶，在反應器中攪拌或振蕩，讓含有原始物質的液體在固定的菌體上流動，以實現上述的接觸。
以培養過程中轉化體與L-賴氨酸的接觸為例，再如下進行具體說明。將轉化體接種到培養基之後進行培養，例如在20～40℃培養12-120個小時，獲得1ml中含106～1010個菌株的培養液，向該培養液中加入底場L-賴氨酸，通常其終濃度為0.5～30mg/ml，溶於水或助溶劑中，或者不溶解直接加入，通常在20～40℃反應門小時～7日，優選18小時-5日，應用陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂等各種離子交換色譜、HP20等吸附色譜、利用溶劑和溫度的沉澱和結晶等常用的純化手段獲得高穀氨酸。
所添加的L-賴氨酸的性狀和添加時期沒有特殊限制，但從溶解性這一點來看優選鹽酸鹽，可以在培養開始時添加，也可在培養過程中的第1～5日添加。
本發明提供包括能將L-賴氨酸轉換為高穀氨酸的與高穀氨酸生產相關的基因的DNA。該DNA在高穀氨酸的微生物學生產方法中有用。另外本發明提供高效生產高穀氨酸的轉化體，以及應用該轉化體的高穀氨酸的生產方法。
以下通過具體的例子對本發明進行詳細說明。提供這些具體例的目的是容易理解本發明，而並非將本發明限制於此。實施例1編碼具有脫氫酶活性蛋白質的基因的克隆等1．獲得高穀氨酸的非生產株將泥色黃桿菌IFO 3084菌株種植到3mlL培養基(1.0％多聚蛋白腖、0.5％酵母提取物、0.3％NaCl、0.1％葡萄糖、pH7.2)中，32℃振蕩培養一晚。將之作為種菌，取100μl加到50ml L培養基中，32℃振蕩培養4.5小時。然後5000×g離心10分鐘，收集細菌，用0.2M磷酸緩衝液(pH-6.0)洗滌一次，懸浮到0.2M磷酸緩衝液(pH6.0)6ml中。向該菌體懸浮液中加入50μl 80mg/ml的NTG,32℃、振蕩培養20分鐘。從該培養液中收集的細菌用0.2M磷酸緩衝(pH6.0)洗一次，全部種植到50ml L培養基中，32℃振蕩培養一晚。將該培養液每500μl分成一份，向其中加入60％甘油500μl，混合，-70℃凍存，將之作為突變株保存液。
將該突變株保存液用0.85％NaCl 106倍稀釋，每100μl塗到8cmツヤ-レ的MEM瓊脂培養基pH7.2上(多聚蛋白腖0.5％、酵母提取物0.2％、賴氨酸-HCl 1.0％、亞甲藍0.006％、伊紅Y0.04％、瓊脂1.5％,pH7.2),32℃培養3天。挑選所生集落中呈白色的種植到篩選培養基(多聚蛋白腖1.0％、酵母提取物0.2％、賴氨酸-HCl 1.0％,pH7.2)1ml中，32℃振蕩培養2天。將3μl該培養液滴到矽膠TLC板的各道中，使之乾燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)構成的溶媒將板展開，用水合茚三酮發色，檢測各道有無高穀氨酸。如此分離出一點也不生產高穀氨酸的第一突變株(FERM BP-6799)和僅稍微生產一點的第二突變株(FERM BP-6798)和第三突變株。用TLC分析所檢測的由L-賴氨酸轉換為高穀氨酸的能力(或者高穀氨酸的生產性)的結果如

圖1所示。圖1中高穀氨酸以HG表示(其它圖中相同)。另外這些轉換株中Lat活性的測定結果如圖2所示。2．宿主-載體體系、轉化體系的構建將泥色黃桿菌IFO 3084株種植到3mlL培養基上，32℃振蕩培養一晚。將之作為菌種。取其100μl種植到50ml L培養基上，32℃、振蕩培養4.5h。將培養液5000×g離心10分鐘，收集菌體，用10％甘油溶液洗滌一次，懸浮到3ml 10％甘油溶液中。將該懸浮液每200μl分為一份，-70℃凍存，作為電轉細胞保存液。冰上融解該保存液，加入Broad Host Range Vector pBBR122(Mo Bi Tec公司)200μg/mlTE溶液1μl。將之加入到0.2cm的(BIORAD)中，應用基因脈衝儀(Gene Pulser Ⅱ(BIORAD)在2.4kV、200Ω、25μF的條件下進行一次電衝。將細胞加入Falcon管中，加入預冷的L培養基1ml,32℃振蕩培養2小時。將該培養液塗到含有卡那黴素20μg/ml的L瓊脂培養基(多聚蛋白腖1.0％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％、瓊脂1.5％,pH7.2),32℃培養3天。得到2.4×105個轉化體。3．質粒pCF704的構建合成末端附加EcoRⅠ位點和NcoⅠ位點的引物(ファルマツア社)，應用Taq聚合酶(Taq polymerase)(ファルレマツア社)和PCR熱循環儀(Thermal Cycler)PERSONAL(TaKaRa)擴增pUC18的多克隆位點及其周圍區域95bp。用限制性酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化該DNA片段，應用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)連結到pBBR122的EcoRⅠ、NcoⅠ位點。用該反應液轉化E.coli感受態細胞JM 109(TaKaRa)，應用QIAGEN Plasmid Midi Kit從轉化體中製備質粒pCF 704。4．質粒pCF 213的構建按照GIAGEN Blood and Cell Culture DNA Kit提取純化泥色黃桿菌IFO 3084株的基因組DNA。用限制性酶SauⅢAI部分分解該基因組DNA，從瓊脂糖膠中切出其6～8Kbp的片段，應用0.4μm的超濾-C3單元(ミリポア)回收純化DNA，溶解到TE溶液中，作為插入DNA溶液。另一方面，用限制性酶BamHⅠ消化pCF704，用鹼性磷酸酶脫磷酸化。應用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)將之與插入DNA溶液相連接，作為DNA文庫。
將該DNA庫加入到第二突變株的電動細胞保存液中，進行電脈衝。將該細胞加入到Falcon管中，加入預冷的L培養基1ml,32℃振蕩培養2小時。將該培養液全部種植到含卡那黴素20μg/ml的50mlL培養基上，32℃、振蕩培養2天。將培養液每500μl分份，每份加入500μl 60％的甘油溶液，混合，-70℃凍存，作為互補株保存液。
用0.85％NaCl將該互補株保存液稀釋103倍，每100μl塗到8cmツヤ-レ的MEM瓊脂培養板pH7.0(多聚蛋白腖0.5％、酵母提取物0.2％、賴氨酸-HCl 1.0％、亞甲藍0.006％、伊紅Y0.04％、瓊脂1.5％,pH7.0)上，32℃培養3天。將所生長的菌株中呈現黑色的部分作為互補株混合菌體。將該互補株混合菌體種植到3ml的篩選培養基中，32℃振蕩培養2天。將該培養液3μl滴到矽膠TLC板的各道中使之乾燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)構成的溶媒系統將板展開，通過水合茚三酮發色來檢測各道有無高穀氨酸。如此選擇能恢復高穀氨酸生產能力的互補株混合菌體，再分離單菌落，選擇恢復高穀氨酸生產能力的菌株，將之作為互補株，應用QIAGEN Plasmid MidiKit從這些互補株中製備的一個質粒叫做pCF213。將大約6.5Kbp的插入DNA插入到pCF213中。與從其它途徑獲得的質粒pCF111的各突變一起，檢測上述pCF213的互補性，其結果如圖3所示。5．pCF213對高穀氨酸生產能力的上調用pCF704轉化野生型泥色黃桿菌IFO 3084株得到的轉化體命為Wild pCF704株，用pCF213轉化的菌株命為Wild pCF213株。將二者種植到含20μg/ml卡那黴素的篩選培養基中，32℃振蕩培養一晚，作為菌種。取其100μl種到25ml生產培養基(多聚蛋白腖1.5％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 2.0％、未調整pH)中，32℃分別振蕩培養24小時、48小時、72小時。用HPLC測定各培養液上清中的高穀氨酸量。即用蒸餾水將培養液稀釋到胺基酸總濃度達1000mg/L的程度，取50μl移到試管中減壓乾燥。向其中加入異氰酸苯酯、和三乙胺和乙醇及蒸餾水以1∶1∶7∶2混合的溶液50μl，攪拌溶解，室溫放置10分鐘後減壓乾燥。然後將之溶解到500μl HPLC移動相A溶液中，注入5μl。HPLC的條件如下所示。
柱TSK-GEL Super-ODS 4.6 ID×50mm移動相A溶液140mM醋酸鈉0.05％、用冰醋酸將pH調整為6.2的Tris溶液1000乙腈40B溶液70％ 乙腈流速2.0ml/min洗脫條件流速一定的梯度0-7分B溶液2％～40％的線性梯度，7分以後B溶液100％檢測UV254nm溫度40℃該條件下高穀氨酸的保留時間為1.3min，賴氨酸為7.7min。
結果如圖4所示，野生型pCF213株的高穀氨酸的生產能力是野生型pCF704株的1.5倍。6．pCF213插入區域基因鹼基序列的測定應用ABIPRISM 377×L DNA Sequencer(Perkin Elmer)，通過引物遊移法測定pCF213插入區域的鹼基序列。其鹼基序列如序列號2所示。
以測定的鹼基序列為基礎，參照Bibb等的方法(Gene,30,157(1984))確定其開放讀碼框(ORF)。其ORF顯示於圖5中。7．pCF213插入區域中NotⅠ部位約2.5Kbp的分析對pCF213插入區域中限制性酶NotⅠ部件約2.5Kbp(序列號2的鹼基序列中2077-4578位)進行解析。從瓊脂糖膠中切出約2.5kbp的該NotⅠ部位，用0.45的超濾C3單元(ミ リポア)回收純化DNA，溶解到TE溶液中，用DNA Blunting Kit(TaKaRa)使之末端平滑化，作為嵌入DNA溶液。另外，用限制性酶HincⅡ消化pCF704，用鹼性磷酸酶脫磷酸。用Ligation Kit Version 1(TaKaRa)將之與嵌入DNA溶液連結。用該反應液轉化泥色黃桿菌IFO 3084株，用QIAGENPlasmid Midi Kit從轉化體中製備質粒pCF235。
將用pCF235轉化的第一突變株接種到3ml篩選培養基中，32℃振蕩培養2天。將培養液3μl滴到矽膠TLC板的各道中，使之乾燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)構成的溶媒系統展開，通過水合茚三酮發色來檢測各道中有無高穀氨酸。其結果是用pCF235轉化的第一突變株能恢復高穀氨酸的生產能力。
嵌入pCF235的約2.5Kbp的DNA序列中存在編碼510個胺基酸的ORF，它從序列號2的鹼基序列中第2855位的ATG開始到4387位的TAA結束。將該胺基酸序列在BLAST中進行同源性檢索，結果發現它與多種醛脫氫酶有高同源性，且與最近在database中登錄的Streptomyces dlavuligerus的哌啶-6-羧酸脫氫酶的胺基酸序列(J.Bac.,Vol.180,No.17,4753-4756(1998))整個區域有高的同源性。考慮到用pCF235轉化的第一突變株能恢復高穀氨酸的生產能力，以及野生型pCF213株高穀氨酸生產能力的上調，可以看到該ORF編碼的蛋白質具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性。實施例2編碼具有LAT活性蛋白質的基因的克隆等1．LAT活性測定將賴氨酸-HCl 73mg,2-酮戊二酸59m溶解到含0.5mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸緩衝液(pH7.3)1ml中，作為反應溶液。向酶溶液260μl中加入28.75μl反應溶液，32℃放置1小時。加入151.8μl溶於乙醇的5％三氯醋酸終止反應，離心，向60μl上清中加入含4mMO-氨基苯甲醛的0.2M磷酸緩衝液(pH7.3)90μl,37℃放置1小時。在A465處測定，將相對來說A465高的部分作為LAT活性級分。2．菌株的培養將泥色黃桿菌IFO 3084在32℃振蕩培養一晚，將之作為菌種。將其50ml接種到30l缸中的10 L flaro-M9培養基(Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.2％、多聚蛋白腖1.0％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 0.5％、矽KM75 0.005％、MgSO40.025％、CaCl20.0015％,pH7.2)中，通氣攪拌培養17小時。將所得培養液5L離心(1000×g,10分鐘)，收集菌體，在0.01M磷酸緩衝液(pH7.2)中洗2次。將之懸浮到同種緩衝液中，用超聲波破碎菌體。通過離心(1000×g,10分鐘)去除菌體破碎物，獲得細胞提取液。將之進行高速離心(16,000×g,90分鐘)。其上清部分按以下所述進行純化。3．酶的純化如下所示進行純化，若無特殊說明均在4℃進行。(1)硫酸銨分級將實施例1中的上清部分600ml通過硫酸銨沉澱進行純化。將用30％-80％硫酸銨沉澱的部分進行離心(1000×g,30分)，收集沉澱，溶解到0.01M磷酸緩衝液(pH7.2)中，用同種緩衝液進行透析。(2)脫鹽將透析的酶溶液10ml上到4根PD10柱(Amasham Pharmacra)上，用含0.5mM磷酸吡哆醛的0.1M Tris-HCl緩衝液(pH7.4)洗脫，脫鹽。(3)QAE-TOYOPEAL550C柱層析將脫鹽了的酶溶液加到預先用含0.5mM磷酸吡哆醛的0.1MTris-HCl緩衝液(pH7.4)平衡過的QAE-TOYOPEAL550C(TOSOH)柱(φ5.5×6.0cm)上。用同種緩衝液洗滌後，用同種緩衝液配製的2L氯化鈉線性梯度(0～1.0M洗脫)，收集LAT活性部分。(4)Phenyl-TOYOPERL 650S柱層析向LAT活性部分中加入1M硫酸銨，將之加到預先用含0.5mM磷酸吡哆醛和1M硫酸銨的0.01M磷酸緩衝液(pH7.2)平衡過的Phenyl-TOYOPERL 650S(TOSOH)柱(φ5.5×3.0cm)上。用應用同種緩衝液的1200ml硫酸銨梯度(0.8-0M)洗脫，收集LAT活性部分。(5)超濾用ADVANTEC UP-20超濾150ml的LAT活性部分，縮到15ml。將該濃縮液2.5ml加到PD10柱(Amasham Pharmacia)柱上，用0.1MTris-HCl緩衝液(pH7.4)洗脫，脫鹽。(6)AKTA MonoQ HR5/5柱層析將脫鹽了的酶溶液3.5ml加到預先用0.1M Tris-HCl緩衝液(pH7.4)平衡過的AKTAexplorer 10S系統的MonoQ HR5/5柱(Amasham Pharmacia)上。用同種緩衝液洗滌後，用40ml應用同種緩衝液的氯化鈉線性梯度(0～0.4M)洗脫，收集LAT活性部分。再用PD10柱將LAT活性部分5ml脫鹽，再次加到AKTAexplorer 10S系統的MonoQ HR5/5柱上，收集LAT活性部分。各級分相對應的LAT活性關係如圖6所示。(7)電泳將LAT活性部分加到雙層膠4/20及10/20第一化學藥品公司，進行Natire-PAGE及SDS-PAGE，結果如圖7所示。在Natire-PAGE中，分子量100000附近可看到LAT活性部分的帶；SDS-PAGE中，分子量55000附近可看到LAT活性部分的帶。用Phast Transfer(Amasham Pharmacia)將SDS-PAGE中分子量55000附近的帶轉到PVDF膜上。4．N末端胺基酸序列分析應用HP G1005A Protein Sequencing System(HEWLETTPACKARD)對點到膜上的帶進行N末端胺基酸序列分析，應用Edman分析法進行。結果表明N末端的胺基酸序列為SLLAPLAPLRAHAGTRLTQG。以此為基礎設計DNA引物NmaRout CCYTGIGTIARICKIGTICCIGCRTGIGCICGNmaRin CCIGCRTGIGCICGIARIGGIGCIARIGGIGC應用LA PCR in vitro cloning kit(TaKaRa)對泥色黃桿菌IFO3084株的基因組DNA進行PCR。PCR反應條件是94℃30秒→55℃2分→72℃1分，進行30個循環。結果得到400bp的包含上述末端及其上遊區域的PCR擴增片段。以該序列為模板再應用PCR擴增出其周圍的區域。即分別用限制性酶PstⅠ和SalⅠ消化泥色黃桿菌IFO 3084株的基因組DNA，用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)各自進行連接反應，反應產物作為模板DNA。設計針對該模板DNA的DNA引物NIFout ttgatttgag cagattcgca ctgccattt(序列號3)NIRout aaggttttcg acaaagtgac catttccca(序列號4)應用LA Taq(TaKaRa)進行PCR。PCR反應條件是98℃ 20秒→68℃6分，30個循環。結果從PstⅠ模板得到約2Kbp的PCR擴增片段，從SalⅠ模板得到大約8Kbp的PCR擴增片段。應用ABIPRISM 377XL DNASequencer(PerKin Elmer)，通過引物遊走法測定這些PCR擴增片段的鹼基序列。其鹼基序列如序列號1所示。5．質粒pCF301、pCF335的構建設計DNA引物ctggtaccgc tcgatccggc tctgcaccgt(序列號5)ctggagctca ggcaggtgcg ggccacgtgt(序列號6)使序列表1中545位鹼基和2658位鹼基間的PstⅠ位點分別改變成KpnⅠ、SacⅠ位點，應用這些引物進行PCR反應，擴增Lat基因區域。用KpnⅠ、SacⅠ消化該約2.1Kbp的擴增片段，作為嵌入DNA溶液。另外，用限制性酶KpnⅠ、SacⅠ消化pCF704，應用Ligation Kitversion 2(TaKaRa)將之與嵌入DNA溶液連接，作為質粒pCF301。再用KpnⅠ、SacⅠ消化pCF301，從瓊脂糖膠中切出大約2.1Kbp的片段，將之與用KpnⅠ、SacⅠ消化的pCF235的片段進行連接，得到質粒pCF335。6．質粒pCF301對lat活性的互補用pCF704轉化第二突變株得到的轉化株為2nd pCF704株，用pCF301轉化第二突變株得到的轉化體為2nd pCF301株。將這二種菌株32℃振蕩培養一晚，作為菌種。取其30μl接種到離心管中的3ml生產培養基(多聚蛋白腖1.5％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 2.0％,pH未調)中，通氣攪拌培養17小時。將所得培養液1ml離心(1000×g,10分鐘)，收集菌體，用10ml含0.5mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸緩衝液(pH7.3)洗滌。懸浮到同種緩衝液中，用超聲波破碎菌體。通過離心(1000×g,10分)去除菌體破碎物，得到細胞提取液。測定該提取液的lat活性。結果如圖8所示。pCF301彌補第二突變株的lat突變。7．pCF335對高穀氨酸生產能力的上調用pCF704轉化野生型泥色黃桿菌IFO 3084株，得到的轉化體為野生型pCF704株，用質粒pCF301、pCF335轉化形成的轉化體為野生型pCF301株、pCF335株。將這些菌株接種到3ml含卡那黴素20μg/ml的篩選培養基中，32℃振蕩培養一晚。將之作為菌種。取其100μl接種到25ml生產培養基中(多聚蛋白腖1.5％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 2.0％,pH未調整)，32℃分別振蕩培養24小時、48小時、72小時。用HPLC測定培養液上清中高穀氨酸的含量。即用蒸餾水將培養液稀釋到胺基酸總濃度為1000mg/L的程度，取50μl到試管中，減壓乾燥。向其中加入50μl異氰酸苯酯與三乙胺、乙醇、蒸餾水以1∶1∶7∶2混合的溶液，攪拌溶解，室溫放置10分鐘，然後減壓乾燥。將之溶解到500μl HPLC移動相的A溶液中，注入5μl。HPLC的條件如實施例1的5中所述。
結果如圖9所示，野生型pCF335株高穀氨酸的生產能力大約是野生型pCF704株的2倍。
序列表110Mercian Corporation120與高穀氨酸的生產相關的基因及其應用130K-38Mercian150JP10/2323821511998-08-05150JP11/1823621511999-06-28160621012112663212DNA213泥色黃桿菌220221CDS222(801)---(2276)4001cccgggtgtc attgaatacc agcaggtcgc caggttgcag cagctggtcc agatcgcgca60cctggcgatc ctccagcgca gccggtgccg gcggcaccag cagcaggcgg ctggccgaac 120gctccggcag cggcgcctgg gcaatcagtt cgggaggcag gtggtaggca aaatcggact 180tcttcaacgc cggcagctcg atacaacggg ggcgtcagtt tacgcccctg taccgcctgt 240gccctcaccg ctcgaacttg gtgcccagga tcaccgccgt ggtggtgcgc tcgaccccat 300cagtggcgcc gatggcatcg gtcagctcgt ccatcgccgc cacgccatcg acggcggcca 360tcgccaccag gtcatgcgcg ccactgaccg aatgcaggct gcgcaccgca gcaatggcct 420gcagcgcccg cacgaccgcc ggcattttct tcggcatcac ggtgatggag atatgcgcgc 480ggacctgctg gcgctccatc gcctggccaa ggcgcacggt gtagccggcg attattccgc 540tgtgctgcag ccgctcgatc cggctctgca ccgtggtccg cgacaccccg agccggcgcg 600ccagcgccgc ggtcgaggcg cgcgcatcct cacgcaacag gtcaagcaac tgtgcatccg 660cctgggaaat ggtcactttg tcgaaaacct ttcgtcaatc cgccgaaacc ggccattgat 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權利要求
1．一種分離、純化的DNA，它包括從泥色黃桿菌細菌可獲得的L-高穀氨酸生產相關基因，或者其變異體，其中，該突變體在嚴緊條件下與該基因進行雜交，且具有恢復L-高穀氨酸生產能力缺損的泥色黃桿菌突變株的這種生產能力的功能。
2．權利要求1的DNA，其中L-高穀氨酸生產相關基因是編碼選自具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉移酶活性蛋白質及具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質中至少1種蛋白質的一部分或全部的DNA。
3．權利要求2的DNA，其中編碼具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉移酶活性蛋白質的DNA包含序列號1中801～2276的連續鹼基序列。
4．權利要求3的DNA，它含有序列號1的鹼基序列或者序列號1中545～2658位的連續鹼基序列。
5．權利要求2的DNA，其中編碼具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質的DNA包含序列號2中2855～4387的連續鹼基序列。
6．權利要求5的DNA，它含有序列號2中的鹼基序列或序列號2中2077～4578的連續鹼基序列。
7．重組質粒，它載有權利要求1中的DNA，具有自主複製性或整合複製性。
8．權利要求7中的重組質粒，其中DNA具有序列號1中545～2658的連續鹼基序列和/或序列號2中2077～4578的連續鹼基序列。
9．權利要求7的重組質粒，它能從泥色黃桿菌IFO 3084(pCF213)(FERM BP-6797)獲得。
10．轉化體，它是用權利要求7中的重組質粒轉化屬於黃桿菌屬的宿主菌而得到的。
11．L-高穀氨酸的生產方法，其特徵在於，用載有分離、純化DNA的自主複製性或整合複製性重組質粒進行轉化，在培養基中培養所得轉化體，培養過程中或培養後，使增殖的轉化體與L-賴氨酸或L-哌啶-6-羧酸接觸，轉換成L-高穀氨酸，然後回收如此產生的高穀氨酸，其中的DNA包含從泥色黃桿菌細菌可獲得的L-高穀氨酸生產相關基因，或其變異體，其中該變異體在嚴緊條件下與該基因進行雜交，且具有恢復泥色黃桿菌突變株生產能力的功能。
12．權利要求11的L-高穀氨酸的生產方法，其中L-高穀氨酸相關基因是編碼選自具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉移酶活性蛋白質及具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質中至少一種蛋白質的一部分或全部的DNA。
13．權利要求12的L-高穀氨酸的生產方法，其中編碼具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉移酶活性蛋白質的DNA包含序列號1中801～2276的連續鹼基序列。
14．權利要求12的L-高穀氨酸的生產方法，其中編碼具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質的DNA包含序列號2中2855～4387的連續鹼基序列。
15．權利要求11的L-高穀氨酸的生產方法，其中轉化體是用從泥色黃桿菌IFO 3084(pCF213)(FERM BP-6797)可獲得的重組質粒轉化黃桿菌屬的宿主菌而獲得的。
全文摘要
一種參與L－高穀氨酸生產的分離的基因,以及應用該基因的L－高穀氨酸生產體系。該基因來自泥色黃桿菌的基因組。
文檔編號C12N9/02GK1311821SQ9980934
公開日2001年9月5日 申請日期1999年8月4日 優先權日1998年8月5日
發明者藤井匡, 成田隆夫, 仲田邦穗, 上松仁, 恆川博, 一色邦夫, 吉岡武男 申請人:美露香株式會社