一種與草甘膦抗性相關的ⅱ型epsp合酶保守模體的製作方法

2023-04-23 23:10:16 2

專利名稱：：一種與草甘膦抗性相關的ⅱ型epsp合酶保守模體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種II型EPSP合酶的序列模體。
背景技術：
：EPSP合酶(5-烯醇式丙酮醯莽草酸-3-磷酸合酶，EC2.5丄19)作為莽草酸合成途徑的第六位酶，是除草劑草甘膦作用的靶標酶，對植物、真菌、細菌和部分病原寄生蟲合成芳香族胺基酸及其它芳香族代謝產物必不可少的。由於哺乳動物體內不存在莽草酸途徑，因此EPSP合酶成為研發新型除草劑和新型抗菌素等的靶標酶。EPSP合酶分I型和II型兩種類型，其中II型EPSP合酶通常都源於草甘膦耐受的微生物，有較高的底物PEP親和性和催化效率。如源自根癌膿桿菌CP4的EPSP合酶，不受草甘膦抑制並且為耐受草甘膦轉基因作物提供了一個新的作用模式。如果能發現II型EPSP合酶的高度保守序列模體，可以為研發新型抗草甘膦植物、研發新型除草劑和新型抗菌素等提供方便的手段。已有人做了此方面的工作，如Monsanto公司利用定點突變方法對CP4EPSP合酶與草甘膦抗性相關的模體進行了研究，發現了Arg-X-His-X-Glu、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K和Asn-X-Thr-Arg四個序列模體在II型酶中高度保守，通過替換X位點胺基酸會極大影響該型酶對草甘膦的抗性。
發明內容本發明的目的是提供一種新的II型EPSP合酶序列模體。本發明在II型EPSP合酶中發現了一個新的高度保守的序列模體(sequencemotif)，其胺基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下胺基酸中任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His,Asp或Glu。實驗證實，除X外，所述序列模體中其它四個胺基酸對酶活力至關重要。可作為化合物攻擊的靶位點，為抗菌新藥物的合成奠定基礎；所述序列模體中，X是不保守位點胺基酸，實驗證實，用不同的胺基酸替換後可提高或降低除草劑草甘膦的抗性。為II型EPSP合酶應用於抗除草劑草甘膦提供新的改造位點。如本發明使用A1501EPSP合酶作為研究實例，其X位點Asn替換為Ser等胺基酸可提高除草劑草甘膦抗性，替換為Trp後對草甘膦抗性減弱。為證實本發明的效果，進行了如下實驗1、II型EPSP合酶多序列比對所有II型EPSP合酶胺基酸序列比對後，發現了新的序列模體Arg-Pro-Met-X-Arg。(見實施例1)此模體存在於已知的所有II型EPSP合酶中，其中Arg、Pro、Met、Arg四個胺基酸在所有II型EPSP合酶序列中完全保守。X位點可為二十種胺基酸替換。2、保守位點胺基酸的替換新序列模體中四個保守的胺基酸進行任意胺基酸替換，酶功能互補試驗結果顯示均失去酶活力。(見實施例2)3、非保守位點胺基酸替換非保守位點胺基酸替換後，酶功能互補試驗結果顯示功能可互補。(見實施例3)4、草甘膦抗性測定將X位點逐個進行草甘膦抗性測定，結果顯示此位點的替換可提高或降低酶對除草劑草甘膦的抗性。(見實施例4)經測定，保守位點胺基酸替換後，酶失去功能；非保守胺基酸替換後，酶功能存在，對除草劑草甘膦抗性提高或降低。本發明所提供的新EPSP合酶具有如下用途1、培育高抗草甘膦植物由於非保守位點X胺基酸替換後可提高EPSP合酶對除草劑草甘膦的抗性，故此可用於培育高抗草甘膦植物。比如，新II型EPSP合酶構建與pUC18載體構建的新重組載體可用於酶功能互補實驗，以及草甘膦抗性實驗。2、研發新的抗菌素新II型EPSP合酶模體可作為設計抗菌藥物攻擊的靶位點。由於據目前報導的II型EPSP合酶均源自微生物，人和其它動物不存在此酶，故此可將新II型EPSP合酶新模體中的保守胺基酸作為新抗菌化合物攻擊的靶位點，為研發新的抗菌素奠定基礎。圖1是pUCaroAA1501重組載體具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於舉例說明本發明的方法，而不用於限制本發明的範圍。凡未註明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件。實施例1II型EPSP合酶多序列比對本發明在NCBI非冗繁資料庫中，檢索並下載所有II型EPSP合酶胺基酸序列，目前為止共有482條，使用MEGA4.0軟體的CLUSTAL程序進行多序列比對。比對結果顯示共有五個保守序列模體即Arg-X-His-X-Glu、Arg-Pro-Met-X-Arg、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K禾PAsn-X-Thr-Arg，其中發現Arg-Pro-Met-X-Arg(其中X為如下二十種常見胺基酸的任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp，Glu。)為新序列模體。實施例2保守位點胺基酸的替換本發明選用A1501EPSP合酶作用研究實例，使用Stratagene公司的QuickChange^定點突變試劑盒，根據該試劑盒說明，使用QuickChang/'引物設計程序4設計重疊引物，將突變位點設計在對其核苷酸序列進行鹼基突變，達到胺基酸替換的目的。將Argl27，Pro128，Metl29，Argl31(序列位置按照A1501EPSP合酶胺基酸序列標記)四個胺基酸分別替換為任意其它常見胺基酸。並採用酶功能互補試驗驗證，結果顯示轉化子未能生長，即酶功能均不能回補。具體替換胺基酸見表l。所述酶功能互補試驗方法為大腸桿菌EPSP合酶缺失突變株ER2799作為受體菌。將野生型或突變體酶與pUC18用限制性內切酶BamHI和HindlII雙酶切，然後16。C連接過夜，構建功能互補載體(見圖l)。採用熱激轉化的方法，將重組載體導入受體菌，塗於M9固體限制性培養基平板，培養48小時。實施例3非保守位點胺基酸替換本發明選用A1501EPSP合酶作用研究實例，採用定點突變PCR方法對其核苷酸序列進行鹼基突變，達到胺基酸突變的目的。將Asnl30位點(序列位置按照A1501EPSP合酶胺基酸序列標記)採用任意常用胺基酸替換四個胺基酸分別替換為任意，並採用酶功能互補試驗驗證，結果顯示酶功能均可回補。具體替換胺基酸見表l。酶功能互補試驗方法參見實施例2方法部分。表1新II型EPSP合酶序列模體胺基酸替換實驗結果5tableseeoriginaldocumentpage6注新序列模體胺基酸位置按照A1501EPSP合酶位置標記；[O(HO]"-"表示功能不能互補；"+"表示功能可互補。實施例4草甘膦抗性測定將導入野生型或突變體酶的受體菌接種至M9液體限制性培養基中。分別加入終濃度為O，20，50，100，200mM草甘膦鈉鹽。37°C，200rpm培養48小時，用分光光度計在OD6。。nm檢測菌液濃度。Asnl30位點胺基酸替換結果顯示突變可使酶的抗性提高或降低。具體數據見表2。表2非保守位點X突變結果tableseeoriginaldocumentpage7權利要求一種II型EPSP合酶中的序列模體，其胺基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下胺基酸中任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。2.—種II型EPSP合酶胺基酸序列，其特徵是含有權利要求1所述模體的胺基酸序列。3.權利要求2所述EPSP合酶在培育高抗草甘膦植物中的用途。4.權利要求2所述EPSP合酶在設計抗菌藥物靶位點中的用途。5.—種重組載體，包含編碼權利要求2所述合酶胺基酸序列的基因。全文摘要本發明涉及一種與草甘膦抗性相關的II型EPSP合酶保守模體，其中高度保守的四個胺基酸對酶活力至關重要，可作為化合物攻擊的靶位點，其胺基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X選自以下胺基酸中任意一種Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。不保守位點胺基酸可進行替換，以提高或降低除草劑草甘膦的抗性。本序列模體的發現為新藥物的合成奠定了基礎，為II型EPSP合酶應用於抗除草劑草甘膦提供了新的改造位點。文檔編號C12N15/82GK101691563SQ20091009352公開日2010年4月7日申請日期2009年10月12日優先權日2009年10月12日發明者平淑珍,張維,李亮,林敏,燕永亮,陸偉,陳明申請人:中國農業科學院生物技術研究所