固定化乳糖酶及其製備方法與應用的製作方法

2023-04-23 12:19:16 2

專利名稱：固定化乳糖酶及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明是關於一種固定化乳糖酶及其製備方法與應用，同時還關於包含所述固定 化乳糖酶的生產低乳糖牛奶的反應裝置、利用所述固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的方法， 以及所述固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法。
背景技術：
牛奶中含有4. 8 %左右的乳糖，全脂牛奶中約30 %的熱量是由乳糖提供的。正常 情況下，乳糖可在人體小腸上皮細胞的乳糖酶作用下，水解成葡萄糖和半乳糖後被吸收而 進入血液。但隨著人類的生長發育，體內乳糖酶活性呈規律性衰減，結果造成乳糖吸收障 礙。世界上很多人都存在不同程度的乳糖不耐症現象，他們如果一次攝入較多乳糖，乳糖不 能及時被消化吸收，不能被吸收的乳糖進入結腸後被腸道微生物分解，產生大量乳酸、甲酸 等短鏈脂肪酸和氫氣，造成滲透壓升高，使腸腔中的水分增多，引起腹脹、腸鳴、腸絞痛、腹 瀉等症狀。據調查，在亞洲、非洲、特別是我國人群中，大約80%的人都有不同程度的乳糖不 耐症症狀。乳糖不耐症已經成為制約我國乳製品消費的重要因素之一，解決這一問題的行 之有效的方法之一就是用乳糖酶將牛奶中的乳糖水解，製成低乳糖牛奶。傳統的低乳糖牛奶的製備方法是直接將游離的乳糖酶添加到牛奶中，在一定的溫 度下水解一段時間，製成低乳糖牛奶。這種製備低乳糖牛奶的方法中，乳糖酶不能回收，在 一定程度上造成資源的浪費，生產成本高，而且殘留在牛奶中的乳糖酶可能會對牛奶的品 質產生不良的影響，如乳糖酶中摻雜的其他蛋白酶會在低乳糖牛奶的貯存期間使牛奶蛋白 質分解產生苦味。近年來，相關人員對固定化乳糖酶的技術進行了研究，以期能把游離的乳糖酶固 定在載體上製成固定化乳糖酶來生產低乳糖牛奶，以解決游離乳糖酶生產低乳糖牛奶的缺 點。固定化乳糖酶有重複使用的特點，可以節省低乳糖牛奶的生產成本，加工時間也會縮 短，並且乳糖酶也不會殘留在最終的低乳糖牛奶產品中，有利於保護產品的品質，而且可實 現工業化連續生產低乳糖牛奶。已有報導的乳糖酶固定化方法多為包埋法、吸附法、交聯法或多種方法組合使 用或其他方法，例如CN 1818061A公開了海藻酸鈉包埋法固定化乳糖酶；CN1258452A公 開了以微孔玻璃珠或矽膠珠為支持物吸附嗜熱菌乳糖酶以應用於生成低乳糖牛奶；CN 1724662A公開了用樹脂吸附、海藻酸鈉包埋、戊二醛交聯三種方法結合固定乳糖酶；CN 1769440A公開了一種以殼聚糖為載體、三羥甲基膦為交聯劑固定化高溫β _半乳糖苷酶的 方法；CN2390887Y公開了利用帶有超濾膜壁的中空纖維截留法固定乳糖酶；此外，王靜等 人研究了以陽離子交換樹脂D151為載體、戊二醛為交聯劑，吸附交聯黑麴黴乳糖酶製備固 定化乳糖酶，並用於連續生產低乳糖乳(陽離子交換樹脂D151固定化乳糖酶研究，河北農 業大學學報.第29卷第4期，2006年7月；利用固定化乳糖酶連續生產低乳糖乳的研究， 食品工業科技.2 008年第09期)；潘曉亞等人對以明膠為載體包埋固定乳糖酶技術進行了 研究(明膠載體固定化乳糖酶技術研究，乳品加工.2006. 03)；……。
上述目前已有的固定化乳糖酶的技術研究中，大多停留在對固定化過程的研究， 通常酶活損失較大，所固定的酶普遍具有針對性，或選用的載體穩定性較差，與酶之間的結 合力較差；雖有研究提到固定化酶的裝置，但其適用性較差，不容易實現工業化生產。另外， 在固定化乳糖酶的工業化應用中，還應注意固定化酶的清洗問題，以防止固定化酶被微生 物汙染，然而，上述研究中均未涉及對固定化酶的微生物汙染防治技術，難以滿足工業化生 產的要求。因此，固定化乳糖酶技術仍有待進一步研究。

發明內容
本發明的主要目的在於提供一種固定化乳糖酶，以降低工業化生產低乳糖牛奶的成本，並解決低乳糖牛奶的品質問題。本發明的另一目的在於提供製備所述固定化乳糖酶的方法。本發明的另一目的在於提供所述固定化乳糖酶的應用，具體是其在生產低乳糖牛 奶中的應用。本發明的另一目的在於提供一種包含所述固定化乳糖酶的生產低乳糖牛奶的反
應裝置。本發明的另一目的在於提供一種利用所述固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的方法。本發明的另一目的在於提供一種所述固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法。一方面，本發明提供了一種固定化乳糖酶，該固定化乳糖酶是利用帶有氨基基團 (-NH2)的載體經戊二醛處理製成活化載體、然後再固定乳糖酶而成。另一方面，本發明還提供了一種製備所述固定化乳糖酶的方法，該方法包括步驟 取帶有氨基基團的載體，經戊二醛處理使載體的氨基與戊二醛的醛基結合，製成活化載體； 在活化載體上固定乳糖酶，使活化載體的醛基與酶的氨基結合，得到固定化乳糖酶。為解決現有技術中固定化乳糖酶技術所存在的酶活損失高、酶與載體結合不牢固 等問題，本案發明人對固定化乳糖酶技術進行了研究。發明人在研究中發現，載體種類的選 擇以及合適的固定化方式對固定化酶的活性和穩定性是至關重要的，本發明針對乳糖酶的 結構特性，找到了一種適合固定化乳糖酶的載體，即本發明中所述的帶有氨基基團的載體， 所述的氨基基團是具有活性的氨基基團，該載體經戊二醛處理，可使載體的活性氨基與交 聯劑戊二醛的一個醛基結合，然後再將乳糖酶固定於戊二醛的另一個醛基上，製成的活性 載體對乳糖酶的結合程度較高，使得固定化酶的活性穩定，能有效提高固定化酶的利用效 率。本發明中，所述帶有氨基基團的載體可以商購獲得，也可以按照現有技術的記載 自行製備得到，現有技術中主要是利用帶有氨基基團的載體負載一些藥物活性組分或催化 劑等。本發明中所述的氨基基團包括氨基、胼基、醯胼基等含有活性-NH2W基團。根據本發 明的具體實施方案，為使所製備得到的固定化乳糖酶具有一定的剛性結構，即不可壓縮型， 以利於將固定化乳糖酶應用於低乳糖奶的工業化生產，本發明中要求所選用的載體具有一 定的機械強度。根據本發明優選的具體實施方案，本發明中可選用氨基化二氧化矽、含有氨 基的樹脂聚合物或含有醯胼基的樹脂聚合物作為本發明的載體，其活性基團為氨基。在本 發明的一更優選的具體實施方案中，所述載體顆粒粒徑0. 5 1. 2毫米，其形狀可為基本上 微球狀顆粒等，顆粒密度100 150毫升/100克抽乾載體，120 160毫升/100克風乾載體。本發明中對所固定的乳糖酶無特殊要求，可以為各種微生物來源或動植物來源的乳糖酶，可以是商購乳糖酶產品。根據本發明的具體實施方案，本發明的固定化乳糖酶，其酶活> 100U/g，最適反應 PH值為6. 5 7. 0，最適反應溫度38 41°C。在本發明的更具體的一實施方案中，所述固定 化乳糖酶的活性為100 200U/g，反應動力學常數Km為250 300mmol/L，Vmax為0. 1 1.Ommol/g · min。根據本發明的具體實施方案，本發明的製備固定化乳糖酶的方法包括步驟取帶有氨基基團的載體，加入戊二醛溶液，在室溫下處理5 10小時，使載體的氨 基與戊二醛的醛基結合，製成活化載體；發明人在研究中發現，該步驟中戊二醛溶液的濃度 將直接影響固定化酶產品的活性，本發明中優選使用戊二醛濃度 5% (除特別說明 夕卜，本發明中所述比例和含量均為重量比例和含量)的水溶液處理帶有氨基基團的載體以 製備活化載體。戊二醛溶液的量能浸沒載體即可；將活化載體浸入到乳糖酶溶液中(優選控制酶溶液濃度> 2000U/mL，酶溶液的量 能浸沒載體即可)，在室溫下反應5 10小時(期間可適當間歇輕微攪拌，例如可隔20 30分鐘)，使乳糖酶的氨基與活化載體的醛基充分結合，製成固定化乳糖酶。根據本發明的優選具體實施方案，本發明的製備固定化乳糖酶的方法還包括用無 菌的中性(PH值為6. 5 7. 0)磷酸緩衝溶液清洗活化載體和/或固定化乳糖酶的步驟。 即，在使載體的氨基與戊二醛的醛基結合製成活化載體後，可用磷酸緩衝溶液清洗掉活化 載體上的殘留戊二醛，然後再固定乳糖酶；在完成乳糖酶的固定化後，可用磷酸緩衝溶液清 洗掉固定化乳糖酶上的殘留乳糖酶。利用本發明製備固定乳糖酶的方法，酶的活力回收率可達到> 80%，固定化酶的 活性> 100U/g(本發明中酶活性單位U，定義為在37°C，pH值為6. 8條件下，每克游離酶 或固定化酶每分鐘從5%的乳糖溶液(由0. IM的磷酸緩衝溶液配製)中釋放出1 μ mol葡 萄糖，定義為1個酶活單位)，最適反應pH值為6. 5 7. 0，在牛奶的自然pH值之間，非常 適合牛奶中乳糖的水解，最適反應溫度為38 41°C，耐熱性較游離乳糖酶增強，耐pH值較 游離乳糖酶PH值增大，反應動力學常數Km為250 300mmol/L，Vmax = 0. 1 1. Ommol/ g · min。另一方面，本發明還提供了所述固定化乳糖酶在生產低乳糖牛奶中的應用。由 於本發明的固定化乳糖酶具有穩定性強、活性高、反應PH值適宜等特點，其特別適用於水 解牛奶中的乳糖而生產低乳糖牛奶。另外，雖然本發明的固定化乳糖酶的最適反應溫度為 38 41°C，其在低溫下(例如10°C左右)也具有良好的生物活性，適合低乳糖牛奶的生產。另一方面，本發明還提供了一種利用固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的反應裝置， 其中填充有本發明所述的固定化乳糖酶。本發明利用固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的反應 裝置，具體可以是固定床反應器，例如填充柱等。反應裝置中除填充本發明的固定化乳糖酶 夕卜，裝置的其他具體結構可參照現有技術。另一方面，本發明還提供了一種利用本發明所述固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的 方法，該方法包括使牛奶與所述固定化乳糖酶接觸以分解牛奶中乳糖的過程。根據本發明的具體實施方案，在利用本發明所述固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的方法中，優選控制牛奶與固定化乳糖酶的接觸過程中酶的環境溫度為8 41°C，牛奶與固 定化乳糖酶的接觸停留時間為20 30分鐘。在本發明的一更具體的實施方案中，所述生產低乳糖牛奶的方法為工業化連續生 產，其中是將所述固定化乳糖酶填充到一固定床反應器中，使牛奶以一定的流速通過反應 器中的固定化乳糖酶，其中，控制固定床反應器中的溫度為10 40°C，並控制牛奶流速，使 其在固定床反應器中停留20 30分鐘，實驗表明，乳糖含量為4. 8%的牛奶流經該反應器 後，其中乳糖水解率大於70%。
另一方面，本發明還提供了所述固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法。本發明中， 由於乳糖酶在與活化載體結合後，酶的結構會發生一定的改變，且本發明的固定化酶中，酶 的活性基團是暴露在外面的而保持有較高的酶活性，在對該固定化乳糖酶進行微生物汙染 防治時，應考慮儘可能減少對酶活性基團的損害以避免酶失活。根據本發明的具體實施方 案，本發明的固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法包括用Rozone S16、雙季銨鹽或新潔爾滅等殺菌劑衝洗固定化乳糖酶10 20min以 殺菌；根據本發明的優選具體方案，可用0. 05% 0. 的RozoneSie衝洗固定化乳糖酶 10 15分鐘，用稀釋500倍的雙季銨鹽衝洗固定化乳糖酶10 20分鐘，或用200ppm的 新潔爾滅衝洗固定化乳糖酶10分鐘，在上述殺菌劑濃度和作用時間下能達到良好的殺菌 效果，且對固定化酶的活性損失較小；經殺菌後的固定化乳糖酶置於中性的40% 60%的 甘油溶液(甘油的水溶液)保存，保存溫度優選為3 5°C，以防止微生物的進一步生長繁 殖。本發明所提供的固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法，特別是指固定化乳糖酶在 生產應用中的微生物汙染防治方法，主要是通過冷殺菌的方式並採用一定的保存方式來達 到微生物汙染防治的方法。實際應用中，在裝載固定化乳糖酶的固定床反應器每反應2 5個批次(每天固定化乳糖酶與牛奶連續反應8小時為一個批次)後用0. 05% 0. 的 Rozone S16衝洗10 15min，微生物殺滅率可達到95%以上，而固定化酶的活性下降小於 0.5% ；經冷殺菌後的固定化酶在不用時於生產時置於40% 60%的甘油溶液中保存能進 一步保護固定化乳糖酶的活性並防止微生物的進一步生長繁殖。在本發明的一具體實施方 案中，通過本發明所提供的固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法處理，應用本發明的固定 化乳糖酶在10°C下生產低乳糖牛奶，通過65個批次反應，酶活性僅下降15.8%，完全滿足 工業化生產的要求。綜上所述，本發明具有以下有益效果本發明選取含有氨基基團的載體，採用共價 結合的方法，將載體與交聯劑的醛基結合，製成的活性載體對乳糖酶的結合程度提高，使得 固定化乳糖酶的活性穩定，能有效提高固定化乳糖酶的利用效率；適合本發明技術的乳糖 酶可為各種商業化乳糖酶；將本發明的固定化乳糖酶應用於製備低乳糖奶，易於滿足工業 化生產的要求，能進行連續化、自動化生產；而且本發明還對所述固定化乳糖酶的使用過程 中微生物的汙染防治採取了一定的措施，使得固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶實現工業化成 為可能。


圖1為顯示本發明實施例2中利用本發明的固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶時，牛奶中乳糖水解率與酶的使用周期之間的關係的曲線圖。圖2為顯示本發明實施例3中利用本發明的固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶時，牛 奶中乳糖水解率與酶的使用周期之間的關係的曲線圖。
具體實施方式
以下通過具體實施例詳細說明本發明的技術及特點，旨在幫助閱讀者更好地理解 本發明的技術實質和所能產生的有益效果，不能理解為對本發明實施範圍的限定。實施例1 乳糖酶固定化本實施例的製備固定化乳糖酶的方法包括稱取500g帶有活性氨基的樹脂聚合物載體(商購，來源於上海恆然生物科技有限 公司，商品名稱氨基載體(LZ-A)，載體形狀為微球狀顆粒，顆粒密度130毫升/100克抽乾 載體，140毫升/100克風乾載體；顆粒直徑0. 5 1. 2毫米)，將該氨基載體加入3%的戊 二醛(0HC-CH2-CH2-CH2-CH0)溶液中，在室溫(約25V )下交聯6小時，戊二醛的一個醛基 (-CH0)將和載體的氨基(-NH2)結合，製成活化的載體；該過程中，由於一個氨基僅能和一 個醛基結合，而戊二醛的鏈較短，所以戊二醛的另一個醛基和載體上其他氨基結合的機率 較小，戊二醛能露出一個醛基，得到活化的載體，該載體具有游離的醛基，因同性相斥，這些 游離的醛基基團不能相互結合到一起，可以保持有活性；交聯後用pH值為6. 8的滅菌的磷酸緩衝溶液清洗掉殘留的戊二醛；將活化的載體上浸入商業化乳糖酶溶液中，乳糖酶溶液活性約2300U/ml，在室溫 下放置6小時，讓乳糖酶的氨基與活化載體的游離醛基充分結合(通過測定所得固定化乳 糖酶的活性即可評價酶與活化載體的結合效果)，即製成本實施例的固定化乳糖酶，將固定 化乳糖酶浙幹，可用無菌的PH值為6. 8的磷酸緩衝溶液衝洗掉殘餘的乳糖酶(或酶液)，即 可用於低乳糖牛奶的生產。該固定化乳糖酶可貯存在中性的40% 60%的甘油溶液中待 用。對本實施例的固定化乳糖酶的特性進行分析，得到固定化時酶的活力回收率為 85 %，固定化酶的活性為112U/g，最適反應pH值為6. 5 7. 0，最適反應溫度為38 41°C， 耐熱性和耐PH值較游離酶增大，反應動力學常數Km為285. 87mmol/L, Vmax = 0. 23mmol/g
mirio實施例2 利用固定化乳糖酶在室溫水解牛奶中乳糖操作穩定性試驗將實施例1製備得到的固定化乳糖酶填充到固定床反應器(帶有夾套的填充柱) 中，填充高度18cm，總共酶活為3700U，夾套通過循環水浴鍋通入設定溫度的水來保持系統 的溫度(本實施例中設定溫度為室溫，24 26°C )，通過蠕動泵將乳糖含量為4. 8%的牛奶 從填充柱的底端流入、頂端留出，牛奶在管柱中停留約23min，這樣，從填充柱頂端出來的牛 奶即為低乳糖牛奶。本實施例中，反應器每天運行7個小時，每天運行完畢後用滅菌蒸餾水對填充有 固定化乳糖酶的填充柱進行反覆衝洗，然後置於PH值為6. 8、濃度為0. IM的磷酸緩衝溶液 中，於4°C貯存；使用前再用滅菌蒸餾水對填充柱衝洗乾淨；重複使用65天。實驗過程中固定化乳糖酶的活性變化趨勢可參考圖1，其中顯示了牛奶中乳糖水 解率與固定化酶的使用周期之間的關係變化。從圖1可以看出，本發明的固定化乳糖酶在室溫重複使用時活性下降較快，經過65個批次反應，牛奶中乳糖水解率從最初批次的 78. 6%下降到最終批次的39.7%，活性下降了 49.5%。分析其原因，主要是因為固定化乳 糖酶在使用的過程中受到微生物汙染以及溫度較高時酶的活性基團容易失活。實施例3 固定床反應器在10°C條件下的運行試驗將實施例1製備得到的固定化乳糖酶填充到固定床反應器(帶有夾套的填充柱) 中，填充高度14. 5cm，總共酶活為2650U，夾套通過循環水浴鍋通入設定溫度的水來保持系 統的溫度(本實施例中設定溫度為10°C )，通過蠕動泵將乳糖含量為4. 8%的牛奶從填充柱 的底端流入、頂端留出，牛奶在管柱中停留約22min，這樣，從填充柱頂端出來的牛奶即為低 乳糖牛奶。本實施例中，每天運行7個小時，每天運行完畢後用滅菌蒸餾水對填充有固定化 乳糖酶的填充柱進行衝洗，然後置於PH值為6. 8、濃度為50 %的甘油溶液中，於4°C貯存； 每使用3天後用0. 的Rozone S16衝洗lOmin，蒸餾水衝洗乾淨後再置於50%的甘油溶 液中貯存，使用前再用滅菌蒸餾水對填充柱衝洗乾淨繼續使用；重複使用65天。實驗過程中固定化乳糖酶的活性變化趨勢可參考圖2，其中顯示了牛奶中乳糖水 解率與固定化酶的使用周期之間的關係變化。從圖2可以看出，本發明的固定化乳糖酶 在室溫重複使用時活性下降較快，經過65個批次，反應牛奶中乳糖水解率從最初批次的 74.0%下降到最終批次的62.3%，活性僅下降了 15.8%。該實施例表明，本發明的固定化 乳糖 酶適宜在溫度較低情況下用於生產低乳糖牛奶，本發明進一步通過配備有效的固定化 乳糖酶微生物防治手段，所以固定化乳糖酶在低溫下完全可以實現工業化。
權利要求
一種固定化乳糖酶，該固定化乳糖酶是利用帶有氨基基團的載體經戊二醛處理製成活化載體、然後再固定乳糖酶而成。
2.根據權利要求1所述的固定化乳糖酶，其中，所述載體為氨基化二氧化矽、含有氨 基的樹脂聚合物或含有醯胼基的樹脂聚合物，載體顆粒粒徑0. 5 1. 2毫米，顆粒密度 100 150毫升/100克抽乾載體，120 160毫升/100克風乾載體。
3.根據權利要求1所述的固定化乳糖酶，該固定化乳糖酶的活性為100 200U/g， 最適反應PH值為6. 5 7.0，最適反應溫度為38 41°C，反應動力學常數Km為250 300mmol/L, Vmax 為 0. 1 1. Ommol/g · min。
4.一種製備權利要求1 3任一項所述固定化乳糖酶的方法，該方法包括步驟取帶有氨基基團的載體，經戊二醛處理使載體的氨基與戊二醛的醛基結合，製成活化 載體；在活化載體上固定乳糖酶，使活化載體的醛基與酶的氨基結合，得到固定化乳糖酶。
5.根據權利要求4所述的方法，該方法包括步驟取帶有氨基基團的載體，加入 5%的戊二醛溶液處理5 10小時，使載體的氨基 與戊二醛的醛基結合，製成活化載體；將活化載體浸入乳糖酶溶液中，反應5 10小時，使乳糖酶的氨基與活化載體的醛基 充分結合，製成固定化乳糖酶。
6.權利要求1 3任一項所述的固定化乳糖酶在生產低乳糖牛奶中的應用。
7.一種利用固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的反應裝置，其中填充有權利要求1 3任 一項所述的固定化乳糖酶。
8.一種利用權利要求1 3任一項所述固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的方法，該方法 包括使牛奶與所述固定化乳糖酶接觸以分解牛奶中乳糖的過程。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，控制牛奶與固定化乳糖酶的接觸過程中酶的環 境溫度為10 40°C，且牛奶與固定化乳糖酶的接觸停留時間為20 30分鐘。
10.權利要求1 3任一項所述固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法，該方法包括 用0.05% 0. 的Rozone S16、稀釋500倍的雙季銨鹽或200ppm的新潔爾滅衝洗所述經使用過的固定化乳糖酶10 20min以殺菌；經殺菌後的固定化乳糖酶置於中性的40% 60%的甘油溶液中於3 5°C保存。
全文摘要
本發明是關於一種固定化乳糖酶及其製備方法與應用，所述的固定化乳糖酶是利用帶有氨基基團的載體經戊二醛處理製成活化載體、然後再固定乳糖酶而製成。本發明同時提供了製備所述固定化乳糖酶的方法，所述固定化乳糖酶在生產低乳糖牛奶中的應用，包含所述固定化乳糖酶的生產低乳糖牛奶的反應裝置，以及利用所述固定化乳糖酶生產低乳糖牛奶的方法；本發明另外還提供了所述固定化乳糖酶的微生物汙染防治方法。
文檔編號A61L101/32GK101845431SQ20091012974
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月26日 優先權日2009年3月26日
發明者雲戰友, 卜建斌, 王彩雲 申請人:內蒙古伊利實業集團股份有限公司