一種抗寒香蕉種質的篩選方法
2023-04-23 15:20:36 5
一種抗寒香蕉種質的篩選方法
【專利摘要】本發明屬於香蕉愈傷組織輻射誘變育種領域，具體涉及一種抗寒香蕉種質的篩選方法，利用該方法能高效快速篩選香蕉抗寒突變種質。發明包括香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理、愈傷組織低溫篩選、分化芽低溫篩選、香蕉幼苗低溫篩選、香蕉抗寒生根苗馴化及移栽等內容組成。本方法由於採用了三次低溫篩選技術，尤其是在香蕉雄花誘導的愈傷組織時期就開始採用低溫篩選技術，極大的提高了抗寒突變種質的篩選效率，縮短了培育香蕉抗寒品種的周期。
【專利說明】一種抗寒香蕉種質的篩選方法
【技術領域】[0001]本發明屬於香蕉愈傷組織輻射誘變育種領域，具體涉及一種抗寒香蕉種質的篩選方法。
技術背景
[0002]香蕉是典型的熱帶亞熱帶果樹，廣泛分布於熱帶和南亞熱帶地區。我國是世界香蕉主產國之一，種植區域分布於廣東、海南、廣西、福建、雲南及臺灣等省區。近年來由於氣候條件的變化，我國廣東、廣西、雲南等省的香蕉種植經常遭受寒害威脅，造成大面積減產和絕收，給廣大香蕉果農造成嚴重經濟損失。雖然生產上針對寒害建立了一些預防措施，但是對於較嚴重的寒害，其預防效果還是不理想，因此選育香蕉抗寒品種是解決香蕉寒害問題的根本出路。目前栽培的香蕉大部分是三倍體，單性結實，具有高度的不育性，無法通過常規雜交選育抗寒新品種，因此利用6tlCo- Y射線輻射誘變香蕉，培育香蕉突變體，從突變體中篩選具有抗寒突變的新種質，再培育獲得新品種是香蕉抗寒育種的重要途徑之一。
[0003]目前國內外對香蕉輻射誘變進行抗寒育種研究報導文獻較少，在輻射誘變材料的選擇上主要採用香蕉吸芽、香蕉組培芽或者香蕉幼苗，其方法主要缺點在於需要處理的突變材料多，篩選周期長、效率低。本發明一種抗寒香蕉種質的篩選方法選取香蕉未成熟雄花愈傷組織為輻射突變材料，採用愈傷組織低溫篩選、分化芽低溫篩選、香蕉幼苗低溫篩選的三次低溫篩選技術，提高了抗寒突變種質的篩選效率，縮短了培育香蕉抗寒品種的周期。
【發明內容】
[0004]一種抗寒香蕉種質的篩選方法的
【發明內容】
包括香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理、愈傷組織低溫篩選、分化芽低溫篩選、香蕉幼苗低溫篩選、香蕉抗寒生根苗馴化及移栽等內容組成。
[0005](I)香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理
[0006]香蕉未成熟雄花誘導的愈傷組織經6tlCo- Y射線輻射處理，愈傷組織輻射吸收劑量為 60-70Gy。
[0007](2)愈傷組織低溫篩選
[0008]經過輻射處理的愈傷組織轉入人工氣候箱進行黑暗培養，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C二個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為10天，進行低溫篩選。在10°C低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經過低溫篩選後成活的愈傷組織進行分化培養。愈傷組織繼代培養基為MS+1.0mg/L生物素+100mg/L穀氨醯胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L 鹿糖+5.5g/L 瓊脂 pH = 5.3 的固體培養基,每 10 天更換一次培養基。
[0009](3)愈傷組織的分化培養
[0010]經過低溫篩選後成活的愈傷組織接種於MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L鹿糖+5.5g/L瓊脂pH = 5.8的分化固體培養基上。在26°C，光強度為15001x條件下培養，每天光培養12小時，黑暗培養12小時。每10天更換一次分化固體培養基，連續培養20-30天產生分化芽。[0011](4)分化芽低溫篩選
[0012]分化芽轉入人工氣候箱，設置人工氣候箱光強度為15001x，每天光培養12小時，黑暗培養12小時，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C三個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為14天，進行低溫篩選。在TC低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經過低溫篩選後成活的分化芽，在26°C培養21天，分化芽生長成香蕉幼苗。
[0013](5)香蕉幼苗低溫篩選
[0014]將香蕉幼苗轉入人工氣候箱。設置人工氣候箱光強度為17001x,每天光培養18小時，黑暗培養6小時，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C、4°C四個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為10天，進行香蕉幼苗低溫篩選。在4°C低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經過低溫篩選後成活的香蕉幼苗，將香蕉幼苗接種於MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊5.5g/L pH = 5.8的生根培養基上，連續培養30天，誘導出較高質量的根系，成為香蕉抗寒生根苗。
[0015](6)香蕉抗寒生根苗馴化及移栽
[0016]香蕉抗寒生根苗經2-3天的自然光煉苗後，洗淨根部培養基，移栽於營養袋中，在大棚育苗2-3個月，再移栽入大田定植，做為抗寒香蕉種質保存。
【具體實施方式】
[0017]本發明將結合下面的實例做進一步詳述。
[0018]I 材料
[0019]中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所香蕉生物技術研究組提供香蕉未成熟雄花愈傷組織。
[0020]2香蕉未成熟雄花愈傷組織輻射誘變處理
[0021]香蕉未成熟雄花愈傷組織經6tlCo-Y射線輻射處理，愈傷組織輻射吸收劑量為60-70Gy，輻射處理由四川省農業科學院生物技術核技術研究所完成。
[0022]3愈傷組織低溫篩選
[0023]經過輻射處理的愈傷組織轉入人工氣候箱進行黑暗培養。設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C二個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為10天，進行低溫篩選。在10°C低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經低溫篩選成活的愈傷組織進行分化培養。愈傷組織繼代培養基為MS+1.0mg/L生物素+100mg/L穀氨醯胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L鹿糖+5.5g/L瓊脂pH = 5.3的固體培養基,每10天更換一次培養基。
[0024]4愈傷組織的分化培養
[0025]經過低溫篩選成活的愈傷組織接種於MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂pH =5.8的固體培養基上。在溫度26°C，光強度15001x條件下培養，每天光培養12小時，黑暗培養12小時。每10天更換一次培養基，連續培養20-30天，至產生分化芽。[0026]5分化芽低溫篩選[0027]分化芽轉入人工氣候箱。設置人工氣候箱光強度為15001x，每天光培養12小時，黑暗培養12小時，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C三個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為14天，進行低溫篩選。在TC低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經低溫篩選後成活的分化芽，在26°C培養21天，分化芽生長成香蕉幼苗。
[0028]6香蕉幼苗低溫篩選
[0029]將香蕉幼苗轉入人工氣候箱。設置人工氣候箱光強度為17001x,每天光培養18小時，黑暗培養6小時，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C、4°C四個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為10天，進行香蕉幼苗低溫篩選處理。在4°C低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經低溫篩選後成活的香蕉幼苗，將香蕉幼苗苗接種於MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L pH = 5.8的培養基上，連續培養30天至誘導出較高質量的根系，成為香蕉抗寒生根苗。
[0030]7香蕉抗寒生根苗馴化及移栽
[0031 ] 香蕉抗寒生根苗經2-3天的自然光煉苗後，洗淨根部培養基，移栽於營養袋中，在大棚育苗2-3個月。
[0032]8香蕉抗寒生根苗移栽後性狀觀察和生理生化指標測定
[0033]①移栽成活率統計
[0034]香蕉抗寒生根苗移栽於營養袋中2個月後統計移栽成活率為51.47%，沒經歷低溫篩選的對照香蕉苗移栽成活率為98.67%，說明經過低溫篩選的植株較難適應常溫介質並恢復生長。
[0035]②株高與葉片數測定
[0036]株高與葉片數是描述香蕉幼苗生長速度快慢的重要指標。香蕉抗寒苗移栽2個月後測量平均株高為9.60釐米，平均葉片數為7.83片。沒經歷低溫篩選的對照香蕉苗移栽2個月後測量平均株高為20.10釐米，平均葉片數為9.33片，說明篩選出的抗寒苗生長速度較慢。
[0037]③抗寒苗低溫脅迫生理生化指標的測定
[0038]香蕉抗寒生根苗移栽於營養袋中3個月後,放置於人工氣候箱,設置人工氣候箱光強度為17001x，每天光培養18小時，黑暗培養6小時，設置人工氣候箱溫度為7°C，低溫脅迫2天。測定過氧化物酶(P0D)、過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)含量。結果表明香蕉抗寒苗植株過氧化物酶(POD)酶活力是對照組1.4倍；香蕉抗寒苗植株過氧化氫酶(CAT)酶活力是對照組1.78倍；香蕉抗寒苗植株丙二醛(MDA)含量僅為對照組32.3%，表明香蕉抗寒苗植株具有較強的抗寒能力。
【權利要求】
1.一種抗寒香蕉種質的篩選方法，其特徵包括以下步驟: 1)、香蕉未成熟雄花愈傷組織的輻射處理 香蕉未成熟雄花誘導的愈傷組織經6tlCo- Y射線輻射處理，愈傷組織輻射吸收劑量為60-70Gy ； 2)、愈傷組織低溫篩選 經過輻射處理的愈傷組織轉入人工氣候箱進行黑暗培養，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C二個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為10天，進行低溫篩選，在10°C低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經過低溫篩選後成活的愈傷組織進行分化培養； 3)、愈傷組織的分化培養 經過低溫篩選後成活的愈傷組織接種於分化固體培養基上，連續培養20-30天產生分化芽； 4)、分化芽低溫篩選 分化芽轉入人工氣候箱，設置人工氣候箱光強度為15001x，每天光培養12小時，黑暗培養12小時，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C三個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為14天，進行低溫篩選，在TC低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經過低溫篩選後成活的分化芽，在26°C培養21天，分化芽生長成香蕉幼苗； 5)、香蕉幼苗低溫篩選 將香蕉幼苗轉入人工氣候箱，設置人`工氣候箱光強度為17001x,每天光培養18小時，黑暗培養6小時，設置人工氣候箱溫度為14°C、10°C、7°C、4°C四個溫度梯度，採用先高溫後低溫的原則，每個溫度處理時間周期為10天，進行香蕉幼苗低溫篩選，在4°C低溫篩選階段結束後逐步恢復溫度至26°C，選擇經過低溫篩選後成活的香蕉幼苗，將香蕉幼苗接種於生根培養基上，連續培養30天，誘導出較高質量的根系，成為香蕉抗寒生根苗； 6)、香蕉抗寒生根苗馴化及移栽 香蕉抗寒生根苗經2-3天的自然光煉苗後，洗淨根部培養基，移栽於營養袋中，在大棚育苗2-3個月，再移栽入大田定植，做為抗寒香蕉種質保存。
【文檔編號】A01H4/00GK103651149SQ201410006666
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2014年1月8日 優先權日:2014年1月8日
【發明者】張建斌, 徐碧玉, 金志強, 賈彩紅, 劉菊華, 王安邦, 王卓, 苗紅霞, 王甲水 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所