水稻植酸相關基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法
2023-04-23 17:12:26 1
專利名稱：水稻植酸相關基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，具體的說，本發明涉及一種利用圖位克隆技術克隆的水稻植酸相關基因ZJU-LPAl以及利用該基因培育低植酸水稻的方法。
背景技術：
植酸是作物種子中最豐富的磷的貯存形式，佔種子中全磷量的65 85%。植酸可與Zn2+、Fe3+、Ca2+等金屬陽離子螯合成植酸鹽，難以被人和非反芻動物(豬、雞、魚等)消化利用，降低了磷元素以及與之結合的微量元素、蛋白和澱粉的生物有效性，被認為是一種抗營養因子；此外，植酸還對生態環境具有負面效應，可引起湖泊等水系的富營養化。因此，降低植酸的含量成為育種學家、營養學家和環境學家關注的焦點之一。運用理化誘變和轉基因技術，獲得種子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可從源頭上解決上述問題。
迄今，國內外已在水稻、大豆、玉米、大麥、小麥等作物中獲得了一批LPA突變體，這些突變體不僅為LPA作物品種的選育及應用奠定了基礎，也為進行LPA突變基因的定位、克隆研究提供了理想材料。利用正向(圖位克隆)或反向遺傳學(RNAi，T-DNA插入突變)技術，已克隆了若干LPA基因，揭示了 LPA突變發生的分子機制。植物體內的植酸代謝較為複雜，迄今還未明確。其合成代謝的大致途徑如下葡萄糖-6-磷酸在肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)的催化下生成肌醇-3-磷酸[Ins (3) P1],接著在肌醇單磷酸酶的作用下生成肌醇和無機磷；後期為肌醇磷酸化/焦磷酸肌醇-磷酸化階段，即肌醇和磷通過脂依賴和/或非脂依賴途徑生成三磷酸肌醇，三磷酸肌醇經連續的磷酸化最終生成植酸。因此，植酸代謝或運輸途徑中任一基因突變或沉默均會導致降低植酸含量。如大豆和水稻中MIPS基因的沉默；水稻和玉米中肌醇激酶(MIK)的突變；玉米、擬南芥和大豆中肌醇單磷酸激酶(IPK)的突變；玉米、大豆和水稻中植酸運輸相關基因(MPR)基因的突變；水稻中與擬南芥中2-膦酸甘油酸激酶(2-PGK)同源基因的突變。我國是稻米生產和消費的大國，也是鐵缺乏和缺鐵性貧血發生較嚴重的國家之一，培育具有營養與環保雙重功能的LPA水稻在我國尤為重要。而獲得具有自主智慧財產權的LPA相關新基因，則為通過傳統育種手段或現代反向遺傳學技術培育LPA水稻新品種提供了必要的前提，也為闡明植酸合成代謝途徑奠定基礎，具有重要的理論與實踐意義。
發明內容
本發明提供了一種水稻植酸相關基因ZJU-LPA1，通過人工突變該基因或RNAi抑制該基因表達，可以有效降低水稻種子中的植酸含量。一種水稻植酸相關基因ZJU-LPAl，其鹼基序列如SEQ ID NO. I所示。一種所述水稻植酸相關基因ZJU-LPAl編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。本發明還提供了一種培育低植酸水稻的方法，包括利用射線對水稻種子進行射線誘變處理，種植若干代後，篩選水稻ZJU-LPAl基因表達框被破壞的純合型突變體；所述水稻ZJU-LPAl基因的鹼基序列如SEQ ID NO. I所示。所述水稻種子的品種為三系晚秈恢復系「明恢86」和三系秈稻恢復系「中9B」。所述射線為137Cs-Y射線。所述射線誘變劑量為300Gy。本發明提供了另一種培育低植酸水稻的方法，包括(I)構建ZJU-LPAl基因RNAi的髮夾結構單元；(2)將所述髮夾結構單元連入中間載體，構建植物表達載體；(3)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織；(4)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。所述髮夾結構單元包括中間的內含子及兩端的目的基因片段和目的基因片段的反向互補片段，所述目的基因片段為ZJU-LPAl基因CDS序列的部分序列，ZJU-LPAl基因CDS鹼基序列如SEQ ID No.3所示，內含子在本發明中沒有特異性的要求，它可以是來自pSSK-IN載體，鹼基序列如SEQ ID NO. 24所示。擴增所述目的基因片段的引物為RiF :5』 -CAGTTGGTAGGACATTTGCTTCA-3』 ；RiR : 5 』 -TGCCTTTGATGTTCCCTTGA-3，。優選的，所述原始載體為pCAMBIA 1301-35SN。優選的，將所述低植酸水稻植株種植若干代，獲得性狀穩定的株系。本發明利用水稻低植酸突變體，通過圖位克隆方法在水稻中克隆到了水稻ZJU-LPAl基因，並通過互補實驗對基因功能進行了驗證。該基因編碼含有SulfateTransporter和STAS兩個結構域的表達蛋白，利用RNAi技術降低該基因的表達,可以獲得水稻低植酸材料。該基因的克隆不僅豐富了植酸代謝的網絡途徑，也為利用該基因進行水稻LPA育種和分子設計育種提供新的基因資源和理論指導。
圖I是水稻低植酸突變體、野生型及功能互補實驗T1代轉基因種子的無機磷比色。I :由上至下依次為5個標準P對照，含量依次為0.00 μ g、0. 15yg,0. 46yg,0. 93 μ g,
I.39 μ g ；2 :野生型明恢86 ；3 lpal ；4 :功能互補實驗T1種子；5 =RNAi T2代純合LPA植株種子圖2是ZJU-LPAl基因在水稻第4號染色體上的初步定位圖；圖3是ZJU-LPAl候選基因的克隆；圖4是轉基因表達載體圖譜，A pCAMBIAl 301+Z JU-LPAl互補載體；B :pCAMBIA1301-35SN+RNAi 表達載體。
具體實施例方式實施例I、ZJU-LPAl基因的分離和克隆I、水稻低植酸突變體zju-lpal的獲得
水稻(Oryza sativa L.)低植酸突變體z ju_lpal,由三系晚秈恢復系明恢86 (MH86)通過300Gy的137Cs- Y射線誘變獲得。選育途徑如下2002年夏，輻照MH86水稻幹種子，杭州種植混收M1:2種子；2003年夏，單株種植收穫M2:3種子，檢測無機磷(Pi)含量，篩選含高無機磷(HIP)籽粒植株7個；2004年冬海南陵水南繁基地加代獲得4個純合HIP株系，2個純合HIP植株，另I個材料仍在分離；2005年杭州夏繼續種植獲得2份純合HIP株系，I份純合HIP植株；上述材料擴大種植形成7個HIP株系，依次命名為zju-lpal-Ι zju-lpal-7。等位性測驗表明zju-lpal-Ι zju_lpal_7之間相互等位,但與本實驗室獲得的另外3個低植酸材料互不等位，為I個新低植酸突變材料，該基因命名ZJU-LPA1。其等位突變體Z9_lpa為秈稻品種「中9B」通過300Gy137Cs-Y射線採用上述相似方法誘變篩選獲得。相比野生型，zju-lpal-Ι突變體植酸含量下降44%，無機磷含量升高3. 4倍，總磷含量基本不變(圖I)。Z9-lpa突變體植酸含量下降40%，無機磷含量升高 I. 5 倍，總磷含量基本不變(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren, X. L.，Fu, H. ff.，Wu, D. X.，andShu, Q. Y. 2007.Generation and characterization of low phytic acid germplasm in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 114(5) :803-814)。2、遺傳分析和定位群體構建純合的zju-lpal-1突變體分別和正常表型粳稻品種日本晴和DHl進行雜交，F1代自交，得到F2群體，在分櫱盛期每個單株標記並取I克左右的嫩葉，然後單株收穫F2:3種子，鑰酸銨比色法檢測水稻種子的無機磷含量,每株檢測8粒。從中選出一共1181株LPA突變表型的個體為定位群體，找出對應的編號葉片，用來提取總DNA。3、ZJU-LPAl 基因的定位採用水稻微量DNA提取法從水稻葉片中提取用於基因定位的基因組DNA。具體如下取約0. 2克水稻葉片放入I. 5ml離心管中並使用組織磨樣器將樣品磨碎，CTAB法提取總DNA，溶解在200 μ I滅菌超純水中作為DNA樣品，每個PCR反應使用I. 5 μ I樣品。ZJU-LPAl基因的初步定位通過鑰酸銨無機磷比色法檢測上述定位群體的F2:3種子，首先選取197個隱性樣本，組成小群體，結合基因池法，進行SSR多態性分析。根據公布的粳稻和秈稻創建的分子遺傳圖譜，選取平均分布在各染色體上的SSR引物，根據已知的反應條件進行PCR擴增，PCR反應體系包括10 X PCR緩衝液2. O μ I (含Mg2+)，上、下遊引物(濃度分別為 10 μ Μ)各 0. 4 μ 1，IOmM 的 dNTP 0. 4 μ 1，DNA 模板 I. 5 μ I ;0· 2 μ I 的 5U/TagDNA聚合酶，補滅菌水至20 μ I。PCR程序為94°C預變性5min ;然後94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，35個循環；最後72°C延伸7min。經8 %的非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，硝酸銀染色，檢測PCR產物的多態性，將ZJU-LPAl基因初步定位在水稻第4號染色體長臂上的RM5478和RM17567分子標記之間(圖2)。ZJU-LPAl基因的精細定位從上述定位群體中，擴大定位單株至1181株，在初步定位的基礎上繼續設計SSR、InDeUCAPS標記，最終將ZJU-LPAl基因精確定位於BAC號為AL606690區段上112kb的範圍之內，兩邊的分子標記分別為CAPS3和ID26,並且與分子標記CAPS2和ID19共分離(圖3)。表I、基因定位主要引物及其序列
權利要求
1.一種水稻植酸相關基因Zju-LPAl，其特徵在於，鹼基序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種如權利要求I所述水稻植酸相關基因ZJU-LPAl編碼的蛋白質，其特徵在於，胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種培育低植酸水稻的方法，包括 利用射線對水稻種子進行射線誘變處理，種植若干代後，篩選水稻ZJU-LPAl基因表達框被破壞的純合型突變體； 所述水稻ZJU-LPAl基因的喊基序列如SEQ ID NO. I所不。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述水稻種子的品種為三系晚秈恢復系「明恢86」和三系秈稻恢復系「中9B」。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述射線為137Cs-Y射線。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述射線誘變劑量為300Gy。
7.一種培育低植酸水稻的方法，包括 (1)構建ZJU-LPAl基因RNAi的髮夾結構單元； (2)將所述髮夾結構單元連入原始載體，構建植物表達載體； (3)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織； (4)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述原始載體為pCAMBIA1301-35SN。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，將所述低植酸水稻植株種植若干代，獲得性狀穩定的株系。
全文摘要
本發明公開了一種水稻植酸相關基因ZJU-LPA1及培育低植酸水稻的方法，該基因的鹼基序列如SEQ ID NO.1所示；本發明還公開了培育低植酸水稻的方法，包括構建包含水稻ZJU-LPA1基因的髮夾結構單元；將所述髮夾結構單元連入原始載體，構建植物表達載體；將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織；將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。該基因編碼含有Sulfate Transporter和STAS兩個結構域的表達蛋白，不僅豐富了植酸代謝的網絡途徑，也為利用該基因進行水稻LPA育種和分子設計育種提供新的基因資源和理論指導。
文檔編號C12N15/84GK102864156SQ20121036457
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者趙海軍, 舒慶堯, 劉慶龍, 崔海瑞, 李珊 申請人:浙江大學