植物根系原位動態觀察和測定方法
2023-04-23 23:17:56
專利名稱：植物根系原位動態觀察和測定方法
技術領域：
本發明屬於根系生物學、植物營養學、作物栽培學和植物生理學領域，具體涉及一種植物根系原位動態觀察和測定方法。
背景技術：
根系是植物吸收養分和水分的主要器官，植物根構型是指根系在
生長介質中的空間分布(Lynch, 1995)。不同根構型能顯著影響養分水分的吸收利用(Fitter, 1987; Bowman et al, 1998; Doussan et al， 1998;Liao et al, 2001; Lambers et al， 2006; Skaggs and Shouse， 2008)、碳源分配(Nielsen et al， 1994; Bidel et al, 2000; Coll et al, 2008)以及適應環境脅迫的能力(Miller, 1986; Al-Ghazi et al， 2003)等重要生理功能。因此，研究植物根系三維構型對植物養分水分吸收、品種篩選等具有十分重要的意義。所以近年來植物根系三維構型研究越來越受人們重視，已從表型、生理和分子等不同水平全面開展研究。但是目前國內外對植物根系三維構型的定量化研究的報導極少，根系三維構型定量化研究的主要困難是因為根系在土壤等生長介質中的隱蔽性造成了觀察根構型的困難，以及根系本身構型的複雜性和重疊性造成測量精度的限制(馬新明等，2003; Zhuetal, 2006)。迄今己有報導中的根系三維構型數據大多是破壞性採樣獲得的數據，並非原位數據。而且大多根構型與養分效率的研究屬於定性研究，對於根構型與養分效率的定量研究還鮮見報導。此外，目前已有的研究大部分都是某一時刻的 構型數據與養分效率的研究，動態的原位根構型數據與養分效率的研究則
未見技術報導。
發明內容
本發明的目的是克服現有根系形態構型觀察和測定方法的局限性，提供一種植物根系原位動態觀察和測定方法，在不破壞植物根系三維構型及其周圍生長環境的前提下，直接將植物根系原位生長狀況進行三維可視化，並結合計算機圖像分析，從而對根系的形態和構型進行原位觀察和測定。
本發明目的通過以下技術方案予以實現-
提供一種植物根系原位動態觀察和測定方法，包括以下步驟
(1) 設計透明的栽培容器和生長介質；
(2) 將種子滅菌和催芽，出芽後移苗到步驟(1)所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生長介質中自然生長；
(3) 採用三維雷射掃描儀對根系進行掃描，進行根系三維構型的原位觀察和圖像捕獲，完成圖像採集、重建和模擬。
上述步驟(1)所述透明的栽培容器優選透明的圓柱形容器，容器設置有一個可打開的蓋子，蓋子中間設置一個貫穿洞。根據不同的植物容器大小有所不同，本發明優選採用高20cm、直徑12cm的圓柱形有機玻璃容器，貫穿洞優選直徑為20mm的圓洞。
上述步驟(1)所述的透明的生長介質為透明培養基。透明培養基是採用與植物適應的相應營養液+0.15°/^tPhytagelTM。
所述透明培養基配置步驟如下(A) 將培養基攪拌均勻，並調節pH值；有機玻璃容器採用紫外線滅菌1小時，備用；
(B) 使用高壓滅菌鍋將培養基培養基在12rC滅菌30分鐘；
滅菌結束儘快(保證培養基未開始凝固)將培養基倒入上述已滅菌的有機玻璃容器內，以上操作在超淨工作檯進行。
(C) 靜置冷卻待培養基凝固，大概需要4小時左右；
其中，在培養基快凝固時，不能挪動容器，以防止培養基凝固后里面產生氣泡。
對於分層磷處理培養基，需等下層培養基完全凝固後再倒上層培養基，並確保上層培養基倒入時的溫度不能太高，但也不能太低以至
於發生凝固，本發明優選設定上層培養基倒入時溫度為5(TC左右，，
以保證下層培養基不會沒有融化，上層培養基不會很快發生凝固。
上述步驟(3)掃描的方法是從移苗後第1天到第20天每24小時利用三維雷射掃描儀掃描植株根系一次，掃描範圍為0° 360Q，旋轉方向的掃描精度為0.18°,上下移動方向的掃描精度為O.lmm。
實現植物根系三維構型原位動態重建及模擬方法的系統包括三維雷射掃描儀、計算機和圖像分析軟體三部分，各組份具體敘述如下
第一部分，三維雷射掃描儀。本發明優選採用日本產的RolandLPX-1200三維雷射掃描儀，有效掃描範圍為130.0 mm(直徑)x
203.2mm (高)，在旋轉方向掃描精度最高可達0.18Q，在上下移動方向精度最高可達0.1mm。三維雷射掃描儀LPX-1200內設有一個旋轉臺的，旋轉臺上放置要掃描的植物，放置時需要注意使要掃描的物體中心與旋轉臺的中心對齊，掃描時旋轉臺帶著植物一起旋轉，三維雷射掃描儀利用精確的非接觸式雷射傳感器進行掃描，通過發射雷射束到要掃描的植物根系表面，由傳感器探測從物體表面反射的光量來測定物體的坐標，速度快、精度高、操作靈活。
第二部分，計算機。計算機的配置需要Pentium 4以上，內存1GB以上，Windows XP系統，以保證圖像分析系統順利進行。
第三部分，圖像分析軟體。包括圖像採集、重建和模擬，利用三維雷射掃描儀結合三維雷射掃描儀系統的Dr.PICZA3軟體採集植物根系三維構型圖像，採集時間隨掃描植株根系的大小和掃描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，採集的時間就越大。 一般發芽後6
天的大豆根系採用掃描精度在旋轉方向為0.18G，在上下移動方向精度為0.1mm時，圖像掃描時間需要60分鐘左右。發芽後12天的大豆根系採用以上相同的精度掃描時需要90分鐘左右。
由於三維雷射掃描儀獲得的數據是在三維空間中無規則、隨機分布的。其特點是數據量龐大、噪聲點多、數據密集、數據點散亂分布(因此稱為"點雲"數據)，表面存在一些"沙洞"。若採用傳統的樣條編輯方法模擬，模擬結果不是很理想，不適合直接用於後續曲面重構，本發明利用基於廣義Hough變換原理的算法對獲得的圖像進行重建。根據根系的線狀特徵和天然的連續緩變特徵，由各根的中軸線即骨架來刻畫根系構型特徵，並利用多節點B樣條曲線插值，進行植物根系曲面擬合。 本發明的有益效果是本發明提供適宜的培養基組成和生長容器，實現植物的根系在透明的生長環境中自然生長，通過對植物根系原位生長狀況進行三維可視化分析，能直接反映根系的三維生長狀況，不需要破壞性的檢測，並實現動態的觀測。本發明方法簡單有效，對植物根系三維構型進行原位圖像重建和動態模擬以及根構型參數的定量計算，實現植物根系三維構型的原位動態定量描述和分析，為研究植物根系生長及其營養生理功能提供新的科學技術和手段，並可以通過對植物根系三維構型的圖像重建和模擬，大大縮短根系生長研究所需的時間。
圖l本發明透明的栽培容器結構示意圖
圖2播種時的種胚朝向示意圖
圖3三維雷射掃描儀掃描根系方式
圖4傳統的樣條編輯方法模擬結果
圖5傳統的樣條編輯方法模擬結果局部放大圖
圖6傳統的樣條編輯方法模擬結果
圖7大豆發芽後第18天三維雷射掃描獲取的根系三維構型圖像圖8水稻發芽後第18天三維雷射掃描獲取的根系三維構型圖像圖9大豆發芽後第18天的植物根系三維構型模擬結果圖10水稻發芽後第18天的植物根系三維構型模擬結果圖11 16水稻根系生長6、 12和18天的形態構型數據框圖
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步詳細說明本發明。本發明改變了現有技術破壞性觀察和測定根系形態構型的觀念，通過大量長期的實驗總結得到本發明的設計，實現了對植物根系動態的原位觀察和測定。實驗中的實施例不能一一贅述，下述實施例僅用於輔助說明本發明思路，並不因此將本發明的範圍限定於大豆和水稻。實施例1大豆根系的形態構型的原位觀察和測定(1)設計透明的栽培容器和生長介質；
如附圖1所示，採用一透明圓柱形有機玻璃容器l，高20cm，直徑12cm，設置有一個可打開的蓋子2，蓋子中間設一個直徑為20mm
的貫穿圓洞3;
透明培養基為改良的1/2 Hoagland營養液+ 0.15 %的Phytagel (W/V) +不同磷處理，所述不同磷處理包括無磷處理或l.OmM KH2P04處理，參照本領域技術人員常規技術，pH值調節為5.8，按照常規技術採用鹽酸或氫氧化鈉等試劑進行調節。
1/2 Hoagland營養液組成為(^M): KN03 2.5xl03， MgS04 '7H20lx103， Ca(N03)2 2.5xl03， ZnS04 7H20 0.38， K2S04 0.25xl03，CuS04 '5H20 0.57， Fe-EDTA(Na) 82， H3B03 23.13， MnCl2 '4H20 4.57，(NH4)6Mo7024 4H20 0.09。
如附圖1所示，每個有機玻璃容器分別裝15cm高的培養基4，即約1.7L培養基，以使容器內上方留有部分空間5供幼苗早期無菌生長。培養基配置步驟如下
(A)用攪拌機將培養基攪拌均勻，並調節pH值為5.8;有機玻璃容器用紫外線滅菌1小時備用；(B) 採用高壓滅菌鍋將培養基在12rC滅菌30分鐘，滅菌結
束儘快(保證培養基未開始凝固)將培養基倒入滅菌的有機玻璃容器
內，以上操作在超淨工作檯進行；
(C) 靜置冷卻待培養基凝固，大概需要4小時左右。其中， 在培養基快凝固時，不能挪動容器，以防止培養基凝固后里面產生氣 泡。
對於分層磷處理培養基，需等下層培養基完全凝固後再倒上層 培養基，並確保上層培養基倒入時的溫度不能太高，但也不能太低以 至於上層培養基會開始凝固，本發明優選設定上層培養基倒入時溫度 為5(TC左右，以保證下層培養基不會沒有融化，上層培養基不會很 快發生凝固。
(2)種子滅菌和催芽，出芽後移苗到步驟(1)所述透明的栽培 容器，保持植物根系在所述透明的生長介質中自然生長；
種子在播種前必須要進行滅菌以防止生長過程中產生汙染。 大豆種子滅菌與催芽的方法是將大豆種子用10%雙氧水浸泡 30分鐘，並不時搖動，再用無菌水衝洗3 5次，播種到經過高溫滅 菌並含有大豆培養基的培養皿裡萌發，注意播種時的種胚朝向如附圖 2所示，使胚根向下生長，附圖2中6為胚胎(embryo) ， 7為胚根 (radicle)。播種應在超淨工作檯中操作，播入種子後用透氣膠帶封 口。在25C培養箱裡暗培養24小時左右，出芽後移苗到圓柱形有機 玻璃容器內。
大豆幼苗生長期間的平均溫度為白天28"，晚上19匸，相對度為80%，光照時間為12小時。
採用三維雷射掃描儀對根系進行掃描，進行根系三維構型的原位 觀察和圖像捕獲。
根系圖像三維雷射掃描從移苗後第1天到第20天每24小時利 用三維雷射掃描儀(Roland LPX-1200， Japan)掃描植株根系一次。 掃描範圍為0fl 360G，旋轉方向的掃描精度為0.18G，上下移動方向 的掃描精度為O.lmm。
植物根系三維構型原位動態重建及模擬系統由三維雷射掃描儀、 計算機和圖像分析軟體三部分組成。各組份具體功能如下
第一部分，三維雷射掃描儀。採用日本產的Roland LPX-1200三 維雷射掃描儀，有效掃描範圍為130.0 mm(直徑)x 203.2mm (高)，在
旋轉方向掃描精度最高可達0.18Q，在上下移動方向精度最高可達 O.lmm。三維雷射掃描儀LPX-1200內設有一個旋轉臺，旋轉臺上放 置要掃描的植物，放置時需要注意使要掃描的物體中心與旋轉臺的中 心對齊，掃描時旋轉臺帶著植物一起旋轉，掃描方式見附圖3。三維 雷射掃描儀利用精確的非接觸式雷射傳感器進行掃描，通過發射雷射 束到要掃描的植物根系表面，由傳感器探測從物體表面反射的光量來 測定物體的坐標，速度快、精度高、操作靈活。
第二部分，計算機。計算機的配置需要Pentium 4以上，內存1GB 以上，Windows XP系統，以保證圖像分析系統順利進行。
第三部分，圖像分析軟體。包括圖像採集、重建和模擬，利用三 維雷射掃描儀結合三維雷射掃描儀系統的Dr.PICZA3軟體(RolandLPX-1200, Japan)採集植物根系三維構型圖像，採集時間隨掃描植 株根系的大小和掃描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，採集 的時間就越大，本領域技術人員根據具體需要確定掃描時間。 一般發 芽後6天的大豆根系採用掃描精度在旋轉方向為0.18G，在上下移動 方向精度為0.1mm時，圖像掃描時間需要60分鐘左右。發芽後12 天的大豆根系採用以上相同的精度掃描時需要90分鐘左右。按照本 發明方法對大豆發芽後第18天三維雷射掃描獲取的根系三維構型圖 像見附圖7。
由於三維雷射掃描儀獲得的數據是在三維空間中無規則、隨機分 布的。其特點是數據量龐大、噪聲點多、數據密集、數據點散亂分布 (因此稱為"點雲"數據)，表面存在一些"沙洞"。若採用傳統的 樣條編輯方法模擬，模擬結果不是很理想，見附圖4 6所示，不適 合直接用於後續曲面重構，附圖4三維雷射掃描儀獲取的離散點； 附圖5中植物根系存在的"沙洞"，附圖6表示利用傳統樣條編輯方 法模擬得到的結果。本發明利用基於廣義Hough變換原理的算法對 獲得的圖像進行重建。根據根系的線狀特徵和天然的連續緩變特徵， 由各根的中軸線即骨架來刻畫根系構型特徵，並利用多節點B樣條 曲線插值，進行植物根系曲面擬合。按照本發明方法對大豆發芽後第 18天的植物根系三維構型獲得的模擬結果見附圖9所示。 實施例2水稻根系的形態構型的原位觀察和測定 (1)設計透明的栽培容器和生長介質；
採用一透明圓柱形有機玻璃容器，高20cm，直徑12cm，設置有一個可打開的蓋子，蓋子中間設一個直徑為20mm的貫穿圓洞；
水稻培養基為Yoshida在1976年改良的水稻營養液+ 0.15% 的PhytagelTM (W/V) +不同磷處理，所述不同磷處理包括無磷處理 或1.0mM KH2P04處理，參照本領域技術人員常規技術，pH值調節 為5.7，按照常規技術採用鹽酸或氫氧化鈉等試劑進行調節。
Yoshida等1976改良的水稻營養液組成為(pM) : H3B03 19, Ca(N03)2 4H20 1000, NH4 N03 429, (NH4)6Mo7024 4H20 0.52， MnS04 *H20 9.1, CuS04'5H20 0.16， ZnS04'7H20 0.15, K2S04 513, MgS04 7H20 1667, Fe-EDTA(Na) 36。
每個有機玻璃容器分別裝15cm高的培養基，即約1.7L培養基， 以使容器內上方留有部分空間供幼苗早期無菌生長，培養基配置步驟 同實施例1。
(2)種子滅菌與催芽 水稻種子用10%雙氧水浸泡60分鐘，並不時搖動，再用無菌 水衝洗3 5次；然後再用70%酒精浸泡10分鐘，用無菌水衝洗3 5次。浸於無菌水中，放置在28"C培養箱裡暗培養48小時左右出芽 後移苗。
水稻幼苗生長期間的平均溫度為白天28。C，晚上19"C，相對溼 度為80%，光照時間為12小時。
(3)根系圖像三維雷射掃描從移苗後第1天到第20天每24 小時利用三維雷射掃描儀(Roland LPX-1200， Japan)掃描植株根系 一次。掃描範圍為0° 360Q，旋轉方向的掃描精度為0.18Q，上下移動方向的掃描精度為O.lmm。植物根系三維構型原位動態重建及模擬
系統由三維雷射掃描儀、計算機和圖像分析軟體三部分組成。各組份
具體功能如下
第一部分，三維雷射掃描儀。採用日本產的Roland LPX-1200三 維雷射掃描儀，有效掃描範圍為130.0 mm(直徑)x 203.2mm (高)，在
旋轉方向掃描精度最高可達0.18Q，在上下移動方向精度最高可達 O.lmm。三維雷射掃描儀LPX-1200內設有一個旋轉臺，旋轉臺上放 置要掃描的植物，放置時需要注意使要掃描的物體中心與旋轉臺的中 心對齊，掃描時旋轉臺帶著植物一起旋轉，掃描方式見附圖3。三維 雷射掃描儀利用精確的非接觸式雷射傳感器進行掃描，通過發射雷射 束到要掃描的植物根系表面，由傳感器探測從物體表面反射的光量來 測定物體的坐標，速度快、精度高、操作靈活。
第二部分，計算機。計算機的配置需要Pentium 4以上，內存1GB 以上，Windows XP系統，以保證圖像分析系統順利進行。
第三部分，圖像分析軟體。包括圖像採集、重建和模擬，利用三 維雷射掃描儀結合三維雷射掃描儀系統的Dr.PICZA3軟體(Roland LPX-1200, Japan)採集植物根系三維構型圖像，採集時間隨掃描植 株根系的大小和掃描精度的不同而不同。根系越大、精度越高，採集 的時間就越大。 一般發芽後6天的水稻根系採用掃描精度在旋轉方向 為0.18Q，在上下移動方向精度為0.1mm時，圖像掃描時間需要40 分鐘左右。發芽後12天的水稻根系採用以上相同的精度掃描時需要 90分鐘左右。按照本發明方法對水稻發芽後第18天三維雷射掃描獲取的根系三維構型圖像見附圖8。
由於三維雷射掃描儀獲得的數據是在三維空間中無規則、隨機分 布的。其特點是數據量龐大、噪聲點多、數據密集、數據點散亂分布 (因此稱為"點雲"數據)，表面存在一些"沙洞"。若採用傳統的樣 條編輯方法模擬，模擬結果不是很理想，見附圖4 6所示，不適合 直接用於後續曲面重構，附圖4三維雷射掃描儀獲取的離散點；附 圖5中植物根系存在的"沙洞"，附圖6表示利用傳統樣條編輯方法
模擬得到的結果。本發明利用基於廣義Hough變換原理的算法對獲
得的圖像進行重建。根據根系的線狀特徵和天然的連續緩變特徵，由
各根的中軸線即骨架來刻畫根系構型特徵，並利用多節點B樣條曲
線插值，進行植物根系曲面擬合，按照本發明方法對水稻發芽後第
18天的植物根系三維構型獲得的模擬結果見附圖IO所示。
採用本發明方法得到的水稻根系生長6、 12和18天的形態構型 數據框圖見附圖11 16。圖中每個柱子所代表的數據為4個重複的 平均及其標準差，每個柱子上字母不相同表示差異顯著(<0.05)，字 母相同則表示差異不顯著。
權利要求
1、一種植物根系原位動態觀察和測定方法，其特徵在於包括以下步驟(1)設計透明的栽培容器和生長介質；(2)種子滅菌和催芽，出芽後移苗到步驟(1)所述透明的栽培容器，保持植物根系在所述透明的生長介質中自然生長；(3)採用三維雷射掃描儀對根系進行掃描，進行根系三維構型的原位觀察和圖像捕獲，完成圖像採集、重建和模擬。
2、 根據權利要求1所述植物根系原位動態觀察和測定方法，其 特徵在於步驟(3)所述掃描的方法是從移苗後第1天到第20天每 24小時利用三維雷射掃描儀掃描植株根系一次，掃描範圍為0° 360Q，旋轉方向的掃描精度為0.18Q，上下移動方向的掃描精度為 O.lmm。
3、 根據權利要求1所述植物根系原位動態觀察和測定方法，其 特徵在於步驟(3)所述重建是利用基於廣義Hough變換原理的算法 對獲得的圖像進行重建。
4、 根據權利要求1所述植物根系原位動態觀察和測定方法，其 特徵在於步驟(3)所述模擬是根據各植物根的中軸線即骨架來刻畫 根系構型特徵，並利用多節點B樣條曲線插值，進行植物根系曲面 擬合。
5、 一種實現權利要求1所述方法的系統，其特徵在於包括三維 雷射掃描儀、計算機和圖像分析軟體；所述三維雷射掃描儀為RolandLPX-1200三維雷射掃描儀；所述計算機的配置為Pentium 4以上，內 存1GB以上，使用Windows XP系統。
全文摘要
本發明公開了一種植物根系原位動態觀察和測定方法，包括設計透明的栽培容器和生長介質；種子滅菌和催芽，出芽後移苗到透明的栽培容器中保持植物根系在所述透明的生長介質中自然生長；採用三維雷射掃描儀對根系進行掃描，進行根系三維構型的原位觀察和圖像捕獲，完成圖像採集、重建和模擬等步驟。本發明通過對植物根系原位生長狀況進行三維可視化分析，直接反映根系的三維生長狀況，不需要破壞性的檢測，並實現動態的觀測。
文檔編號A01G7/00GK101658107SQ20091019245
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月18日 優先權日2009年9月18日
發明者嚴小龍, 紅 廖, 方素琴 申請人:華南農業大學