檢測染色體病的製作方法

2023-04-23 18:55:16

專利名稱：檢測染色體病的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過定量比較表明未知樣品中可能丟失或明顯突變的整條染色體和/或染色體中某區段的拷貝數，並將這些結果與正常樣品作比較來檢測非整倍性和突變，特別是微小缺失。更具體地說，本發明涉及胎兒染色體病，例如非整倍性，包括三體性21(唐氏症候群)、三體性13、三體性18，和男女性染色體異常，和微小缺失症候群，包括貓叫症候群、威廉斯症候群(Williams-Beuren syndrome)和迪喬治症候群與其它類似疾病的產前檢測。
背景技術：
非整倍性是染色體突變的一種常見形式，其中細胞中各染色體數目比正常細胞中的數目增加或減少。互補的二倍體(diploid complement)中缺少一條染色體稱為單體性，而存在額外的一條染色體稱為三體性。三體性21是存在一條額外的染色體21，它是非整倍性最常見的形式，導致唐氏症候群，一種潛在的嚴重智力遲滯的先天性疾病。
當存在適應症時，聯用核型與羊水或絨毛膜絨毛樣品作產前染色體病診斷已成為全世界高度發達國家的標準方法。核型是能特徵鑑定互補染色體狀態指徵的集合；包括染色體總數、各型染色體的拷貝數和染色體形態。一般通過染色中期(或凝聚的)染色體來測定核型。因為直至近來分裂間期染色體因其分散狀態和對染色技術不靈敏而無法目測，所以常用中期染色體。中期染色體可採用多種細胞學技術染色，染色後顯示為縱向區段，通常稱為條帶。各染色體的帶型是獨特的，從而可明確鑑定含有任何異常的染色體。然而，這種分析需要培養細胞並製備高質量的中期染色體，可能要花1-3周。
有人試圖不經培養細胞來分析染色體，美國專利號5,447,841描述了一種這樣的方法。利用與存在於未培養的間期羊水細胞上的染色體特異性DNA靶(序列)的螢光原位雜交(FISH)獲得了快速的部分核型分析。在該方法中，螢光標記的探針與結合在固體支持物上的染色體的互補位點雜交。該方法克服了常規細胞學染色方法因缺乏足夠特異性的染色體染色所致的限制；提供了含有標記核酸片段的異質性混合物的試劑，該試劑可與特定染色體、染色體的特定亞組或特定染色體的特定亞區的DNA雜交。雖然FISH方法開創了能快速且高靈敏度地檢測中期和間期細胞染色體病的可能性，但它還是有一些缺點1)許多微小缺失相關的染色體病因缺乏信號靈敏度而仍需要中期染色體和2)許多可同時診斷的染色體受限於螢光顯微鏡濾片解析度。此外，進行FISH方法需要高度熟練的技術人員和昂貴的儀器與試劑。
通過共同擴增第二種無關模板的PCR來定量測定cDNA種類的方法已有描述，參見Rappolee，D.A.等，Science，241708-712，(1988)。該方法極其依賴某些變量，包括循環次數和各種起始mRNA的用量。即使充分控制這些變量，也不可能精確地使無關對照模板的擴增速率與未知模板相同。兩種模板擴增速率中微小的差異在PCR期間被放大，從而非常可能高估或低估所用的最終試驗中存在的未知模板的含量。
Amhelm，Norman等，在「聚合酶鏈式反應」，Chemical EngineeringNews，36-47，(1990年10月1日)中報導說PCR已用於遺傳疾病的產前診斷來分析胎兒DNA以確定其是否含有可導致該疾病的突變形式的基因。PCR擴增後，利用標記探針測試PCR樣品中是否存在導致疾病的等位基因。其報導說可在一份樣品中測定是否存在幾種不同的導致(疾病)的基因。該報導還表明在利用斑點印跡方式發現病原的檢測方法中，PCR檢測方法已利用了基於酶、化學發光物質和螢光物質的報導物，將PCR擴增產物點樣在尼龍膜上，然後使攜帶點樣斑的該膜與能和感興趣PCR產物特異性退火的單鏈DNA探針接觸，所述探針經放射性標記或用可被螢光物質或化學發光物質檢測的分子來標記。該方法的局限是一次(只能)篩檢一種分析物。所描述的另一種方法是通過PCR在不幹擾引物與靶(分子)退火或被聚合酶延伸的能力的核苷酸側鏈中加入一標記來標記病原特異性產物本身。(該方法)提到了可通過一短的接頭臂將引物的5端或引物序列內的鹼基之一與螢光染料，例如螢光素或維生素(生物素)連接而監測。然後提出合適的擴增PCR產物製備後，可用連接於固體支持物的非標記病原特異性探針「捕獲」來檢測該產物。由Cetus Corporation開發的該備選方法稱為反向斑點印跡法。將所有過量的標記引物等洗去後，通過與細菌蛋白質鏈黴親和素結合，然後用酶處理來檢測是否存在分析物。所提出的另一種捕獲(方法)是用螢光染料標記一種引物，用生物素標記另一種引物，然後用鏈黴親和素捕獲雙鏈產物並檢測螢光。(該文獻)提到此捕獲方法可利用不同的具體病原引物組(其中一種引物被標記)來同時檢測不同的診斷性序列。(該文獻)提出使總的PCR產物與具有不同區域的合適尼龍膜支持物雜交，其中每個區域含有對一種病原的PCR產物特異性捕獲探針。雜交後用嚴謹條件洗滌支持物，如果標記物是生物素，可依次加入鏈黴親和素-酶複合物與合適的酶底物在該特定區域中產生顏色而表明是否存在一種病原體。(該文獻)提出此方法優於包括多步操作的原始斑點印跡法，因為後者需要在不同的雜交實驗中用各種標記的病原特異性探針來測試未標記的不同PCR產物的等份試樣。
授予Bunn等的美國專利號5,213,961公開了採用競爭性方法的定量PCR法，其中討論了影響DNA擴增的參數和區分模板(測試和對照)比值與拷貝數差異的機制。(該文獻)提出此方法可用於檢測體細胞突變。Bunn等闡述了主要由DNA引物和它們各自的引物結合位點性質所致的各種參數對擴增方法的影響；然而，該系統的局限在於利用了與靶(分子)足夠接近的標準品從而使PCR以相同速率共同擴增靶(分子)和樣品。此外，標準品必須不同於靶(分子)而可在以後通過酶促作用改變其長度，進而通過電泳分離並定量測定標準品和靶(分子)。
PCT公布的申請WO 94/03638公開了利用存在於染色體DNA中的短串聯重複性DNA序列和用於擴增該短串聯重複性序列的PCR方法來檢測非整倍性的其它方法。
授予Han的美國專利5,888,740在PCR反應期間利用經工程改造作為內部標準品的DNA模板來定量測定基因組DNA的水平。設計的這些對照DNA模板具有與測試樣品DNA模板相同的PCR反應引物序列。擴增的目標是以相同的速率進行，從而可控制擴增速率。然而，該方法每種染色體需要特定的內部對照，因而是複雜。此外，各染色體的PCR反應必須在微滴定板的不同孔中或其它容器中進行。
授予Carey的美國專利號6,551,783說明了一種基於在同時PCR試驗中定量測定兩種靶基因表達的方法，該試驗所用的系統中螢光標記或報導探針從被擴增的DNA鏈上取代，其方式是螢光探針離開了鄰近的猝滅染料。通過利用兩種不同的螢光探針，可同時進行兩種基因的多重PCR。一種靶基因是普遍表達的標記基因，例如GAPDH或DAD-1。所述方法局限在於一次(只能進行)一種未知靶(基因)的測定。
WO 94/23023所述的另一方法根據對某靶基因、看家基因和它們的含有突變(例如，點突變、插入或缺失)的競爭性模板進行多重PCR來定量測定該靶基因。此方法複雜且費事，在最後的分析中還要利用凝膠電泳。
就同時篩檢多種疾病而言，上述篩檢染色體疾病的方法無一令人完全滿意，因此仍要找尋易於使用且能快速提供結果的綜合性篩檢方法。
發明概述本發明聯用了基因組DNA的多重PCR與能和PCR產物雜交的可定量微陣列平臺，通過提供以下優點克服了目前方法的缺點1)可同時覆蓋非整倍性和突變，特別是微小缺失的綜合性篩檢；2)24-48小時內快速出結果；和3)便於使用。採用規則(rule-based)的診斷算法來解釋微陣列的圖像模式提高了定量測定結果的精確性。本發明提供能快速、精確、簡便和廉價地檢測染色體病的試劑盒與方法，這些試劑盒與方法可用於同時檢測非整倍性(包括三體性21、三體性13、三體性18和性染色體，例如X染色體異常)和微小缺失，包括威廉斯症候群、貓叫症候群、迪喬治症候群、普-韋症候群和安格曼症候群(Angelman syndrome)(二者涉及染色體15的部分缺失)、卡爾曼症候群和類固醇硫酸酯酶症候群。
更具體地說，本發明提供利用PCR、與染色體特異性探針的雜交(反應)和診斷(方法)來產前檢測唐氏症候群與其它非整倍性和染色體病的試劑盒與方法。通過利用規則算法改進了診斷結果。
在一具體方面，本發明提供在一次試驗中檢測多種染色體病任一種的方法，所述方法包括以下步驟(a)在容器中混合以下組分來製備聚合酶鏈式反應(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對正向和反向DNA引物寡核苷酸，其中所述每對的一條引物與該真核DNA的第一DNA鏈靶區段的3序列互補，另一條引物與該靶區段第二鏈的3序列互補，真核該DNA區段的長度約為50和約300個鹼基對之間，所述每對引物的一條在其5末端連接有可檢測標記，多對引物各自靶向於所選擇的感興趣不同染色體的某區段，該區段是潛在染色體病的指標，和一對靶向於對照基因的區段；和(iii)進行PCR擴增所需的PCR緩衝液和酶；(b)進行約5到約60輪溫度循環PCR以產生擴增的PCR產物；(c)純化步驟(b)的所述產物，獲得含有可檢測標記的單鏈DNA；(d)使微陣列與步驟(c)的產物接觸，所述微陣列具有多個斑點，各斑點含有DNA寡核苷酸探針，該探針的核苷酸序列與所述各靶區段的所述鏈之一的核苷酸序列互補；(e)使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴增的含標記單鏈產物雜交；(f)通過拍攝該微陣列圖像來檢測是否存在能與該微陣列雜交的PCR-擴增產物及其相對含量；和(g)通過將所述微陣列上所選擇染色體的所述各靶區段相關斑點的圖像與所述對照基因相關斑點的圖像作比較，然後與已知的正常基因組DNA的類似測試所得結果作比較，來診斷是否存在與一種或多種所選擇的不同染色體有關的染色體病。
在另一方面，本發明提供檢測染色體病的試劑盒，該試劑盒包括檢測染色體疾病的試劑盒，所述試劑盒裝有(a)在擴增哺乳動物基因組DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)中用作引物的多對DNA寡核苷酸，其中每對寡核苷酸的一條引物與哺乳動物基因組DNA靶區段第一鏈的3核苷酸序列互補，每對寡核苷酸的另一條引物與該靶DNA區段第二鏈的3寡核苷酸序列互補，每對所述引物的一條5端共價連接有可檢測標記；所述多對DNA引物靶向所選的感興趣的不同染色體的擴增區段，該區段是潛在染色體病的指標，和所述一對靶向對照基因擴增區段的引物；(b)進行(i)PCR，(ii)DNA-DNA雜交和洗滌，和(iii)比色法定量測定所需的緩衝液和酶；(c)至少一個具有多個斑點的微陣列，至少一個所述斑點連接有與各靶基因組DNA區段的攜帶標記的擴增鏈相互補的DNA序列；和(d)利用PCR擴增產物和微陣列上各斑點之間雜交反應產生的圖像強度來診斷染色體病的裝置，所述裝置利用了正常基因組DNA類似檢測產生的圖像。
在還有一具體方面，本發明提供在一次試驗中檢測多種染色體病中任一種的方法，該方法包括以下步驟(a)在容器中混合以下組分來製備聚合酶鏈式反應(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對正向和反向DNA引物寡核苷酸，所述每對的一條引物與第一真核DNA鏈靶區段3序列互補，另一條引物與該靶區段第二鏈的3序列互補，真核DNA該區段長約100和約250個鹼基對之間，其中每對引物的一條5末端連接有可檢測的顏色標記，多對引物靶向於所選的感興趣的不同染色體的區段，這些區段是潛在染色體病的指標，和一對靶向於對照基因的某區段；和(iii)進行PCR擴增所需的PCR緩衝液和酶；(b)進行約5到約60輪溫度循環PCR以產生擴增的PCR產物；(c)純化步驟(b)的所述產物，通過消化擴增的雙鏈PCR-產物的一條鏈獲得具有可檢測顏色標記的單鏈DNA；(d)使微陣列與步驟(c)的產物接觸，所述微陣列具有多個斑點，各斑點含有DNA寡核苷酸探針，該探針的核苷酸序列與所述靶區段的所述鏈之一的核苷酸序列互補；(e)使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴增的含標記單鏈產物雜交；(f)通過拍攝該微陣列比色圖像來檢測是否存在能與該微陣列雜交的PCR-擴增產物及其相對含量；和(g)首先通過將所述微陣列上感興趣的各所述染色體的相關斑點圖像與所述對照基因相關斑點的圖像作比較得到I-比值；然後每種I比值與已知的正常基因組DNA的類似測試結果所得的N比值作比較來診斷是否存在能與一種或多種感興趣的所述不同染色體有關的染色體病。
優選實施方案詳述總體如上所述，本發明有助於檢測染色體非整倍性異常，包括三體性21、18、13和性染色體異常，有時稱為基因劑量異常或畸變。同時，可通過選擇受影響基因區域(即，缺失區)內的靶序列或包含受影響基因區域的靶序列並比較表明可能發生這種缺失的區域與內部對照和正常DNA的基因劑量來檢測染色體突變，特別是形成某基因序列一部分缺失，導致稱為微小缺失症候群的各種疾病之一的那些突變。這種染色體微小缺失症候群的一些例子和所靶向的缺失區域包括普-韋症候群和安格曼症候群(Angelman syndrome)(缺失位點15q11-q13)、威廉斯症候群(缺失位點7q11.23)、貓叫症候群(缺失位點5p)、卡爾曼症候群(缺失位點Xp22.3)、迪喬治症候群(缺失位點22q 11.2)、杜興/貝克爾(Becker)症候群(缺失位點Xp21)和類固醇硫酸酯酶缺陷(缺失位點Xp22)。最好與同性別對象的正常DNA進行某些比較。
提供以下術語和首字母縮寫的定義以更好地理解下文詳述。
染色體病包括染色體中的或染色體數目的所有異常。例如，這包括檢測染色體21的三體性、X-和Y-染色體異常與檢測突變，例如各基因中的缺失、插入和/或改變。
本申請使用的雜交指在DNA的互補鏈之間形成雙螺旋結構，其中兩條鏈之一優選固定在固體表面或基質上。
本文所用的退火指在雜交條件下使單鏈或熱變性雙螺旋核酸分析物與寡核苷酸探針或引物在緩慢降低的溫度下或單一溫度下培育，使探針或引物與該核酸分析物內的其互補序列結合。
分析物或核酸分析物用於描述DNA樣品中作為分析對象的化合物。
標記或可檢測標記(或「標籤」)指可連接於核酸序列，從而能對其進行檢測和/或定量測定的取代基團。例子包括放射性同位素標記，例如32P、33P和35S；顯色指示劑，如螢光物質、化學發光物質或有色化合物；配體，如生物素；和可用質譜或其它光譜性能區分的化學基團。合適標記的更具體例子包括黃嘌呤染料、羅丹明染料、萘胺、苯並二唑、芪、芘、吖啶、花青3和花青5。雖然也可利用化學反應、酶促反應，或使標記與中間體配體雜交或退火來間接加入，優選將作為引物一部分的標記物直接摻入而引入核酸分析物中。
探針指用作經雜交反應而與核酸分析物中其互補序列相結合的試劑的核酸序列。本文所用捕獲探針指一端結合到固體表面(即，被束縛的)而能在雜交反應中將含互補序列的核酸或寡核苷酸捕獲在該固體表面的探針。
序列指在含有DNA的A、G、C、T殘基的核酸內，以特定順序和鏈長連接在一起的鹼基串。
互補或互補序列指能在嚴謹條件下形成雙鏈(雙螺旋)結構的兩條序列。
靶、靶序列、靶鏈或靶核酸本文用於指存在的檢測目標(例如通過與特異性DNA探針雜交)的核酸序列。有時術語「靶向」以廣義使用，指選擇某染色體的特定核酸區段。
「被束縛的」或「表面束縛的」在本文用於指通過表面官能團和DNA探針一端的官能團之間形成的共價鍵或其它強鍵而在一端結合於某表面的寡核苷酸DNA探針。
「固相雜交」指參與形成雙螺旋結構的兩條「反應鏈」中的一條被束縛於或者固定在固體支持物上的雜交反應。
「側翼」或「邊界」用於指接近、毗連和/或包括某染色體的DNA靶區段二末端的核酸區段。
「寡核苷酸「指可化學合成的短DNA鏈，其長度一般最多約100個核苷酸。
「基因「指一個遺傳功能單位，包括編碼蛋白質的序列、間插在基因中的內含(非編碼)序列和調節基因功能的其它序列。
「微陣列」或「DNA晶片」指能同時分析雜交反應的多重性，在某表面上或固定在某表面的微點上形成的表面束縛的DNA探針的兩維或三維(3D)陣列，一般採取小型化形式，所含的各DNA探針陣列的中心間隔小於1毫米。
「引物」指具有游離3』-OH末端的寡核苷酸，其與「模板鏈」鹼基配對，從而可用聚合酶延伸。例如在PCR反應中，與DNA模板退火的寡核苷酸引物可用作DNA聚合酶的底物(連同脫氧核苷5』-三磷酸)，從而導致「引物延伸」。
「引物對」指能與核酸靶區段的相反鏈相結合的兩條引物。
「PCR片段」指聚合酶鏈式反應形成的長度確定(受模板上引發位點之間的間距所限定)的DNA片段。
「變性」或「變性的」指雙螺旋核酸分子的兩條鏈在該雙螺旋不穩定的條件(最常見的是升溫(「熱變性」))下分離(解離)。
「5』-端/末端」指核酸鏈的末端，該末端含有的核苷酸在其脫氧核糖上為非酯化碳-5。
「3』-端/末端」指核酸鏈的末端，該末端含有的核苷酸在其脫氧核糖上具有非酯化碳-3。
PCR-聚合酶鏈式反應。
SSC-檸檬酸鈉鹽水，含有150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉的溶液。
申請人的診斷方法利用PCR先擴增相對於總DNA而言以低豐度存在的特異性DNA序列。當特異性DNA序列存在於起始DNA中時，採用PCR可將其擴增10萬倍以上從而有助於檢測。
美國專利號4,683,202；4,683,195；4,800,159和4,965,188提供了現已熟知的本發明所用PCR方法的細節，其內容納入本文作為參考。通過利用與感興趣特定區域側翼序列互補的寡核苷酸引物以相反和重疊方向進行引物指導的DNA合成，PCR可以在數小時內將DNA序列擴增幾個數量級。利用對這種側翼序列的了解可設計出用作引物的兩條合成的單鏈寡核苷酸，其長度一般約20個核苷酸。選擇的二引物各自的序列應與所選擇的各側翼序列鹼基對互補。PCR首先使雙鏈靶DNA變性，然後使引物(每條鏈一條引物)與靶分析物側翼的序列退火。每條引物與一條側翼序列形成雙螺旋從而使引物的3羥基末端面向靶分析物序列。加入DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸導致形成始於引物並沿靶序列延伸的新DNA鏈，從而製備了該靶(序列)的一份拷貝。這些步驟，即DNA變性、引物退火和DNA聚合酶延伸代表了一輪PCR；每一步驟都在合適的溫度下進行。延伸產物一般延伸和並包含了與位於該靶序列另一端引物互補的序列。因此，每條新的延伸產物在變性後可用作下一輪的模板。
通過採用重複多輪的高溫模板變性、寡核苷酸引物再退火和聚合酶介導的延伸，可忠實地將DNA序列擴增幾十萬倍。PCR一般需要了解模板或待擴增區段的5和3二末端的序列，從而為各模板設計兩條不同的引物，一條有義鏈的正向引物和一條反義鏈的反向引物。
本發明的PCR方法利用多對包含不同寡核苷酸的引物，這些寡核苷酸的作用是作為感興趣的所需DNA區段的DNA合成起始點。各引物與待擴增雙螺旋區段的兩個3邊緣之一互補；它們常稱為正向和反向引物。正向引物的方向為基因的5區域到3區域(即，它們與非編碼鏈或反義鏈互補)，反向引物的方向為基因的3區域到5區域(即，它們與編碼或有義鏈互補)。引物在誘導引物延伸的條件下與其它PCR試劑，即四種不同的脫氧核糖核苷三磷酸(或其類似物)、合適的合成酶與合適的緩衝液(「緩衝液」包含實現所需pH和離子強度的物質等)聯用，並維持於合適的溫度。在聚合酶是Taq聚合酶或等效酶的PCR方法中，緩衝液可含有1.5-2mM鎂鹽，優選MgCl2，15-200CM各種核苷三磷酸，1CM各引物，和(例如)50mM KCl，10mM Tris緩衝液，pH 8.4和100Cg/ml明膠。進行PCR擴增的這種試劑盒可從許多供應商處購得。
利用引物序列設計和優化專業目前可得到的序列信息和已知的標準技術不難設計出用於檢測人染色體病的合適寡核苷酸引物。可通過本領域已知的標準方法合成寡核苷酸，例如通過利用自動化DNA合成儀，如購自Biosearch(Novato，Calif.)；Applied Biosystems(Foster City，Calif.)和其它公司。本文所用引物應足夠長從而可與一條鏈上毗鄰於某染色體DNA區段的所選擇側翼位點特異性雜交，所述區段是特別感興趣的疾病的指標。這種DNA區段的長度最少可包含14、15、16、17、18或19個鹼基對；然而，它們通常包含20、30、40、50、60、70、80、90或100個以上的核苷酸。待擴增的DNA區段往往長100和250個核苷酸鹼基對(bp)之間；然而，也可能需要擴增50和300bp之間的區段，例如當分析非整倍性時。探針和引物的長度可短至14、15、16、17、18或19個核苷酸，但它們通常至少含有20、30、40或50個以上的核苷酸。
各引物應足夠長從而在有合適的聚合酶和其它試劑，例如上述試劑存在時能啟動或引發延伸DNA產物的合成。合適的引物長度如熟知的那樣取決於許多因素；一般在實施本發明方法時，所用的引物通常含有約15-40個核苷酸殘基。較短的引物分子通常需要較低的反應溫度來形成並維持支持鏈延伸反應的引物-模板複合物。
所用的引物需要與含有所選序列的待擴增核酸基本上互補，即引物必須能與含有所選序列(或其互補序列)的核酸結合，即雜交。雖然引物序列無需全部與模板精確互補；例如，非互補核苷酸片段或其它部分可與引物的5端相連。然而，引物序列的剩餘部分優選與所選核酸序列互補，這是通常使用的。
總體上，通過PCR方法可擴增任何特定的核酸序列，只要足夠詳細地知道該序列兩端足夠多的鹼基從而可製備能與所需序列(位於該核酸序列的所需相對位置)的不同鏈雜交的兩條寡核苷酸引物。結果，將從一條引物合成的延伸產物與其模板(互補的)分離後，它可用作模板在下一輪中將另一引物延伸為長度確定的核酸。
在本發明一優選的實施方案中，引物成對使用。引物之一，即正向引物與靶DNA區段反義鏈3端的序列互補；該序列接近、毗鄰和/或包含該靶區段的反義鏈3端。另一引物，即反向引物與靶DNA區段的有義或編碼鏈3端的序列互補；該序列包含、毗鄰和/或接近該靶區段的有義鏈3端。
引物的長度優選在約15和約40個核苷酸之間，更優選在約18和約35個核苷酸之間。連接於或固定在微陣列斑點上的探針的長度優選在約25和約60個核苷酸之間，更優選在約35和約50核苷酸之間。捕獲標記產物的探針序列應含有足夠的核苷酸，從而可在中等嚴謹雜交條件下雜交。如上所述，雖然探針可以2D陣列連接在平面基板的表面，但優選3D陣列。
可利用許多供應商的商品化DNA純化試劑盒來適當地純化人DNA，例如胎兒DNA，往往是得自羊水或可能得自母親血液的產前DNA。可用螢光計和PicoGreen染料作為染色試劑來評估真核基因組DNA的濃度。或者，可通過標準DNA提取技術從胎兒細胞提取DNA，這些細胞可通過合適的方法，例如羊膜穿刺獲得。適當稀釋後，將純化的胎兒DNA一等份加入PCR反應試管。在本發明優選的實施方案中，所加入的反應組分包括濃度合適的酶與含有維持所需pH和離子強度的物質的緩衝液，與其它反應條件加上合適量的脫氧核糖核苷三磷酸。
所選擇的一套引物應對能表明感興趣疾病的特定染色體的部分或區段具有特異性。例如，可能需要定量比較存在的所有染色體的拷貝數。或者，可能需要與正常染色體相比較來確定某染色體是否有小部分丟失。為實現此目的，適當選擇的引物應側接作為所分析疾病指標的靶區域。此外，整套引物可包括設計用於擴增對照基因的一對(引物)。對照基因是存在於人真核DNA中，優選是普遍表達的並存在於用於診斷某疾病的靶區段的染色體以外的染色體中的基因。一種優選的基因是在染色體12上發現的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPD)。
對照基因的合適正向和反向引物與探針以及可用於診斷5種示例性的非整倍性染色體病的引物對的例子見下文。
就GAPD而言，引物可以是以下寡核苷酸序列SEQ ID NO1和2。相應的探針序列包括SEQ.ID NO19的序列。
就女性中與X染色體數量異常相關的特納(Turner)或三X(Triple X)疾病而言或就男性具有一條以上X染色體的克蘭費爾特症候群而言，可利用正向和反向引物對來製備包含Xp22區域的158bp PCR片段。這些引物可具有SEQ IDNO3和4的序列。相應的探針可包含SEQ.ID NO20的序列。
為區分男性和女性並診斷克蘭費爾特症候群的一些罕見病例，利用如SEQID NO5和6所示的引物對來製備與Y-染色體上SRY基因相關的148bp PCR片段。相應的探針可包含SEQ.ID NO21的序列。
為診斷三體13症候群，即三體性13，設計了如SEQ ID NO7和8所示的引物對來製備與ATP7B基因相關的127bp PCR片段。相應的探針可包含SEQ ID NO22序列。
為診斷愛德華症候群，即三體性18，設計了如SEQ ID NO9和10所示的引物對來製備與WDR7基因相關的154bp PCR片段。相應的探針可包含SEQID NO23序列。
為診斷唐氏症候群或三體性21，設計了如SEQ ID NO11和12所示的引物對來製備與SOD1基因相關的124bp PCR片段。相應的探針可包含SEQ IDNO24序列。
下文是設計用於分析人染色體中微小缺失的某些引物對的例子。
就貓叫症候群而言，可採用合適引物對，如SEQ ID NO13和14所示來製備靶向可能出現染色體5上潛在缺失位點的TAS2R1基因某區域的167bp PCR片段。相應的探針可包含SEQ.ID NO25序列。
就威廉斯症候群而言，可採用合適引物對，如SEQ ID NO15和16所示來製備靶向可能出現染色體7上潛在缺失位點的ELN基因某區域的138bp PCR片段。相應的探針可包含SEQ.ID NO26序列。
就迪喬治症候群而言，可利用合適引物對，如SEQ ID NO17和18所示來製備靶向可能出現染色體22上潛在缺失位點的DGCR2基因某區域的145bp PCR片段。相應的探針可包含SEQ.ID NO27序列。
雖然認為上述幾套正向和反向引物或相應的探針用於體現本發明各種特徵的試驗令人滿意，但自從最初進行的工作以來，已開發了目前優選的三套引物和相應的探針來診斷這些異常中的三種疾病，並利用不同的標記開發了一套(引物和探針)來檢測三體13症候群(三體性13)，即FGF9基因。當只有少量DNA可由於試驗時，優選該組引物和探針。這四套引物和探針示於下文並用於檢測以下四種基因的異常SRY、FGF9、WDR7和SOD1。目前優選這四套引物和探針來診斷相應的疾病。
就SRY而言引物為SEQ ID NO28和29；探針為SEQ ID NO36。這些引物產生了175bp PCR片段。
就FGF9而言引物為SEQ ID NO30和31；探針為SEQ ID NO37。這些引物產生了139bp PCR片段。
就WDR7而言引物為SEQ ID NO32和33；探針為SEQ ID NO38。這些引物產生了172bp鹼基PCR片段。
就SOD1而言引物為SEQ ID NO34和35；探針為SEQ ID NO39。這些引物產生了129bp PCR片段。
已開發了另一套引物和探針來取代靶向染色體13上ATP7B基因而非靶向FGF9基因的引物和探針。當有至少約10ng DNA可用於試驗時，優選該套(引物和探針)，其中引物為SEQ ID NO40和41，探針為SEQ ID NO42所示。
為便於該試驗，提供了裝有全部所需工具的試劑盒。例如，檢測多種染色體病的試劑盒應包含
(a)在擴增哺乳動物基因組DNA的聚合酶鏈式反應中可用作正向和反向引物的多對DNA寡核苷酸，設計這些引物來擴增感興趣的不同哺乳動物染色體的靶DNA區段，此區段是潛在染色體病的指標，和一對靶向擴增對照基因的引物；每對引物中的一條具有與其5末端共價相連的可檢測標記；(b)進行(i)PCR，(ii)DNA cDNA雜交和洗滌，和(iii)比色法定量測定的緩衝液和酶；(c)至少一個含有多個斑點的微陣列(優選一式兩份微陣列)，其中至少一個斑點連接有和帶標記的各自靶基因組DNA區段的擴增鏈相互補的DNA探針序列；和(d)利用PCR擴增產物和微陣列上各斑點之間雜交反應產生的圖像強度診斷染色體病的裝置，該裝置可利用正常基因組DNA相似測試產生的圖像。
此微陣列具有多個其上連接有DNA探針的微斑點；這些探針各自與擴增DNA的一條標記鏈互補。雖然可利用大量已開發的標記了靶DNA的陣列，包括靶DNA的探針直接連接於平面基板或微滴定板孔中的兩維試驗陣列，但優選三維生物晶片，例如美國專利號6,174,683和名為「三維形式生物晶片」(ThreeDimensional Format Biochips)的已公布國際申請WO 02/059372中所述的晶片。在這種三維試驗中，探針不連接於板孔的固體表面或載玻片或其它平板，而是通過與聚合的水凝膠的微斑點相連而存在於三維陣列中。此排列(方式)將探針與固體表面分開，從而為呈遞探針和最終捕獲標記的分子提供了更大的表面積。就試驗中所用的各種不同的靶子而言，每塊載玻片上或微孔板的每個孔中優選具有多個這種3D微斑點。
除引物組和微陣列以外，作為試劑盒分類目錄一部分提供的物品是熟知物品，它們商業可購得且通常作為任何PCR試劑盒的一部分而裝入。提供了目前熟知的PCR方法細節的上述四份美國參考文獻詳述了這些物品。如上所述，該試劑盒也裝有適當的化學物質以協助雜交反應。將雜交溶液與載玻片或板孔培育後，進行洗滌以除去未結合的標記的靶材料，從而可以任何方法觀察得到的載玻片，例如當利用螢光染料時可用螢光檢測器觀察，或根據該試劑盒選用的具體標記物的性質來使用其它合適的檢測器。該試劑盒中提供了合適的算法，可用之解釋微陣列比色掃描的結果；開發的這種算法依據早先從對照樣品得到的數據。
作為可用於檢測非整倍性或微小缺失所致多種染色體病的具有本發明各種特徵的試驗方法的例子，首先要得到少量真核基因組DNA。所述DNA可得自胎兒來源等；該試驗常用於分析得自羊水的基因組DNA。至少約0.1納克的基因組DNA可認為足夠；然而，可用多達10ng(當這種用量可得時)。可利用純化試劑盒，例如商業可得的來常規純化DNA。純化後，可適當評估某濃度和純度，得到純度和濃度的肯定值後，進行多重PCR反應。
可在體積約50微升的反應室中加入商業可購得的PCR系統的諸成分與根據不同染色體側翼靶區域設計的一套數對引物，所述靶區域是需要檢測的潛在疾病的指標。這些引物對當然應與連接在微陣列的斑點上的探針相一致，所述微陣列作為檢測試劑盒的一部分提供。例如當檢測微小缺失時，可將這些探針設計為優先與發生潛在缺失的區域中的正常反義鏈區段相結合，從而當在該探針處檢測到強度很低時表明發生了這種微小缺失。這種引物對的數目可包括，例如甚至100對以上。然而，作為一個試劑盒的一部分，更常裝有不同的5-25對(引物)。除了作為感興趣染色體病的指標而選擇多對引物外，試劑盒也可裝有一對所選對照基因的特異性引物。所選擇的每對引物最好能與染色體上可導致DNA序列擴增的位置結合，所述DNA序列為約50-300鹼基對，更優選約100bp-250bp，最優選約120bp-200bp。提供了約1cM的各正向和反向引物。當然，商品化PCR系統試劑盒中裝有合適量的脫氧核糖核苷底物，合適的酶，例如Taq酶，優選能熱啟動的聚合酶，和緩衝液。
標記每對引物的一條，用5-磷酸衍生另一條。在優選的實施方案中，正向引物5磷酸化，反向引物與可檢測標記共價相連。雖然如上文定義所述有各種可包含的可檢測標記，但優選比色標記，更優選利用螢光標記，例如花青。
PCR複製方法一般進行約5到60輪溫度循環；通常約20-30輪即足以產生有利於進行檢測的所需量的各種擴增核酸序列。PCR擴增完成後，採用標準方法，例如柱純化(如，設計能保留大小為100個鹼基對以上的分子)來純化雙鏈產物。可利用商品化試劑盒來幫助這種純化。
純化後，利用適合該目的核酸外切酶來消化純化產物的有義鏈；結果，此步驟得到了PCR擴增的單鏈產物。消化後，用雜交緩衝液適當稀釋消化的混合物。將得到的溶液加熱至約95℃的溫度5-10分鐘以使核酸外切酶滅活並使單鏈產物變性。將得到的標記反義鏈溶解於雜交溶液中，此溶液優選分為兩等分從而可平行用於一式兩份的一對微陣列。將各微陣列於合適的溫度，例如45℃在含有合適緩衝液的此溶液中雜交約10-20小時，優選約14-16小時。雜交後，用含有合適緩衝液的溶液洗滌各微陣列多次，然後利用雷射掃描儀或一些相當的儀器進行螢光成像。當然，如果使用不同類型的比色標記，或者如果使用放射性或其它類型的已知標記物，可使用其它合適的掃描儀/檢測器。
由於優選的試驗方法消化擴增雙鏈PCR產物的有義鏈，所提供的各微陣列具有探針，所述探針是從待檢測核酸各延伸段有義鏈選出的區段和所選擇的對照基因有義鏈的合適區段。下文給出了與所述引物對聯用的相應探針的例子。探針的長度一般為約25-約60個核苷酸。平行進行一式兩份的微試驗(microassay)後，記錄各微陣列上探針的螢光強度，然後用規則算法將這些圖像用於診斷。
首先將記錄值除以內部標準品的信號強度，例如位於具有探針的斑點處的信號強度，將各探針的信號強度標準化，所述探針可以是染色體12上GAPD基因有義鏈的某區段。此初步計算得到了以各探針與所選擇內部標準品比值形式的數值，稱為其I-比值。
然後比較一式兩份載玻片各塊上相同探針所得到的I-比值。就X和Y染色體而言，如果一式兩份載玻片之間某特定探針的這些比值的差異大於30％，則感到那些數值可能不可靠，因此不作進一步計算。類似地，如果對一些其它染色體上靶區段的某特定探針的I-比值差異大於20％，此特定探針同樣不作進一步計算和分析。(計算)經過這種排除後保留下的那些(比值)的兩個I因子的平均值，然後使用此數值。
為提供分析這種未知樣品所得結果的基礎，首先分析幾組已知正常的DNA，然後用這些結果來測定各所選DNA序列的正常比值。例如，運行12份正常的男性樣品，然後計算每份樣品的各探針與對內部標準品(本文選擇GAPD基因)的比值。然後計算這12個比值的平均值得到從正常男性DNA樣品預計的「正常比值」(N-比值)。進行類似的方法分析12位正常女性的DNA。類似地計算出這些數值的平均值，利用這些數值得到從正常女性DNA預計的N-比值。
在下一分析步驟中，將待分析的未知DNA與內部標準品得到的初始比值(I-比值)分別除以相同性別人的各種N-比值，得到的因子稱為轉換因子(C-因子)。採用該方法計算各探針的C-因子。感到各C-因子應該在約1.25和0.75之間，超出此範圍的任何C-因子判定為異常並不作隨後的分析。計算微陣列上各探針的C-因子後，計算除代表內部對照基因的探針以外的所有這些C-因子的平均值得到平均C-因子(當然是在0.75-1.25之間)。一旦建立了一式兩份的一套微陣列的平均C-因子後，將先前得到的各初始平均I-比值除以該平均C-因子從而得到各(探針的)校準比值(A-比值)。就微陣列的任何具體操作性運行而言，發現這一特別步驟可有效降低因內部標準品差異可能導致的總體變異；以此方式可將差異的總係數明顯降低約2-4％。
用平均C-因子來校準N-比值得到A-比值後，採用另一規則診斷各探針，所述規則將偏離正常比值25％醫師的任何比值視作基因組DNA樣品在該特定靶區段異常的指標。例如，如果表示男性樣品染色體21的探針的信號與一式兩份微陣列上所用內部標準品的I-比值是1.01，計算出此特定測試方法的平均C-因子為1.10，則該染色體21探針比值的再校準計算為1.01/1.10等於0.92(A-比值)。然後將A-比值(即，0.92)與先前發現約為0.68的正常男性樣品的染色體21探針信號的N-比值相比較。可看出該值比正常比值約高35％；因此，該樣品診斷為三體性21。感興趣的是，通常可接受的三體性21的理論值約為1.02，該值合理地接近此分析所得的0.92再校準比值。
就所選擇的各潛在疾病而言，可以相同方式分析各探針所得的數值，結果可在一次試驗過程中診斷是否存在染色體病。例如，當檢測到三體性疾病時，各探針的強度基本上較高，當在其它突變(處)發現微小缺失時，各探針的強度基本上較低。為證實利用微陣列的此測試方法，利用上述八種具體染色體病的各自DNA進行了測試，24份已知正常的DNA樣品和48份已知含有特定異常的不同DNA樣品得到的測試結果顯示了100％的靈敏度和100％的特異性。雖然目前只檢測了八種潛在的染色體病，但是明顯不難在一個微陣列上進行這種測試可包括非整倍性和/或微小缺失的其它疾病，並完全可預計能得到類似的檢測和診斷(結果)。
給出以下實施例提供目前已知的本發明最佳實施方式，所述方式利用針對多達9種不同染色體的探針和多套引物，其中8種引物針對潛在疾病。然而，應該理解給出這些實施例只是為說明目的，不能認為以任何方式限制本發明的範圍，本發明的範圍當然只受本文末尾的權利要求書所限定。
實施例1作為用於檢測與八種不同染色體有關的非整倍性或微小缺失所致染色體病的試驗方法的例子，得到並常規純化了10ng真核基因組DNA。純化後，利用表1所示配方進行多重PCR反應表1.PCR諸組分的體積
利用體積約50微升的反應室。將引物混合物中的各對引物(即，SEQ IDNO1到SEQ ID NO18)設計為側接在所選擇用於檢測各種染色體的靶區域。
引物混合物的濃度(10×)範圍是1.25cM到2.5cM。市售PCR MasterMix含有合適量的脫氧核糖核苷底物、合適的酶(例如Taq)和緩衝液。正向引物5-磷酸化，反向引物與螢光標記物，即花青(Cy-3)共價相連。利用ABI9700熱循環儀擴增混合物的所有成分。PCR循環時間和溫度如下所示95℃、11′，96℃、1′，94℃、30″，55℃、30″和70℃、30″，10輪；94℃、30″，55℃、30″和70℃、30″，13輪；60℃、10′。
PCR擴增完成後，利用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化所擴增的雙鏈物質。在37℃用λ核酸外切酶(1.5cL，5單位/cL，New EnglandBioLabs)消化所純化物質的有義鏈30分鐘。
將得到的標記的單鏈物質溶解於含有3×SSC和0.1％ Triton X-100的雜交溶液中並分為兩等份。使每份樣品與在不連續位置結合了9種不同探針(即SEQ ID NO19到SEQ ID NO27)的3D微陣列雜交，45℃溫育14小時。在37℃用含有1×SSC和0.1％ Triton X-100的洗滌液洗滌15分鐘除去未結合的靶(分子)。然後室溫用10mM MgCl2和5mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)再洗滌15秒。乾燥後，用雷射掃描儀(ScanArray Lite，Perkin Elmer)獲得各雜交的3D微陣列(A和B)的螢光圖像。
如下所示，採用規則算法分析圖像表2.兩個3D微陣列的螢光信號強度60的雷射能量85的PMT獲得(值)
首先計算各基因的信號與GAPD的信號的比值。結果見表3。
表3.各信號與內部標準品GAPD信號的初始比值(I-比值)
然後計算各基因(比值)值的平均比值和差異百分比。
表4.兩個3D微陣列之間的平均比值和差異百分比
在該樣品中，差異百分比沒有一個顯示高變異。
表5.計算的轉換因子和利用平均C-因子校準的比值
在此樣品中，除SOD1以外所有基因的A-比值在N-比值的約15％以內，這說明該樣品中不存在這些基因所代表的疾病。SOD的A-比值是0.92，比N-比值的0.68高35％。該差異百分比的數量級表示樣品來自受三體性21影響的對象；此外，三體性21的理論值是0.93。由於所測試的DNA隨後顯示對象的DNA確實受到三體性21影響，因此認為該測試證實了使用此試劑盒的診斷方法。
實施例2作為另一實施例，實施了類似於實施例1所述的試驗方法，其中利用了靶向八種不同染色體的引物和探針。得到10ng真核基因組DNA並常規純化。純化後，利用與實施例1相同的配方進行多重PCR反應。
利用體積約50微升的反應室。使用與實施例1所用相同引物混合物和設計為側接在待檢測9種染色體靶區域的引物對。
引物混合物的濃度範圍是1.25cM到2.5cM。市售PCR Master Mix含有合適量的脫氧核糖核苷底物、合適的酶(例如Taq)和緩衝液。正向引物5-磷酸化，反向引物與螢光標記物，即花青(Cy-3)共價相連。
如實施例1所述進行PCR擴增、純化(擴增產物)和消化純化物質的有義鏈。
將得到的標記的單鏈物質溶解於含有3×SSC和0.1％ Triton X-100的雜交溶液中並分為兩等份。每份樣品通過與實施例1所述相同的在不連續位置結合了9種不同探針的3D微陣列雜交，45cC溫育14小時。在37cC用含有1×SSC和0.1％ Triton X-100的洗滌液洗滌15分鐘除去未結合的靶(分子)。乾燥後，用雷射掃描儀(ScanArray Lite，Perkin Elmer)獲得各雜交的3D微陣列(A和B)的螢光圖像。
如下所示，採用規則算法分析圖像表6.兩個3D微陣列的螢光信號強度70處的雷射能量85處的PMT獲得(值)
首先計算各基因的信號與GAPD的信號的比值。結果見表7。
表7.各信號與內部標準品GAPD信號的初始比值(I-比值)
然後計算各基因(比值)值的平均比值和差異百分比。
表8.兩個3D微陣列之間的平均比值和差異百分比
在該樣品中，無差異百分比顯示高度可變性。
表9.所計算的轉化因子和利用平均C-因子調整的比值
在此樣品中，不存在SRY基因顯示該對象是女性(因為缺乏Y-染色體)；除DGCR2以外的所有其餘基因的A-比值在N-比值的約12％以內，這說明樣品中不存在這些基因所代表的疾病。DGCR2的A-比值是0.22，比N-比值0.32低31％。差異百分比的數量級表示樣品是來自受迪喬治症候群影響的對象。
隨後鑑定到所測試的DNA確實來自受迪喬治症候群影響的女性對象的組織；因此認為該測試證實了使用此試劑盒的診斷方法。
實施例3為進行如以上實施例1所述的雜交，得到、純化、擴增、消化和製備0.3ng與實施例1所用相同的DNA樣品。然而，在此試驗中，只對基因GAPD、XP22、SRY、FG9、WDR7和SOD1進行試驗。引物混合物所包含的多套引物是SEQ ID NO1和2；SEQ ID NO3和4；SEQ ID NO28和29；SEQ ID NO30和31；SEQ ID NO32和33；SEQ ID NO34和35。
將得到的含有合適緩衝液的雜交溶液再分為兩等份。每份樣品與在不連續位置結合了6種不同探針的3D微陣列雜交；所用的探針是SEQ ID NO19和20與SEQ ID NO36-39。如上所述進行培育，以相同方式洗滌除去未結合的靶(分子)。乾燥後，用實施例1中所用的雷射掃描儀掃描各微陣列獲得其螢光圖像。
採用規則算法以實施例1所述相同的方式分析結果。結果還是四種基因的A-比值在N-比值的15％以內；例外的是SOD1的A-比值。結果，使用0.3ng的基因組DNA樣品測定再次診斷為一位對象受三體性21(唐氏症候群)影響。
雖然利用一些優選的實施方案描述了本發明，這些方案構成了本發明人目前已知的實施其發明的最佳方式，但是應該理解本領域的普通技術人員明顯可作出各種改變或改進而不脫離如本文附加的權利要求書所述的本發明範圍。例如，雖然優選使用至少含有本文所述全部序列的探針，但如果需要也可使用(含有)所述序列的主要部分的探針。所提及的所有美國專利和申請與文章的內容專門納入本文作為參考。
序列表簡述SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2是用於擴增人GAPD基因的139個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4是用於擴增X-染色體的158個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6是用於擴增人SRY基因的171個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8是用於擴增ATP7B基因的127個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10是用於擴增人WDR7基因的151個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12是用於擴增SOD1基因的124個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14是用於擴增人TAS2R1基因的167個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16是用於擴增ELN基因的138個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18是用於擴增DGCR2基因的145個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 19到SEQ ID NO 27是5末端設計為與微陣列板上的斑點相連，3區域設計為能與一條消化後的各擴增PCR產物雜交的探針寡聚物。
SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 29是用於擴增人SRY基因的175個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 30和SEQ ID NO 31是用於擴增FGF9基因的139個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33是用於擴增人WDR7基因的172個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 34和SEQ ID NO 35是用於擴增SOD基因的129個鹼基對區段的引物。
SEQ ID NO 36到SEQ ID NO 39是5末端設計為與微陣列板上的斑點相連，3區域設計為能與一條消化後的各擴增PCR產物雜交的探針寡聚物。
SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 41是用於擴增FGF9基因某區段的引物。
SEQ ID NO 42是5末端設計為與微陣列板上的斑點相連，3區域設計為能與一條消化後的FGF9基因的PCR擴增區段雜交的探針寡聚物。
序列表110生物概念股份有限公司(Biocept，Inc.)120檢測染色體病13081665/677614010/840,2081412004-05-0516042170PatentIn version 3.2210121119212DNA213人工220
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223探針40027cagagacaca aacatacaaa ggaaagatcc agacattcaa cgtaga 462102821122212DNA213人工220
223引物40028tggctttcgt acagtcatcc ct 222102921124212DNA213人工220
223引物40029cacagaaatt acaggccatg caca 242103021134212DNA213人工220
223引物40030ctcatcaaac ctatataagc acgtggacac tgga342103121135212DNA213人工220
223引物40031gggtccactg gtctaggtaa aaaatgtgtg aattt 35
2103221124212DNA213人工220
223引物40032tgcctcagtt tctagtcagc caat242103321124212DNA213人工220
223引物40033aggtct ttac cccaggcatt caca 242103421134212DNA213引物40034tttgggtatt gttgggagga ggtagtgatt actt 342103521135212DNA213人工220
223引物40035tcctgtcttt gtactttctt catttccacc tttgc352103621145212DNA213人工220
223探針
40036tcttcgcctt ccgacgaggt cgatacttat aattcgggta tttct 452103721145212DNA213人工220
223探針40037gatactatgt tgcattaaat aaagatggga ccccgagaga aggga 452103821145212DNA213人工220
223探針40038cagcccaaag ttatcttctt aaatttttta caggtccatg aaaaa 452103921145212DNA213人工220
223探針40039cagcccaaag ttatcttctt aaatttttta caggtccatg aaaaa 452104021124212DNA213人工220
223引物40040gattctcatg ggttggccag gata242104121124212DNA
213人工220
223引物40041actccagagc tcaaagtaac ccac242104221144212DNA213人工220
223探針40042acatcttctg tctattgaaa ggcaacttac ggctgggcgt ggtg 4權利要求
1.一種在一次試驗中檢測多種染色體病中任一種的方法，所述方法包括以下步驟a在容器中混合以下組分來製備聚合酶鏈式反應(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對正向和反向DNA引物寡核苷酸，其中所述每對引物的一條與該真核DNA第一DNA鏈的靶區段3序列互補，另一條引物與該靶區段第二鏈的3序列互補，該真核DNA區段長約50-300個鹼基對，其中每對引物的一條在其5末端連接有可檢測標記，多對引物各自靶向所選擇的感興趣的不同染色體的區段，該區段是潛在染色體病的指標，並有一對引物靶向對照基因的區段；和(iii)進行PCR擴增所需的PCR緩衝液和酶；b進行有約5-60輪溫度循環的PCR，產生擴增的PCR產物；c純化步驟(b)的所述產物，獲得含有可檢測標記的單鏈DNA；d使微陣列與步驟(c)的產物接觸，所述微陣列具有多個斑點，各斑點含有的DNA寡核苷酸探針的核苷酸序列與所述各靶區段的所述鏈之一的核苷酸序列互補；e使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴增的含標記單鏈產物雜交；f拍攝該微陣列的圖像來檢測是否存在與該微陣列雜交的PCR-擴增產物及其相對含量；和g將所述微陣列上所選擇染色體的所述各靶區段相關斑點的圖像與所述對照基因相關斑點的圖像作比較，然後與已知正常的基因組DNA的類似測定所得結果相比較，來診斷是否存在與一種或多種所述選擇的不同染色體有關的染色體病。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述診斷步驟包括在與相同性別正常基因組DNA的所述結果進行最後比較之前將規則算法應用於步驟(f)的檢測結果。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所選擇的真核基因組DNA的至少兩個靶區段與導致選自以下染色體病的染色體DNA的潛在微小缺失相關威廉斯症候群，貓叫症候群，和迪喬治症候群。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，選擇至少兩個靶區段來檢測選自以下的染色體畸變三體性13、三體性18、三體性21與X-和Y-染色體異常。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記是可檢測顏色的標記。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述可檢測顏色的標記與反向引物相連，每對引物的正向引物在其5末端磷酸化。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述可檢測標記是螢光染料。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特徵在於，首先純化步驟(b)的雙鏈產物，然後用核酸外切酶消化該純化產物的有義鏈得到步驟(c)的帶標記的單鏈反義鏈。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其特徵在於，所述對照基因是GAPD。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其特徵在於，所述探針的大小約為25-60個核苷酸，所述靶區段長約100-200個鹼基對。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特徵在於，平行使用兩個微陣列，比較二者的圖像結果作為雜交和成像步驟有效性的初步核查。
12.一種檢測染色體病的試劑盒，所述試劑盒包括a在擴增哺乳動物基因組DNA的聚合酶鏈式反應(PCR)中用作引物的多對DNA寡核苷酸，其中每對寡核苷酸的一條引物與哺乳動物基因組DNA靶區段第一鏈的3核苷酸序列互補，每對寡核苷酸的另一條引物與該靶DNA區段第二鏈的3寡核苷酸序列互補，每對所述引物的一條在其5端共價連接有可檢測標記；b.所述多對DNA引物靶向擴增所選擇的感興趣的不同染色體的區段，該區段是潛在染色體病的指標，並有一對所述引物靶向擴增對照基因的區段；c進行(i)PCR，(ii)DNA-DNA雜交和洗滌，和(iii)比色法定量測定所需的緩衝液和酶；d至少一個具有多個斑點的微陣列，至少一個所述斑點連接有和各靶基因組DNA區段的攜帶標記的擴增鏈相互補的DNA序列；和e利用PCR擴增產物和微陣列上各斑點之間雜交反應產生的圖像結果強度來診斷染色體病的裝置，所述裝置利用正常基因組DNA的類似測試的圖像結果。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其特徵在於，提供一對一式兩份的微陣列和規則算法作為所述診斷裝置的一部分來分析所述微陣列的所述強度掃描結果。
14.如權利要求12或13所述的試劑盒，其特徵在於，至少兩對所述引物靶向哺乳動物基因組DNA的區段，其中具有可能導致以下染色體病的染色體DNA的微小缺失威廉斯症候群，貓叫症候群，和迪喬治症候群。
15.如權利要求12或13所述的試劑盒，其特徵在於，所述引物對靶向選擇用於檢測以下染色體畸變的至少兩個DNA區段三體性13、三體性18、三體性21與X-和Y-染色體異常。
16.如權利要求12-15中任一項所述的試劑盒，其特徵在於，每對所述引物的一條具有螢光染料標記，每對所述引物的另一條其5末端磷酸化。
17.如權利要求12-16中任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述引物的一對靶向作為對照基因的GAPD。
18.如權利要求12-17中任一項所述的試劑盒，其特徵在於，探針的大小約為25-60個核苷酸，靶DNA區段長約120-200個鹼基對。
19.如權利要求12-18中任一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述酶包括用於消化PCR-擴增產物有義鏈的核酸外切酶。
20.一種在一次試驗中檢測多種染色體病中任一種的方法，該方法包括以下步驟a在容器中混合以下組分來製備聚合酶鏈式反應(PCR)混合物(i)真核基因組DNA；(ii)多對正向和反向DNA引物寡核苷酸，其中所述每對引物的一條與第一真核DNA鏈靶區段的3序列互補，另一條引物與該靶區段第二鏈的3序列互補，真核DNA區段長約100-250個鹼基對，其中所述每對引物的一條其5端連接有可檢測顏色的標記，多對引物靶向所選擇的感興趣的不同染色體的區段，這些區段是潛在染色體病的指標，並有一對引物靶向對照基因的區段；和(iii)進行PCR擴增所需的PCR緩衝液和酶；b進行有約5-60輪溫度循環的PCR產生擴增的PCR產物；c純化步驟(b)的所述產物，通過消化擴增的雙鏈PCR-產物的一條鏈獲得具有可檢測顏色標記的單鏈DNA；d使微陣列與步驟(c)的產物接觸，所述微陣列具有多個斑點，各斑點含有的DNA寡核苷酸探針的核苷酸序列與所述靶區段的所述鏈之一的核苷酸序列互補；e使所述DNA寡核苷酸探針與所述PCR-擴增的含標記單鏈產物雜交；f拍攝該微陣列的比色圖像來檢測是否存在與該微陣列雜交的PCR-擴增產物及其相對含量；和g首先將所述微陣列上感興趣的各所述染色體的相關斑點的圖像與所述對照基因相關斑點的圖像作比較得到I-比值；然後將各I比值與已知正常的基因組DNA的類似測試所得結果的N-比值作比較，來診斷是否存在與一種或多種所述感興趣的不同染色體有關的染色體病。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述I-比值經過規則算法，該算法包括首先使所有I-比值與各自的N-比值相比較得到各C-因子，然後得到平均C-因子，用該平均C-因子來調整各I-比值，然後用於最終診斷。
全文摘要
在一次試驗中檢測非整倍性或某些突變，特別是微小缺失所致的多種染色體病中的任一種的方法和使用該方法的試劑盒。利用多對引物寡核苷酸進行聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增真核基因組DNA，其中每對的一條引物在其5端連有可檢測標記。多對引物靶向感興趣的不同染色體的DNA區段，所述區段是潛在染色體病的指標，和一對靶向於對照基因的引物。純化擴增的PCR產物，從中得到具有可檢測標記的單鏈DNA，使之與微陣列上各含DNA寡核苷酸探針的斑點雜交，所述探針的核苷酸序列與各靶區段一條鏈的核苷酸序列互補。拍攝微陣列各斑點上存在的標記的圖像，並通過首先將該圖像結果與對照基因特異性斑點的圖像作比較，然後與得自正常DNA的圖像結果作比較來診斷是否存在一個或多個感興趣的靶DNA區段所表明的染色體病。
文檔編號C12Q1/68GK1981052SQ200580020530
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月18日 優先權日2004年5月5日
發明者Z·謝, S·韓, T·瓦達那斯庫爾 申請人:生物概念股份有限公司