基於核酸外切酶ｉ循環酶切放大的赭麴黴毒素a螢光偏振快速檢測方法

2023-04-23 19:21:51

基於核酸外切酶ｉ循環酶切放大的赭麴黴毒素a螢光偏振快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於核酸外切酶Ｉ循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，該方法利用核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針雜交形成雙鏈複合物，該複合物能夠與OTA發生特異性鏈置換反應並釋放出螢光標記探針和OTA-核酸適配體複合物，從而引發ExoI對單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及OTA-核酸適配體複合物的酶切反應釋放出OTA；釋放出的OTA能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環，實現信號放大。本發明的方法解決現有依賴抗體的OTA快檢方法易出現交叉反應、靈敏度不高、操作繁雜、成本過高等缺點，具有操作簡單，方便快捷的優點，僅需15min即可實現對OTA的快速檢測，靈敏度可達0.5nM。
【專利說明】基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學以及螢光檢測【技術領域】，具體而言，涉及利用反應體系螢光偏振值的變化對赭麴黴毒素A進行檢測的方法，特點在於基於核酸適配體的鏈置換反應和基於核酸外切酶I的信號放大機制的應用，以及該方法檢測速度快、靈敏度高及操作性強。
【背景技術】
[0002]赭麴黴毒素A (OchratoxinA，0ΤΑ)在自然界中廣泛存在，主要由麴黴和靑黴等產生，常見的易受OTA汙染的農產品主要包括小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等糧食，以及花生、蔬菜(豆類)等農作物。毒理學研究表明，OTA具有肝腎毒性以及很強的致畸、致癌和致突變作用等多種毒性，對動物和人體健康具有很大的潛在危害。鑑於此，世界各國紛紛制定出糧食及飼料中OTA的限量標準，如歐盟規定穀物原料OTA最大限量5 μ g/kg，穀物加工製品最大限量3μ g/kg ;我國規定穀類、豆類中OTA最大限量5 μ g/kg，以保護人民健康和調控進出口糧食。
[0003]目前檢測OTA的主要方法是薄層色譜法(TLC)、放射免疫法(RIA)、酶聯免疫吸附法(ELI SA )、膠體金免疫層析分析法(GICA )、高效液相色譜-螢光檢測法(HPLC-FD )、高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)、毛細管電泳技術(CE)等。基於HPLC的分析方法是目前主要的實驗室檢測方法，靈敏度高，但所需儀器昂貴、前處理複雜、檢測成本高，不適合大量樣品的快速篩查。TLC法簡單，檢測成本低，但是靈敏度較差、重現性不好且無法實現自動化；ELISA法靈敏度高、特異性好，但其操作過程比較複雜繁瑣。
[0004]近年來，有關螢光偏振免疫分析技術(FPIA)的報導逐年增加，應用範圍涵蓋臨床檢驗、毒品分析、農藥殘留分析、環境和食品檢測等方面，作為一種均相檢測方法與其它非均相方法相比具有顯著的優點:測定在溶液中進行，避免了反覆多次的洗滌步驟，且易於實現自動化和提高分析方法的精度；僅需數分鐘甚至數秒鐘孵育後即可測定螢光偏振光強度，檢測速度快，有利於大批量樣品的分析測試；不受內濾作用的影響，對於有顏色和渾濁的溶液仍能很好地完成檢測任務；不需要使用放射性同位素，避免了汙物不易處理的難題等。FPIA的主要局限性在於:針對不同的抗原靶標，首先要製備或得到相應的單克隆或多克隆抗體，製備周期相當長，且成本較高；由於抗體本身具有不穩定性，不易保存，易失活，容易導致檢測結果穩定性差；抗體作為一種經過體內篩選得來的蛋白類分子識別元件，很難避免交叉反應，易出現假陰性、假陽性結果；常規FPIA的檢出限一般在納摩爾以上，靈敏度有待進一步提高。以上這些不利因素都影響了螢光偏振免疫分析方法的發展。所以，有待進一步完善或尋求相關替代分析技術。
[0005]核酸適配體(Aptamer),是通過模擬自然進化過程的體外人工篩選技術-指數
富集配體系統進化技術，篩選得到的具有識別功能的新型核酸分子，其本質是由一段單鏈寡核苷酸(20?60鹼基)，通過摺疊能夠形成特有的三維結構，從而與靶分子高親和力、高特異性結合。核酸適配體的識別特性與抗體相似，但與抗體相比具有很多獨特的優勢:可在體外篩選(不依賴生物體)，靶分子範圍廣(從金屬離子、毒素等小分子到酶、蛋白等生物大分子，甚至病毒、細菌和細胞等生物體)，分子量小(無免疫原性)，容易進行化學合成、改造與標記，生物化學穩定性好，能可逆地進行變性與復性，還能利用酶進行擴增、剪切等後續信號放大處理。各種基於核酸適配體的分析、檢測方法與技術已呈現出快速、靈敏、方便、低成本等優點，在生物醫學應用中已經顯示出廣闊的應用前景，但在真菌毒素檢測方面的應用卻相對較少，主要是由於已經篩選出來的各種真菌毒素核酸適配體較少的緣故。所以，本發明利用核酸適配體代替抗體，將其作為分子識別元件的獨特優勢與螢光偏振均相分析技術的優勢相結合，同時引入核酸外切酶I循環酶切的信號放大機制，開發了基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，能夠很好地解決目前依賴抗體的OTA快速檢測所面臨的難題。

【發明內容】

[0006]為了解決目前OTA檢測方法的靈敏度不高，操作繁雜，成本過高的缺點，本發明提供了一種基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法。為了實現本發明的目的，擬採用如下技術方案:
[0007]本發明一方面涉及一種基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，其特徵在於包括以下步驟:
[0008](I)赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針雜交形成核酸適配體雙鏈複合物，所述的赭麴黴毒素A核酸適配體序列為5』-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3』 ；單鏈螢光標記寡核苷酸探針(FAM-probe)序列為5』 -FAM-CAGAGCCTAC-3』 ；
[0009](2)鏈置換反應和酶切反應的循環:赭麴黴毒素A與核酸適配體雙鏈複合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物，從而引發核酸外切酶I對單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物的酶切反應釋放出赭麴黴毒素A ;釋放出的赭麴黴毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環一定次數；
[0010](3)檢測反應體系以及空白對照的螢光偏振強度:空白對照的螢光偏振強度值為Po，反應體系的螢光偏振強度值為P，根據螢光偏振強度值的變化值AP=Ptl-P的標準曲線確定待檢測體系中赫麴黴毒素A的濃度。
[0011]在本發明的一個優選實施方式中，所述的步驟(I)的步驟為將赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針進行預處理:95°C變性5min，25°C冷卻30min。
[0012]在本發明的一個優選實施方式中，所述的步驟(2)的步驟為取50 μ LlOmMTris-HCl反應緩衝溶液(ΡΗ8.5)，其中包含50ηΜ的核酸適配體雙鏈複合物，0.8U/μ L的核酸外切酶I以及待檢測的赭麴黴毒素Α，室溫反應15min，以使赭麴黴毒素A與核酸適配體雙鏈複合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物；釋放出的赭麴黴毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環一定次數。
[0013]在本發明的一個優選實施方式中，所述的步驟(3)的步驟為將反應後的溶液用IOmMTris-HCl反應緩衝液(pH8.5)調整反應體積為100 μ L，放入螢光光譜儀，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，測定其螢光偏振強度並記錄螢光偏振強度值的變化。
[0014]在本發明的一個優選實施方式中，所述的待測樣品為小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等糧食以及花生、豆類蔬菜等農作物中的赭麴黴毒素A。
[0015]本發明通過按上述步驟對配製的不同濃度赭麴黴毒素A標準液進行檢測，記錄各標準溶液樣品所產生的螢光偏振強度值的變化值(AP=Ptl-P);用△ P對標準溶液中赭麴黴毒素A濃度作圖獲得標準曲線，未知樣品中赭麴黴毒素A所產生的螢光偏振強度的變化值與標註曲線對照確定其濃度。
[0016]綜上所述本發明的有益效果具體體現在以下方面:
[0017]I)本發明採用赭麴黴毒素A核酸適配體作為分子識別元件，利用螢光偏振檢測技術構建的OTA檢測方法，具有特異性高的特點，同事大大降低了檢測OTA真菌毒素的成本，提高了檢測方法的靈敏度，而且操作簡單方便；
[0018]2)本發明基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，在赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針雙鏈複合物預先形成後，僅需15min即可實現對OTA的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:基於核酸外 切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法的現象圖:其中(a)為 Aptamer+FAM-probe, (b)為 Aptamer+FAM-probe+OTA,(c)為 Aptamer+FAM-probe+ExoI, (d)為 Aptamer+FAM-probe+OTA+ExoI,(e)為Aptamer+FAM-probe+AFBl ο [OTAaptamer] =50nM, [OTA] = [AFB1] =IOOnM, AFBl 為黃麴黴毒素BI。
[0020]圖2:對赭麴黴毒素A標準品溶液進行檢測的工作曲線圖:(A)濃度範圍為O-1nM ；(B)濃度範圍為1-50ηΜ。。
【具體實施方式】
[0021]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0022](I)赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針雜交形成核酸適配體雙鏈複合物
[0023]首先將赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針進行預處理:95 °C變性5min, 25 V冷卻30min。赭麴黴毒素A核酸適配體(aptamer)序列為5，-CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3，;單鏈螢光標記寡核苷酸探針(FAM-probe )序列為5， -FAM-CAGAGCCTAC-3，。
[0024](2)鏈置換反應和酶切反應的循環
[0025]取50 μ LlOmMTris-HCl反應緩衝溶液(ρΗ8.5)，其中包含50ηΜ的核酸適配體雙鏈複合物，0.8υ/μ L的核酸外切酶I以及適量濃度的赭麴黴毒素Α，室溫反應15min，以使赭麴黴毒素A與核酸適配體雙鏈複合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物；從而引發核酸外切酶I對單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物的酶切反應釋放出赭麴黴毒素A，同時導致反應體系的螢光偏振強度的變化；釋放出的赭麴黴毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環，反應體系的螢光偏振強度變化不斷增大，從而實現信號放大。反應體系螢光偏振強度變化的大小與赭麴黴毒素A的濃度有關，據此可實現對赭麴黴毒素A的檢測。
[0026]將反應後的溶液用IOmMTris-HCl反應緩衝液(pH8.5)調整反應體積為100 μ L，放入螢光光譜儀，以490nm為激發波長、掃描窗口寬度60s，掃描速度12000nm/min，激發、發射狹縫寬度5.0nm,測定發射波長525nm處螢光偏振強度值的變化:空白對照的螢光偏振強度值(Ptl)最大，隨著赭麴黴毒素A濃度的增加反應體系的螢光偏振強度值(P)逐漸降低。
[0027]如圖1所示，赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針雜交形成的核酸適配體雙鏈複合物，因總體分子量較大所以具有較大的螢光偏振值。在OTA存在的情況下，赭麴黴毒素A核酸適配體與OTA特異性結合，發生特異性鏈置換反應，產生游離的單鏈螢光標記寡核苷酸探針。游離的單鏈螢光標記寡核苷酸探針與核酸適配體雙鏈複合物相比分子量較小，從而導致反應體系的螢光偏振值降低。與此同時，體系中的核酸外切酶I對單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物進行酶切反應，一方面導致反應體系的螢光偏振值進一步降低；另一方面釋放出赭麴黴毒素A，從而引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環，結果導致反應體系的螢光偏振強度變化不斷增大，從而實現信號放大。而在黃麴黴毒素BI (AFBl)存在的情況下，赭麴黴毒素A核酸適配體不識別AFB1，因此不能發生鏈置換反應，核酸適配體雙鏈複合物不會解離，所以反應體系螢光偏振強度不會改變。
[0028]按上述(I)、(2)步驟對配製的不同濃度赭麴黴毒素A標準液進行檢測，記錄各標準溶液樣品所產生的螢光偏振強度值的變化值(AP=Ptl—P);用ΛΡ對標準溶液中赭麴黴毒素A濃度作圖獲得標準曲線(圖2)，由圖可知R2X).99，說明赭麴黴毒素A的濃度與本發明所述檢測方法的螢光偏振值之間具有高度的正相線性關係，未知樣品中赭麴黴毒素A所產生的螢光偏振強度的變化值與標註曲線對照就可以確定其濃度。
[0029]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針雜交形成核酸適配體雙鏈複合物，所述的赭麴黴毒素A核酸適配體序列為5』 -CTTCGGGTGTGGGTGGCATTCCGGTAGGCTCTG-3』 ；單鏈螢光標記寡核苷酸探針(FAM-probe)序列為5』 -FAM-CAGAGCCTAC-3』 ； (2)鏈置換反應和酶切反應的循環:赭麴黴毒素A與核酸適配體雙鏈複合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物，從而引發核酸外切酶I對單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物的酶切反應釋放出赭麴黴毒素A ;釋放出的赭麴黴毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環一定次數； (3)檢測反應體系以及空白對照的螢光偏振強度:空白對照的螢光偏振強度值為Ptl，反應體系的螢光偏振強度值為P，根據螢光偏振強度值的變化值△ P=Ptl—P的標準曲線確定待檢測體系中赭麴黴毒素A的濃度。
2.根據權利要求1所述的基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，所述的步驟(1)的步驟為將赭麴黴毒素A核酸適配體與單鏈螢光標記寡核苷酸探針進行預處理:95°C變性5min，25°C冷卻30min。
3.根據權利要求1所述的基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，所述的步驟(2)的步驟為取50 μ LlOmMTris-HCl反應緩衝溶液(ρΗ8.5)，其中包含50ηΜ的核酸適 配體雙鏈複合物，0.SU/μ L的核酸外切酶I以及待檢測的赭麴黴毒素Α，室溫反應15min，以使赭麴黴毒素A與核酸適配體雙鏈複合物發生特異性鏈置換反應，產生單鏈螢光標記寡核苷酸探針以及赭麴黴毒素A核酸適配體複合物；釋放出的赭麴黴毒素A能夠引發下一個鏈置換反應和酶切反應，依次循環一定次數。
4.根據權利要求1所述的基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，所述的步驟(3)的步驟為將反應後的溶液用IOmMTris-HCl反應緩衝液(pH8.5)調整反應體積為100 μ L，放入螢光光譜儀，以490nm為激發波長、525nm為發射波長，測定其螢光偏振強度並記錄螢光偏振強度值的變化。
5.根據權利要求1-4任意一項所述的基於核酸外切酶I循環酶切放大的赭麴黴毒素A螢光偏振快速檢測方法，所述的待測樣品為小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等糧食以及花生、豆類蔬菜等農作物中的赭麴黴毒素A。
【文檔編號】G01N33/533GK103926397SQ201410074665
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】劉繼紅, 王紅旗, 張軍鋒, 張玲, 周玲, 王建, 王靜, 尹海燕, 祁玉峰 申請人:河南省農業科學院