O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型基因工程多肽疫苗及其製備和用途的製作方法
2023-04-23 21:22:11
專利名稱：O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型基因工程多肽疫苗 及其製備和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的口蹄疫多肽疫苗，特別是一種0型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗及其製備方法和用途。
背景技術：
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是畜牧業中偶蹄類動物(豬、牛、羊及駱駝)的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，造成疫情發生的國家和地區的巨大的經濟損
失。 口蹄疫是一個全球性的問題，這種疾病的流行曾對德國(1937-1938)、土耳其(1964-1965)、英國(1967-1968、2007、2009)、奧地利(1973)、法國(1974)、韓國(2000、2002、2010、2011)、日本(2000、2010)、朝鮮(2011)等國家造成巨大的經濟損失。目前，世界上大多數的國家屬於「口蹄疫疫區」，非口蹄疫的國家或地區僅佔少數。我國是口蹄疫疫區，每年都有數次至十數次疫情報導至世界動物衛生組織(Office international desepizooties, 0IE)。口蹄疫的臨床診斷特點為口腔黏膜、蹄部和乳房的皮膚發生水皰和潰爛，由口蹄疫病毒引起，對於畜牧業，豬、牛及羊的飼養及畜產品的貿易危害極大。口蹄疫病毒(Footand mouth disease virus, FMDV)屬於細小RNA病毒,對豬、牛及羊傳染途徑多,毒力強，一頭病牛的排毒量可感染100萬頭牛，I克病豬蹄部水皰皮可使10萬頭豬感染髮病。易於傳播，傳播迅速，流行面廣，生產性能下降，防治費用高，發病率100%，成年畜死亡率一股1-2 %，但幼畜高達50 %，甚至100 %。口蹄疫病毒顆粒中含有一條正鏈極性的、由8500個核苷酸組成的單鏈RNA。病毒顆粒的囊膜包括包繞單鏈RNA的四種結構蛋白VPl (分子量34000)、VP2 (分子量30000)、VP3(分子量26000)、VP4(分子量13500)。四種結構蛋白每種60個分子構成一個二十面體病毒粒子。二十面體的頂點由結構蛋白VPl的免疫決定簇區域為141-160區域和200-213區域。口蹄疫病毒具有顯著的抗原多樣性，目前發現的FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asial (亞洲I型)7個血清型。每種血清型還可以繼續分成多種亞型。中國原為0型口蹄疫流行區，從2009年7月份開始至2010年6月，我國總共向世界動物衛生組織報告了 36起口蹄疫疫情，其中2010年1-6月份，向世界衛生組織上報豬口蹄疫疫情12次，均為0型口蹄疫的不同亞型。對於口蹄疫，注射疫苗是目前預防口蹄疫的最有效手段。但是，中國存在多個0型口蹄疫的亞型，主要的就有8種，為免疫工作帶來難題。免疫疫苗有免疫疫苗有I、減毒疫苗及滅活疫苗傳統的減毒疫苗及滅活疫苗是利用大量培養動物細胞，然後感染口蹄疫病毒，經過培養、分離病毒，再用化學試劑使病毒滅活或減毒後製備而成。減毒疫苗及滅活疫苗只能針對O型口蹄疫的某一個亞型，不能覆蓋多種亞型。由於病毒不斷發生變異，目前我國O型口蹄疫緬甸亞型常見。減毒疫苗及滅活疫苗是我國目前主要使用的口蹄疫疫苗，但是，未能滿意控制O型口蹄疫緬甸亞型疫情。2、核酸疫苗核酸疫苗，又稱DNA疫苗。其機理是動物細胞攝取質粒DNA後，動物細胞可以使質粒DNA表達形成多肽抗原，引起動物的特異性免疫應答。口蹄疫核酸疫苗在國內外的研究中均顯示其對口蹄疫具有一定的免疫保護效果，但是目前為止，其免疫保護效果與滅活疫苗相比未顯示其理論上的優勢。就目前的技術而言，核酸疫苗的生產周期長，其技術不適合大規模生產。其次，最為重要的是安全性問題，主要有以下幾個方面質粒DNA可能誘導自身免疫反應；肌肉注射質粒後，僅有很少部分被肌細胞攝取，質粒去向如何尚待進一步查明；影響核酸疫苗誘發機體免疫應答的因素很多，效果不太確定；外源DNA注入體內後，可能整合到宿主基因組上， 使宿主細胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主細胞轉化成癌細胞。3、多肽疫苗合成多肽疫苗能克服常規疫苗的缺點，很早就被認為是動物傳染病預防用的終極疫苗。1982年研發出人工合成的多肽苗。使用大腸桿菌作為寄主細胞發酵培養時間只需20個小時，周期比用動物細胞生產滅活疫苗短得多，基因工程疫苗對環境沒有汙染，沒有洩露的危險，非常安全，且生產出的疫苗在貯藏、運輸和使用過程中不需要冷藏，效價穩定。因此，製備出免疫效價提高而且可用於多個亞型或多價基因工程口蹄疫疫苗是我們不斷追求的目標。20多年來多肽疫苗的研究多集中在VPl外殼蛋白的B細胞單一免疫決定簇，進一步研究表明結構蛋白VPl的免疫決定簇為141-160區域和200-213區域，這兩個區域的多肽片段與載體蛋白經化學聯接後產生的抗體能中和病毒粒子(Nature，1982，298 :30-33 ；J.Virology,2000, 74 :4902-4907 ；J.Virology,2001, 75 :3164-3174 ；J. Virology,2003,77 :8633-8640 ；Vaccine, 2002, 20 :2603-2610)。然而因中和抗體產生較少，合成多肽疫苗免疫動物後所起的免疫保護作用並沒有人們當初設想的那麼理想，利用價值甚至一度被否認。在誘導機體產生免疫的過程中，單一的中和抗原表位是遠遠不夠的。近年來的研究證明除了口蹄疫病毒的VPl的B細胞免疫決定簇之外，需要VP4的T細胞免疫簇協同作用，可獲得很好的免疫中和抗體保護效果。如復旦大學等單位研製的Asial基因工程疫苗含T-helper和VPl免疫決定簇疫苗具有保護效果，能夠產生中和抗體。再如美國UBI公司合成的多肽疫苗具有T-細胞Helper多肽與VPl的B細胞免疫決定簇多肽，大大增強了中和抗體的作用(10倍左右)，具有明確的免疫保護效果。具有良好的安全性無發熱症狀、無過敏反應發生、注射部位無吸收不良現象、對妊娠母豬的健康狀況和妊娠沒有影響，對產仔成績也沒有影響。但是，其缺點是只能覆蓋0型口蹄疫的某一個亞型，在口蹄疫病毒迅速變異的今天，已不能滿足需要。目前需要大量、廉價生產能覆蓋多個0型口蹄疫亞型多肽類疫苗。但是，化學合成超過20個胺基酸的肽鏈非常昂貴。因此，需要發展生物技術通過基因工程大量生產多肽。然而，實際應用還距離很遠。根據近20年對多肽的研究報告，除胰島素外，基因工程並不比化學合成具有優勢。根本原因是基因工程的理論發展與實際應用尚有待發展，況且，多肽在體內迅速降解不利於相應抗體的誘導產生。應利用基因工程技術製備FMDV多肽疫苗。與其他基因工程多肽產品一樣，生產需解決一系列的上遊設計與下遊工藝問題。儘管有很多報導，離應用尚遠。
發明內容
本發明的目的在於克服已有技術的缺陷，提供一種新型的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗及其製備方法和用途。本發明的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，由I個基因工程菌製備，口蹄疫病毒外殼蛋白有四種，即VP1、VP2、VP3、VP4，該基因工程菌包含O型口蹄疫常見的3種亞型，其中2種緬甸亞型為Mya/7/2002, GenBank DQ164928. I 以及 0/Mya/13/89, GenBank DQ164924. 1，另一種常見的O型口蹄疫亞型為Wuhan 2006，GenBank DQ478936. 1，以及我們根據常見的O型各亞型設計的VPl通用序列(CN :201010199712. 2)，取VP4的T-細胞helperl5個胺基酸的片段的DNA序列及3種亞型VPlB細胞決定簇的DNA序列和VPl通用序列的DNA序列進行串聯，克隆，其表達產物可以刺激產生O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的抗體。 多肽疫苗的核苷酸排列序列SEQ ID為 GAATTCAGCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGGGATCTAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGGGATCTAACGGTAACTGCAAATACGCGCAGGGTCCGCTGGCGAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGAAAAACAGCTGCTGG GATCTAACGGTAACTGCAAATACGGTGAAAACGCGGTTACCAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGAACTAGGTCGAC。為提高生物利用率並增強免疫效果，本發明的疫苗還可以含有藥學上可以接受的載體、輔料和或免疫佐劑等物質。免疫佐劑是一種可以增強免疫反應的物質，其能夠和抗原混合使用，有助於注射物質的沉積或匯集，還能增強抗體反應。本發明的又一目的是提供所述口蹄疫疫苗的構建方法。基因工程菌其中含有串聯的基因以大腸桿菌(E.Coli)中攜帶的Lac質粒進行表達，得到具有理想的免疫原性的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗。與抗體進行免疫實驗獲得很好的效果。因為串聯表達獲得的是蛋白大分子，產生中和抗體的量明顯增加，疫苗在體內的半衰期也得到延長。本發明的又一目的是提供能夠表達所述口蹄疫多肽疫苗的一種基因工程菌株。以及提供所述口蹄疫多肽疫苗在防治O型口蹄疫疾病中的用途，用本發明的多肽製備成疫苗，可防治O型口蹄疫多種亞型，以緬甸亞型為主。本發明還提供了 O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗製備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的製備，將基因工程菌的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體並在表達系統中進行表達的步驟，經高密度發酵，細胞破碎、包涵體復性，融合蛋白的分離純化，凍幹後即可獲得抗原蛋白產品，與佐劑勻漿形成多肽疫苗。本發明的基因重組、重組融合蛋白的製備製備方法(I)為合成基因工程菌，用化學合成的方法合成編碼VP4的T-細胞helper的15個胺基酸片段的DNA序列及3種亞型VPl B細胞決定簇的DNA序列及VPl通用序列的DNA序列進行串聯VP4T heIper-VPI (Wuhan 2006，GenBank DQ478936. I)-VPl (Mya/7/2002,GenBank :DQ164928. I)-VPl (0/Mya/1 3/89 , GenBank :DQ164924. I)-VPl(CN 201010199712. 2)，克隆；(2)為合成基因工程菌，將全部DNA序列插入Lac質粒載體； (3)將上述重組質粒轉入大腸桿菌(E. Coli.)進行表達，得到基因工程菌株；(4)將菌株置於營養豐富的LB培養基中發酵，發酵溫度37°C，發酵時間為12_24小時，發酵液中加入氨苄西林使其最後濃度為50μ g/ml，及IPTG，濃度為O. 5mM，發酵結束後離心獲得菌體，經細胞粉碎，包涵體復性，融合蛋白的分離純化，凍幹即可獲得產品，與佐劑勻漿形成O型口蹄疫病毒中以緬甸亞型為主3個亞型的基因工程多肽疫苗。使用本發明的疫苗具有以下優點I)安全性好，本發明是基因工程產品，不是滅活疫苗，不存在因痕量活病毒洩露而引起疾病爆發的危險。在實驗動物中，以較高劑量的疫苗對小鼠進行皮下注射，在較長的觀測期內，實驗動物健康存活。2)本發明的疫苗適用於基因工程的方法大規模生產，降低了成本。3)本發明的疫苗生產製備的安全性高，汙染少，沒有洩露的危險。4)本發明的疫苗含有O型口蹄疫病毒3種亞型VPl免疫決定簇，以緬甸亞型為主，適應目前口蹄疫病毒變異情況，可以在我國廣大地區適用。5)本發明的疫苗含有VP4的T-Helper多肽，大大增強了中和抗體的作用，多肽的分子量大，在體內的半衰期延長，其產生中和抗體的時間也大大延長，免疫後抗病毒效果好。6)貯藏運輸保存無需冷鏈，降低成本。
圖10型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗基因工程菌的DNA 序列 SEQ ID ；圖2是質粒的構建過程示意圖，圖示如何將基因片段插入質粒的過程；圖3是4個基因片段的DNA序列；圖4是O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的多肽疫苗基因工程菌(E.Coli)在發酵過程中的生長圖譜(12hr，發酵罐瑞士比歐，100L)。4 個 DNA 片段分別是片段 I :VP4T heIper-VPI (Wuhan 2006, GenBank DQ478936. I)；片 g 2 VP1(Mya/7/2002, GenBank DQ164928. I)；片段 3 :_VP1(0/Mya/13/89, GenBank DQ164924. I);片段 4 VP1 (CN :201010199712. 2)。
具體實施例方式實施例一本發明一方面提供了新型的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，含有SEQ ID所示的核酸序列所編碼的多肽。SEQ ID含有用化學合成的方法合成的VP4的T-細胞helperl5個胺基酸的片段的DNA序列及3種亞型VPl B細胞決定簇的DNA序列及VPl通用序列的DNA序列進行串聯VP4 T helper-VPl (Wuhan 2006, GenBank DQ478936. I)-VPl(Mya/7/2002, GenBank DQ164928. I)-VPl(0/Mya/13/89, GenBank DQ164924. I) -VPl (CN :201010199712. 2)，克隆，其表達產物可以刺激產生O型口蹄疫病毒含緬甸亞型的3個亞型的抗體。參見圖I、圖2、圖3和圖4。為提高生物利用率並增強免疫效果，本發明的疫苗還可以含有藥學上可以接受的載體、輔料和或免疫佐劑等物質。 免疫佐劑是一種可以增強免疫反應的物質，其能夠和抗原混合使用，有助於注射物質的沉積或匯集，還能增強抗體反應。可作為免疫佐劑的物質有1)微生物及其產物，如分枝桿菌、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌以及處左蘭氏陰性桿菌的提取物脂多糖，自分枝桿菌的提取物胞壁醯二肽等。2)多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚腺苷酸、多聚左旋穀氨酸等。3)福氏佐劑(Freund' sadjuvant)，包括不完全福氏佐劑(將抗原水溶液與油劑(石蠟油或植物油)等量混合，再加乳化劑(羊毛脂或吐溫80)製成的油包水抗原乳劑)和完全福氏佐劑(在不完全佐劑中加入分枝桿菌如卡介苗)。4) Seppic MONTANIDE ISA 50V2。5)無機物，如明礬及氫氧化鋁
坐寸ο近年來，發現以下物質也可作為免疫佐劑，包括1)細菌毒素，如霍亂毒素(CT)和大腸桿菌熱不穩定毒素(LT)。2) CT和LT的減毒衍生物或變異體。3)人內生性免疫調節因子，如IL-2、IL-12、GM-GSF。4)激素。5)脂肽。6)皂角苷，皂角苷衍生物QS-21。7)含有CpG motif的合成的寡核苷酸片段(CpG 0DN)。8)類脂A的衍生物，如脂多糖衍生物單磷醯脂A(MPL)。9)胞壁醯二肽(MDP)的衍生物。10) Y -多聚穀氨酸ploy-Y-glutamic acid。此外，某些具有內在的免疫刺激活性的遞送系統也可作為免疫佐劑用於疫苗構建，這些遞送系統包括但不限於脂質體、乳劑、螺狀體(cochleate)、病毒顆粒、微粒子和免疫刺激複合物(ISCOMs)。 上述各種類型的免疫佐劑均可用於本發明。佐劑可以以合適的劑量與本發明具有免疫原性的多肽配合使用，形成本發明的疫苗。優選的，本發明的疫苗含有S印pic MONTANIDE ISA 50 V2或不完全福氏佐劑，不完全福氏佐劑中羊毛脂和石蠟油的比率隨季節的變化略有不同，如，春、夏、秋季羊毛脂和石蠟油的比率約為3 7，冬季二者的比率約為1.5 8.5。更優選的，本發明的疫苗含有Seppic MONTANIDE ISA 50 V2 作為免疫增強劑。本發明又一方面提供了一種製備所述的基因工程疫苗的方法，包括將SEQ ID所示的核苷酸序列，可以直接合成，也可先合成若干個DNA片段，退火連接後產生如SEQ ID所示的DNA序列。為了後續操作的方便，在設計DNA片段時，可以將合適的酶切位點引入序列兩端，以便將靶序列克隆入合適的載體。在本發明的一個優選實施方案中，為合成基因工程菌的載體，本發明人設計合成口蹄疫病毒毒株合成編碼VP4的T-細胞helperl5個胺基酸的片段的DNA序列及3種亞型VPl B細胞決定簇的DNA序列及VPl通用序列的DNA序列進行串聯VP4T helper-VPl (Wuhan 2006，GenBank DQ478936. I)-VPl(Mya/7/2002, GenBank DQ164928. I)-VPl(0/Mya/13/89, GenBank DQ164924. I)-VPl(CN :201010199712. 2)，由 4 個 DNA 片段(片段 I :VP4T helper-VPl (Wuhan 2006，GenBank DQ478936. I)；片段 2 VP1(Mya/7/2002, GenBank DQ164928.I)；片段 3 -VPl (0/Mya/13/89, GenBank DQ164924. I);片段4 :VPI (CN :201010199712. 2)，4個基因片段的DNA序列參見圖3)，退火後連接產生含有SEQ ID所示的核酸序列和合適的限制性內切酶切點。利用基因工程的方法將SEQ ID克隆到載體，在合適的表達系統中進行表達後，得到多肽。在本發明的製備方法中，用於多肽表達的表達系統可以是原核表達系統，還可以是真核表達系統。表達系統包括合適的宿主細胞，以及能夠在宿主細胞中複製並穩定存在 的質粒或載體。可以作為宿主細胞的例子包括但不限於細菌細胞，如大腸桿菌、鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌等；真核細胞，如酵母等。更優選的是原核表達系統的大腸桿菌(E. Coli.)作為基因工程菌。可以使用的載體可以包括染色體來源的、非染色體來源的及合成的DNA序列。如噬菌體DNA、杆狀病毒、細菌質粒、酵母質粒以及由質粒、噬菌體和病毒DNA組合衍生的載體。優選的，在原核表達系統中表達本發明的多肽。更優選的，可以將本發明的多肽克隆入高效率的表達載體(如市售的表達載體)與載體蛋白進行融合表達。本發明還涉及一種基因工程菌株，其攜帶的質粒含有SEQ ID所示的核酸序列。含Lac載體的O型口蹄疫病毒以緬甸亞型為主3個亞型的多肽疫苗基因工程菌(E. Coli.)在發酵過程中的生長圖譜(12hr，發酵罐瑞士比歐，100L)參見圖4。本發明還提供了所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗在預防和治療口蹄疫中的用途。可以將本發明的疫苗注射給動物，刺激動物體內產生特異性的抗O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的抗體。經實驗,表I是動物體抗原抗體反應的測定結果,抗體為O型及A型口蹄疫標準血清及O型口蹄疫治療後牛血清均由上海市農科院畜牧獸醫研究所提供，抗原為製備的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗。表I :抗原抗體反應
O型標準血清 A型標準血清 O型治療後血清
O型口蹄疫病毒中含+-+
緬甸亞型的3個亞型
的基因工程多肽疫苗___實施例二 I :構建表達質粒
基因工程菌是含O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗的基因的大腸桿菌。為合成基因工程菌的載體，本實施例根據O型口蹄疫病毒毒株合成編碼VP4的T-細胞helperl5個胺基酸的片段的DNA序列及3種亞型VPl B細胞決定簇的DNA序列及VPl通用序列的DNA序列進行串聯VP4T helper-VPl (Wuhan 2006,GenBank DQ478936. I)-VPl(Mya/7/2002, GenBank DQ164928. I)-VPl (0/Mya/13/89,GenBank DQ164924. I)-VPl(CN :201010199712. 2)，由 4 個 DNA 片段(片段 I :VP4Thelper-VPl(Wuhan 2006，GenBank DQ478936. I)；片段 2 VPl(Mya/7/2002, GenBank DQ164928. I)；片段 3 VPI(0/Mya/13/89, GenBank DQ164924. I)；片段 4 VP1(CN 201010199712. 2)，每個片段含有圖I所示的核酸序列和合適的限制性內切酶切點。利用基因工程的方法將4個片段克隆到Lac啟動子表達質粒，4個片段見圖2，克隆後DNA單鏈全序列見圖I。
2 :基因工程菌的目的基因在表達載質粒體pkk223_3中的克隆質粒pkk223_3經過限制性內切酶EcoR I/Bgl 11/BamH I/Sal I酶切之後，將基因按圖3方法分別克隆到pkk223-3質粒中，得到表達質粒。將表達質粒轉入大腸桿菌E. Coli.，在37°C培養，以終濃度為O. 2-0. 5mmol/L的IPTG進行誘導。3 :發酵及下遊工藝250ml種子培養液(1000ml種子培養液含有蛋白腖10g，酵母抽提物5g，0. 02mol/L的磷酸緩衝液20ml，pH7. O)置於1000ml三角燒瓶中，120 °C滅菌20分鐘，冷卻後加入20%的葡萄糖溶液5ml。將Iml低溫保存於甘油中的菌株加入上述溶液，加氨苄西林(Ampicillin)使其最後濃度為50 μ g/ml，37°C，搖床培養12-14小時(150rpm)作為擴大培養的種子菌。IOOOml種子培養液含有蛋白腖20g，酵母抽提物10g，0. 2mol/L的磷酸緩衝液20ml，pH7. 0,120°C滅菌20分鐘，冷卻至37°C後加氨苄西林(Ampicillin)使其最後濃度為50μ g/ml。加入種子培養液20ml，再加入20%的葡萄糖溶液5ml，及微量元素CaCl2、NiN03、CoCl3、MgSO4, FeCl3各lmg，維持所列條件進行發酵(發酵罐100L ;溫度37°C ;攪拌速度700rpm ;通氣量80L/min ；pH7. 0-7. 5)。間隔一定時間各取Iml發酵液置於2個塑料離心管中，8000rpm離心IOmin,除去上清液,稱取菌體重量為溼重(g/L)。如圖3所示,在發酵8-12個小時後，細菌濃度達到峰值。發酵後，4000rpm離心30min收集菌體。菌體以1000g/3L的比例懸浮於含I %的氯化鈉、lmmol/L的EDTA、20mmol/L的磷酸鉀pH7. O的溶液中，在懸浮液中加入Ig溶菌酶，室溫攪拌I小時，以破碎細胞，菌體懸浮液於IOOOOrpm離心30min,棄上清。將上述沉澱以250g/L的比例加入8mol/L的尿素溶液。攪拌、抽提過夜，20000rpm離心30min,取上清,復性後有沉澱產生，以IOOOOrpm離心30min,取沉澱，融合蛋白的分離純化，凍幹即可獲得產品，用無菌水溶解多肽，製成2M尿素溶液，與S印pic MONTANIDE ISA50 V2勻漿後，形成多肽疫苗。4:FMDV疫苗的檢測(I)、試劑
O型及A型口蹄疫標準血清抗體均由上海市農科院畜牧獸醫研究所提供。(2)、樣品含pkk223_3/0型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的多肽疫苗的基因工程菌株經發酵後，離心收集菌體，破碎細胞，用8M尿素抽提，離心後收集沉澱各取lmg，上清各取Iml0沉澱Img加Iml的2M尿素溶液備用，在溶液中各自加入O型及A型口蹄疫標準血清，搖勻，加入O型口蹄疫標準血清產生沉澱反應，溶液混濁；加入A型口蹄疫標準血清不產生沉澱反應，溶液清澈。在上清溶液各自加入O型及A型口蹄疫標準血清，搖勻，均無沉澱反應，溶液清澈。結果表達的融合蛋白與O型口蹄疫標準血清產生抗原抗體反應，而上清液中不含融合蛋白，故對O型口蹄疫標準血清不發生反應。5 :0型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗的抗原抗體反應利用蛋白質在溶液中，抗原抗體可以反應產生沉澱進行本發明疫苗免疫源性的測定。(I)抗原測試品為本發明基因工程菌菌株表達純化後得到的蛋白的2M尿素溶液。(2)抗體0型及A型口蹄疫標準血清抗體均由上海市農科院畜牧獸醫研究所提供。(3)抗原抗體反應0型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗中分別加入O型口蹄疫抗體及A型口蹄疫抗體，根據表I的結果，表明O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗與O型抗體有免疫沉澱反應，與A型抗體無免疫反應。6 :疫苗的安全性實驗(小鼠實驗)雄性昆明/8W小鼠20隻，每隻體重20g左右，購自中科院上海動物中心。分為兩組，一組為O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，另一組為對照組。治療組取Img純化的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗抗原蛋白用Iml無菌水懸浮，對照組注射Iml生理鹽水。對小鼠進行腹腔注射進行觀察I周。所有小鼠均存活，證明O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗是一個安全的藥物。存活率見下表。表2:安全性實驗
權利要求
1.O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，由I個基因工程菌生產製備，口蹄疫病毒外殼蛋白有四種，即VP1、VP2、VP3、VP4，該基因工程菌選擇O型口蹄疫常見的亞型,其中'2種緬甸亞型為Mya/7/2002，GenBank DQ164928. I以及O/Mya/13/89，GenBank DQ164924. I，另一種常見的 O 型口蹄疫亞型為 Wuhan 2006, GenBank DQ478936. 1，以及根據常見的O型各亞型設計的VPl通用序列(CN :201010199712. 2)，取VP4的T-細胞helperl5個胺基酸的片段的DNA序列及3種亞型VPl B細胞決定簇的DNA序列和VPl通用序列的DNA序列進行串聯，克隆，多肽疫苗的核苷酸排列序列SEQ ID為GAATTCAGCATCATCAACAACTACTACATGCAGCAGTACCAGAACAGCATGAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGGGATCTAACGGTAGCTGCCGTTACAGCGATAGCAACGTTAGCAAACTGCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGATCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTTACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGCGAAACAGCTGCTGGGATCTAACGGTAACTGCAAATACGCGCAGGGTCCGCTGGCGAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTCCGCTGCCGCGTCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGAAAAACAGCTGCTGGGATCTAACGGTAACTGCAAATACGGTGAAAACGCGGTTACCAACGTTCGTGGTGATCTGCAGGTTCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTGCGCTGCCGCACAAACAGAAAATCGTTGCGCCGGTTAAACAGCTGCTGAACTAGGTCGAC。
2.如權利要求I所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，其中基因工程菌含有串聯的基因以大腸桿菌中攜帶的Lac質粒進行表達。
3.如權利要求I所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，其中所述的疫苗還包括藥學上可接受的載體、輔料和/或免疫佐劑。
4.如權利要求3所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是福氏不完全佐劑。
5.如權利要求3所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，其中所述的免疫佐劑是S印pic MONTANIDE ISA 50 V2。
6.一種權利要求I所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗的製備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的製備，將基因工程菌的SEQ ID所示的核酸序列克隆入載體並在表達系統中進行表達的步驟，經高密度發酵，細胞破碎、包涵體復性，融合蛋白的分離純化，凍幹後即可獲得抗原蛋白產品，與佐劑勻漿形成多肽疫苗。
7.如權利要求6所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗的製備方法，其中所述核酸序列在原核表達系統中進行表達。
8.如權利要求6所述的O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗的製備方法，其中所述核酸序列在原核表達系統的基因工程菌大腸桿菌(E.Coli.)中進行表達。
9.如權利要求6所述的0型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗的製備方法，其中所述核酸序列在真核表達系統中進行表達。
10.權利要求I所述的0型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗，其用途為預防和治療0型口蹄疫以緬甸亞型為主的3個亞型。
全文摘要
O型口蹄疫病毒中含緬甸亞型的3個亞型的基因工程多肽疫苗及其製備方法和用途，選擇常見的O型口蹄疫病毒中2種緬甸亞型(Mya/7/2002，GenBankDQ164928.1以及O/Mya/13/89，GenBankDQ164924.1)和另一常見的O型口蹄疫亞型(Wuhan 2006，GenBankDQ478936.1)，取VP4的T-細胞helper15個胺基酸的片段的DNA序列及3種亞型VP1 B細胞決定簇的DNA序列及O型口蹄疫病毒VP1通用序列(CN201010199712.2)的DNA序列進行串聯，克隆，不含有載體蛋白，構建1個基因工程菌。經高密度發酵，細胞破碎、包涵體復性，融合蛋白的分離純化，凍幹後獲得抗原蛋白產品，與佐劑勻漿形成疫苗。該疫苗含有SEQ ID所示的核酸序列所編碼的多肽，安全性好，效價高，一次免疫可涵蓋O型口蹄疫病毒常見的3個亞型，可大量無汙染的生產。
文檔編號A61K48/00GK102772796SQ201110123388
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月13日 優先權日2011年5月13日
發明者吳曉琰, 趙泓, 龔鐵軍 申請人:吳曉琰, 趙泓, 龔鐵軍