一種產複合酶的菌株及其製備斷奶仔豬用複合酶的方法
2023-05-19 17:34:11 1
專利名稱：一種產複合酶的菌株及其製備斷奶仔豬用複合酶的方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，特別是一種產複合酶的菌株及其製備斷奶仔豬用複合酶的方法。
背景技術：
隨著養豬業向集約化、規模化方向發展，仔豬早期斷奶已成為養豬生產中普遍採用的重要手段，是國內外養豬生產中普遍關注的先進技術，它能提高母豬的繁殖率，減少疾病由母體向仔豬的傳播，並能提高生長期的生產性能和胴體品質。但隨之而來的早期斷奶綜合症給養豬生產帶來較大損失，仔豬早期斷奶時受心理、環境及營養應激影響，常表現為食慾差、消化功能紊亂、腹灣，由此導致生長遲滯、飼料利用率低等所謂「仔豬早期斷奶綜合症」，這一問題迄今還沒有得到徹底解決。研究者一直在尋找仔豬斷奶綜合症發生的病因，最近二十來年的研究表明，其引發因素主要是營養應激，日糧因素才是導致仔豬腹瀉的主要原因，為滿足仔豬生長快、代謝快的生理需求，仔豬日糧一般具備高蛋白、高營養的特點，斷奶初期，仔豬消化器官及酶系統發育不完全，內源酶酶活性低，使日糧中營養物質的消化吸收進一步降低，過多的大分子蛋白質、澱粉、木聚糖等物質湧入腸道，引起超敏反應，使腸道受到損傷，最終導致仔豬腹瀉。為了有效緩解這種症狀，在配製仔豬飼糧時在仔豬飼料中恰當地選擇和應用仔豬用複合酶製劑是非常必要的。應用單菌種進行固態發酵產生多種酶系，包括消化酶類蛋白酶、澱粉酶和非澱粉多糖酶類木聚糖酶，減少了單酶復配酶種之間相互拮抗作用，降低了酶飼用成本，在早期斷奶仔豬飼料中添加酶製劑，既能改善飼料利用率和提高仔豬生產性能，且無毒、無副作用、無殘留，不僅能全面促進飼糧養分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除飼料抗營養因子的有害作用，提高仔豬的生產性能和增進健 康。飼用酶製劑的研究開發和推廣使用是生物技術在飼料工業中應用的一個引人矚目的領域，這使飼料工業高效、環保和可持續發展成為可能。
發明內容
針對上述情況，本發明的目的就是提供一種產複合酶的菌株及其製備斷奶仔豬用複合酶的方法，可有效解決斷奶仔豬對現有飼料難以消化吸收，引起斷奶仔豬的超敏反應，使腸道受到損傷，最終導致仔豬腹瀉的問題。本發明的技術方案是，一種產複合酶的菌株，其分類命名為黑麴黴菌(Aspergillus niger) HKSlI,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6027 ;所述的複合酶為包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的斷奶仔豬用複合酶；
利用該菌株製備斷奶仔豬用複合酶的方法，包括以下步驟
(O從斜面保藏培養基上取黑麴黴菌菌株接種到一級種子培養基上，在28 32°C下，培養72h 96h，進行菌種活化，得活化的菌株；
(2)將活化的菌株從一級種子培養基上接種到二級種子培養基上，在28 32°C下，培養65h 84h,得二級種子；
(3)將二級種子接種到固體發酵罐中的發酵培養基上，在相對溼度為90%以上，溫度為29°C的條件下，發酵培養24 32h，發酵結束後，得包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的複合酶，並對酶活性進行測定；
所述的斜面保藏培養基由以下重量計的=NaNO3 3. 0g, KCL O. 5g，FeSO4 · 7 H2O O. Olg,K2HPO4 I. 0g, MgS047H20 O. 5g，蔗糖 30. O g，瓊脂 15. O g，蒸餾水 IOOOmL 製成；所述的一級種子培養基由以下重量計的黃豆1000g、MgS047H20 O. 5g、可溶性澱粉2. 0g、KH2PO4 I. 0g、(NH4) SO4 0. 5g、瓊脂15. 0 g，蒸餾水IOOOmL製成；所述的二級種子培養基由以下重量計的麩皮950g，豆柏粉50g，水IOOOmL製成；所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮50 70Kg，小麥麵粉 5 10Kg，豆柏粉 20 40Kg，玉米芯粉 5 10Kg，MgS047H20 0. 05Kg, K2HPO40. lKg，水 IOOL 製成。 本發明利用微生物菌株發酵，生產複合酶，成本低，原料豐富易得，節能環保，生產的斷奶仔豬用複合酶添加到仔豬飼料中，既能改善飼料利用率和提高仔豬生產性能，且無毒、無副作用、無殘留，不僅能全面促進飼糧養分的分解消化和吸收利用，而且能有效地消除飼料抗營養因子的有害作用，提高仔豬身體素質，促進健康生長。
圖I為實施例I中CGMCC No. 6027菌株在100L固體發酵罐中發酵產酶過程曲線。生物材料樣品保藏
一株產包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的複合酶的菌株，該菌株為黑麴黴菌(Aspergillus niger) HKSlI,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6027，保藏時間為2012年4月23日。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明的具體實施方式
作詳細說明。本發明的技術方案是，一種產複合酶的菌株，其分類命名為黑麴黴菌(Aspergillus niger) HKSlI,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6027 ;所述的複合酶為包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的斷奶仔豬用複合酶；
利用該菌株製備斷奶仔豬用複合酶的方法，包括以下步驟
(O從斜面保藏培養基上取黑麴黴菌菌株接種到一級種子培養基上，在28 32°C下，培養72h 96h，進行菌種活化，得活化的菌株；(2)將活化的菌株從一級種子培養基上接種到二級種子培養基上，在28 32°C下，培養65h 84h，得二級種子；(3)將二級種子接種到固體發酵罐中的發酵培養基上，在相對溼度為90%以上，溫度為29°C的條件下，及時開通無菌空氣調節系統和全霧化補水系統，實現溫度自控和保持溼度，發酵培養24 32h，發酵結束後，得包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的複合酶，並對酶活性進行測定；
所述的斜面保藏培養基由以下重量計的=NaNO3 3. 0g, KCL O. 5g，FeSO4 · 7 H2O O. Olg,K2HPO4 I. 0g, MgS047H20 0. 5g，蔗糖 30. O g，瓊脂 15. O g，蒸餾水 IOOOmL 製成；所述的一級種子培養基由以下重量計的黃豆1000g、MgS047H20 0. 5g、可溶性澱粉2. 0g、KH2PO4 I. 0g、(NH4) SO4 O. 5g、瓊脂15. 0 g，蒸餾水IOOOmL製成；所述的二級種子培養基由以下重量計的麩皮950g，豆柏粉50g，水IOOOmL製成；所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮50 70Kg,小麥麵粉 5 IOKg,豆柏粉 20 40Kg,玉米芯粉 5 IOKg, MgS047H20 O. 05Kg, K2HPO4O. lKg，水 IOOL 製成。以麩皮和小麥麵粉質量比以9:1復配作為培養基碳源時發酵產蛋白酶的活力較聞。以豆柏粉作為氮源時發酵產蛋白酶的活力較高。以麩皮和小麥麵粉作為碳源、豆柏粉作為氮源、玉米芯粉作為疏鬆填充料(酶載體)，添加適量無機鹽MgS047H20，K2HPO4組成的培養基時，發酵產蛋白酶的活力較高。本發明所述產複合酶的菌株在製備斷奶仔豬用複合酶中，可由以下實施例實現。
實施例I
黑麴黴菌株CGMCC No. 6027在100L固體發酵罐中發酵產酶，從斜面保藏培養基斜面上接一環CGMCC No. 6027菌種入一級種子培養基斜面上，進行菌種活化，在28 32°C，培養時間為72h 96h後，從一級種子培養基斜面上接三環一級種子菌種入二級種子培養基(二級種子培養基60g/1000mL三角瓶)，在28 32°C，培養時間為65h 84h後，以發酵培養基重量O. 2%的接種量接入到100L固體發酵罐中的發酵培養基上。100L固體發酵罐中發酵培養基為50Kg，溫度為29°C，相對溼度為90%以上，發酵時間24 32h。及時開通無菌空氣調節系統和全霧化補水系統，實現溫度自控和保持溼度。發酵設備為鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司SF-100A固態發酵罐。發酵結束時，蛋白酶酶活力最高值為3800 μ/g，澱粉酶酶活力最高值為121 μ /g,木聚糖酶酶活力最高值為6300 μ /g。所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮54Kg，小麥麵粉6 Kg,豆柏粉35 Kg,玉米芯粉 5 Kg, MgSOJH2O O. 05Kg, K2HPO4 O. lKg，水 100L 製成。實施例2
黑麴黴菌株CGMCC No. 6027在100L固體發酵罐中發酵產酶，從斜面保藏培養基斜面上接一環CGMCC No. 6027菌種入一級種子培養基斜面上，進行菌種活化，在28 32°C，培養時間為72h 96h後，從一級種子培養基斜面上接三環一級種子菌種入二級種子培養基(二級種子培養基60g/1000mL三角瓶)，在28 32°C，培養時間為65h 84h後，以發酵培養基重量O. 2%的接種量接入到100L固體發酵罐中的發酵培養基上。100L固體發酵罐中發酵培養基為50Kg，溫度為29°C，相對溼度為90%以上，發酵時間24 32h。及時開通無菌空氣調節系統和全霧化補水系統，實現溫度自控和保持溼度。發酵設備為鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司SF-100A固態發酵罐。發酵結束時，蛋白酶酶活力最高值為3700 μ/g，澱粉酶酶活力最高值為110 μ /g，木聚糖酶酶活力最高值為6270 μ /g。所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮50Kg，小麥麵粉10Kg，豆柏粉40Kg，玉米芯粉 IOKg, MgS047H20 O. 05Kg, K2HPO4 O. lKg，水 100L 製成。實施例3
黑麴黴菌株CGMCC No. 6027在100L固體發酵罐中發酵產酶，從斜面保藏培養基斜面上接一環CGMCC No. 6027菌種入一級種子培養基斜面上，進行菌種活化，在28 32°C，培養時間為72h 96h後，從一級種子培養基斜面上接三環一級種子菌種入二級種子培養基(二級種子培養基60g/1000mL三角瓶)，在28 32°C，培養時間為65h 84h後，以發酵培養基重量O. 2%的接種量接入到IOOL固體發酵罐中的發酵培養基上。100L固體發酵罐中發酵培養基為50Kg，溫度為29°C，相對溼度為90%以上，發酵時間24 32h。及時開通無菌空氣調節系統和全霧化補水系統，實現溫度自控和保持溼度。發酵設備為鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司SF-100A固態發酵罐。發酵結束時，蛋白酶酶活力最高值為3750 μ/g，澱粉酶酶活力最高值為117 μ /g，木聚糖酶酶活力最高值為6180 μ /g。所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮70Kg，小麥麵粉5Kg，豆柏粉20Kg，玉米芯粉 5Kg, MgS047H20 O. 05Kg, K2HPO4 O. lKg，水 100L 製成。本發明方法簡單，生產周期短，成本低，原料豐富易得，節能環保，易於生產，應用效果好，並經試驗取得了滿意的效果，有關試驗資料如下
採用以下分析方法對所得複合酶的活性進行測定 A.酸性蛋白酶分析方法福林-酚試劑法測定。A. I 試劑
A.I. I福林試劑
於2000mL磨口回流裝置中，加入鎢酸鈉(Na2W042H20) 100. Og,鑰酸鈉(Na2Mo042H20)25. Og,蒸餾水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸IOOmL,文火回流10小時，取出冷凝器，加入硫酸鋰(LiSO4) 50. Og,蒸餾水50mL混勻，加入幾滴溴水，再煮沸5分鐘，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液呈黃色而非綠色。若仍有綠色，需再加幾滴溴液再煮沸除去。冷卻後，定容至IOOOmL,細菌漏鬥(NO. 4 5)過濾，置於棕色瓶中保存，此溶液使用時，加2倍蒸餾水稀釋，即成已稀釋的福林試劑。A. I. 2 0. 4mol Na2CO3 溶液稱取無水 Na2C0342. 4g,定容至 1000mL。A. 1.3 0. 4mol三氯乙酸(TCA)溶液稱取三氯乙酸65. 4g，定容至1000mL。A. I. 4 0. 05mol ρΗ2· 5 乳酸-乳酸鈉緩衝液
a液稱取80% — 90%的乳酸10. 6g，加蒸餾水稀釋定容至1000mL。b液稱取70%乳酸鈉16g，加水稀釋定容至1000mL。取a液16mL和b液ImL混合稀釋I倍即成。A. I. 5 2%酪蛋白溶液
稱取乾酪素2. 000g,精確至0. 002g,加入濃乳酸10mL，在水浴中加熱使溶解(必要時，用小火加熱煮沸)。然後用PH2. 5乳酸-乳酸鈉緩衝液定容至IOOmL即成。配製後，放入冰箱內保存。A. I. 5 100ug/mL 酪氨酸溶液
精確稱取在105°C烘箱中烘至恆重的酪氨酸0. lOOOg，逐步加入6mL IN鹽酸使溶解，用0. 2N鹽酸定容至IOOmL,其濃度為1000 μ g/mL。再吸取此溶液10mL，以0. 2N鹽酸定容至IOOmL,即成100 μ g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成後應及時使用或放入冰箱保存，以免繁殖細菌而變質。A.2標準曲線繪製
按表I配製各種不同濃度的酪氨酸溶液 表I配製不同濃度的酪氨酸濃度
權利要求
1.一種產複合酶的菌株,其特徵在於,其分類命名為黑麴黴菌(As/76 r^77A/5· niger)HKSlI,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.6027。
2.根據權利要求I所述的產複合酶的菌株，其特徵在於，所述的複合酶為包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的斷奶仔豬用複合酶。
3.權利要求I所述的產複合酶的菌株製備斷奶仔豬用複合酶的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)從斜面保藏培養基上取權利要求I所述的菌株接種到一級種子培養基上，在28 32°C下，培養72h 96h，進行菌種活化，得活化的菌株； (2)將活化的菌株從一級種子培養基上接種到二級種子培養基上，在28 32°C下，培養65h 84h,得二級種子； (3)將二級種子接種到固體發酵罐中的發酵培養基上，在相對溼度為90%以上，溫度為29°C的條件下，發酵培養24 32h，發酵結束後，得包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶的複合酶，並對酶活性進行測定； 所述的斜面保藏培養基由以下重量計的=NaNO3 3. 0g, KCL O. 5g，FeSO4 · 7 H2O O. Olg,K2HPO4 I. 0g, MgSO4·7Η20 O. 5g，蔗糖 30. O g，瓊脂 15. O g，蒸餾水 IOOOmL 製成； 所述的一級種子培養基由以下重量計的黃豆1000g、MgSO4·7Η20 O. 5g、可溶性澱粉2.0g、KH2PO4 I. 0g、(NH4) SO4 0. 5g、瓊脂 15. 0 g,蒸餾水 IOOOmL 製成； 所述的二級種子培養基由以下重量計的麩皮950g，豆柏粉50g，水IOOOmL製成； 所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮50 70Kg，小麥麵粉5 10Kg，豆柏粉20 40Kg，玉米芯粉 5 10Kg, MgSO4.7H20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 製成。
4.根據權利要求3所述的產複合酶的菌株製備斷奶仔豬用複合酶的方法，其特徵在於，所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮54Kg，小麥麵粉6 Kg,豆柏粉35 Kg,玉米芯粉 5 Kg, MgSO4·7Η20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 製成。
5.根據權利要求3所述的產複合酶的菌株製備斷奶仔豬用複合酶的方法，其特徵在於，所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮50Kg，小麥麵粉10Kg，豆柏粉40Kg，玉米芯粉10Kg, MgSO4·7Η20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 製成。
6.根據權利要求3所述的產複合酶的菌株製備斷奶仔豬用複合酶的方法，其特徵在於，所述的發酵培養基由以下重量計的麩皮70Kg，小麥麵粉5Kg，豆柏粉20Kg，玉米芯粉5Kg, MgSO4·7Η20 0. 05Kg, K2HPO4 0. lKg，水 100L 製成。
全文摘要
本發明涉及一種產複合酶的菌株及其製備斷奶仔豬用複合酶的方法，可有效解決斷奶仔豬對現有飼料難以消化吸收，引起超敏反應的問題。本發明菌株為黑麴黴菌(Aspergillusniger)HKS11，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.6027；所產的複合酶包括蛋白酶、澱粉酶及木聚糖酶。利用該菌株製備複合酶的方法包括菌種活化，二級種子的獲得，固體發酵罐中發酵培養。本發明製備成本低，原料豐富易得，節能環保，生產的斷奶仔豬用複合酶添加到仔豬飼料中，能改善飼料利用率並提高仔豬生產性能，促進健康生長。
文檔編號C12R1/685GK102732433SQ20121019820
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者丁芳, 劉德海, 權淑靜, 胡宜亮, 解復紅, 賈彬, 陳國參, 馬煥 申請人:河南省科學院生物研究所有限責任公司