一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵製備亮氨酸氨肽酶的方法
2023-05-19 17:39:31
專利名稱：一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵製備亮氨酸氨肽酶的方法
技術領域：
一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵製備亮氨酸氨肽酶的方法，具體地說是利用枯草芽孢桿菌工程菌發酵，收集發酵液，通過絮凝、過濾、超濾濃縮、冷凍乾燥等提取操作，獲得亮氨酸氨肽酶製品，屬於酶製劑、食品添加劑技術領域。
背景技術：
蛋白酶的商品生產始於20世紀初，30年代微生物蛋白酶開始應用於食品和製革工業，近年來，微生物產酶的研究蓬勃發展。20世紀50年代初，日本學者首先發現黴菌中存在幾種類型的蛋白酶，特別是酸性蛋白酶，20世紀60年代初，荷蘭開始生產添加鹼性蛋白酶的洗滌劑。到目前為止，國際市場上商品蛋白酶達100種以上。蛋白酶製劑在蛋白加工領域中主要被用於改良風味、改善營養價值、生產抽提物、 以及改變物理性質等。廣義上，蛋白酶製劑包括兩種類型一類是蛋白酶，它能分解蛋白生成多肽或寡肽；另一類是肽酶，它能從末端開始切割蛋白和肽鏈並釋放出遊離單個胺基酸。酶作為生物催化劑具有反應條件溫和、催化效率高和專一性強等優點，並因其高效、節能、經濟、綠色、環保等的特點，其應用範圍已遍及工業生產、農業、醫療診斷、環境保護、食品加工等領域。由於食品工業生產規模的日益擴大，食品行業的快速發展，食品添加劑特別是天然鮮味劑的需求也得到了快速增長。營養性天然鮮味劑是一類含胺基酸、肽類、核苷酸和糖分等物質並具有魚肉和蔬菜等風味的調味料，主要包括動植物提取浸膏、蛋白質水解濃縮物和酵母浸膏等。酶製劑是發酵產業的核心產品，酶製劑行業推動了發酵工業和相關行業的發展，並產生了巨大的經濟和社會效益。目前，我國酶製劑行業發展較快，基本上滿足了大宗產品生產的需求。但是在產品方面，要進一步提升新酶種的結構比例，特別是國外完全壟斷的小酶品種。同時，加快開發和生產複合酶製劑，包括食品、紡織、飼料、紙漿、製革、造紙等專用複合酶製劑。此外，繼續提高現有酶製劑酶的活性，提高產品檔次。國內在氨肽酶生產方面的研究處於快速發展研究的階段，實現產業化，填補國內產品的空白，替代進口產品，增強我國酶製劑行業競爭力，打破該產品被國外的壟斷有著重要的意義。目前蛋白質的水解方式逐漸從化學法向酶解法轉變。用傳統的方式水解蛋白質製備活性多肽，已經不能滿足現代人民生活要求，在科技日新月異的今天，酶解蛋白質生產多肽已成為當今熱門研究，通過不同的酶切方式可以獲得不同功能的活性多肽，關於這方面已有很多相關的報導。大豆蛋白水解生產大豆多肽是大豆深加工的一個重要方向，因為大豆多肽不僅具有良好的營養特性，還具有廣泛的生理藥理作用和比大豆蛋白更豐富的功能特性，所以大豆多肽是一種很有前景的功能性食品原料。隨著生物技術的進步和生命科學的發展，生理活性肽的生理功能逐步被人們發現，並受到越來越多的重視，尤其是一些活性肽的結構和生理功能逐漸明確，推動了活性肽的研究，也促進了大豆肽的研究與開發。大豆多肽產品帶有不同程度的苦味會直接影響食品的風味，給人們食用時會有一些「不愉快」，也在一定程度上限制了它在食品工業中的推廣應用。研究證實當疏水性胺基酸殘基處於多肽鏈的外側時多肽呈現苦味，而單個的疏水性胺基酸苦味卻低的多，因此採用外切酶將疏水性胺基酸從多肽鏈末端切去可以有效地減少苦味。另外該氨肽酶與其他蛋白酶複合使用，可以大幅度提聞蛋白質的水解度，在醫油釀造、幹釀生廣中，可以提聞蛋白質的利用率，節約成本。在醫學研究中，該氨肽酶可用作醫學上的解毒劑，也可用作環境消毒劑，亮氨酸氨肽酶還可用作蛋白質序列測定的分子工具。一株野生枯草芽孢桿菌zjoie經過傳統誘變育種和發酵過程優化，發酵產酶的酶活單位可達7000U/L。本發明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎上成功構建的高產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌，進一步進行發酵過程優化，採用培養基的預處理、培養基組成的調整、溶氧水平的控制等策略，使7L發酵罐產亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，達到 200000U/L 左右。
發明內容
本發明是利用一株高產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌，通過發酵培養、 絮凝、過濾除菌、超濾濃縮、冷凍乾燥等操作，獲得固體亮氨酸氨肽酶，整個流程的收率為72.8%，酶粉酶活為7500 U/g，所得的固體酶的基本特性最適溫度50°C，溫度穩定範圍30 60°C，最適pH8. 5，pH穩定範圍6. O 9. 5，存在一定的底物特異性，已發現其對多肽N端一種疏水的亮氨酸，一種鹼性的精氨酸有較強水解作用。本發明的技術方案一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵製備亮氨酸氨肽酶的方法，將該枯草芽孢桿菌工程菌接入種子培養基中，待長到對數生長期後，以2%的接種量接入發酵培養基中，發酵培養30h，收集發酵液，通過絮凝、過濾除菌、超濾濃縮和冷凍乾燥操作，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉，工藝為
A枯草芽孢桿菌工程菌的發酵
Cl)出發菌株採用枯草芽孢桿菌工程菌以重組質粒PMA5-SAP為出發菌株；
所述枯草芽孢桿菌Zj016，詳見田亞平、須瑛敏一種枯草芽孢桿菌氨肽酶的純化及酶學性質[J]。食品與發酵工業，2006，32 (3) :7-10。枯草芽孢桿菌工程菌重組質粒PMA5-SAP詳見中國專利CN102492645A[—種高產氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用]，公布日2012. 06. 13。(2)種子培養基以g/L計蛋白腖10,酵母膏5, NaCl 10,以去離子水配製,控制ρΗ7· 4 ；
(3)發酵培養基以g/L計可溶性澱粉6，豆柏18，酵母膏24，胰蛋白腖8，甘油O. 2% V/V, K2HPO4*3H20 6，CoCl2 O. 5mmol/L，硫酸卡那黴素5(^g/mL，以去離子水配製，控制pH8. O。(4)發酵條件
搖瓶條件接種量2%，裝液量50mL/250mL，攪拌轉速200r/min，溫度37°C，培養時間
34h ；
發酵罐發酵條件全自動式7L發酵罐，Bioflo 110、美國NBS公司，罐中裝液量為4. 5L，發酵溫度37°C，接種量為2%V/V，攪拌轉速30(T600rpm，通氣比為1.2 1，罐壓控制在O. 06、. 08Mpa,溶氧與攪拌轉速偶聯，維持最低溶氧在30%，培養時間控制在30h ;通過對原料預處理條件優化，控制溶氧水平，不時加消泡劑控制起泡策略，使發酵產酶水平得到進
一步提聞;其中原料豆柏的預處理
豆柏的適當水解將豆柏與一定的水混勻，調節PH至7. 5，中性蛋白酶用量為中性蛋白酶300U/g豆柏，在40°C下，不停地攪拌，酶解Ih ；
B亮氨酸氨肽酶的提取
(O發酵液的收集、絮凝過濾除菌向發酵結束的發酵液中加入O. 15%V/V的陽離子絮凝劑(美國凱米拉公司)，在適宜的條件下絮凝，之後再以3g/L的量加入助濾劑硅藻土，混勻，過濾除去絮凝物及菌體，獲得澄清發酵液；
(2)將得到的澄清發酵液進行超濾濃縮，濃縮倍數在Γ10倍，獲得較純的濃縮液，所選用的超濾膜截留分子量為30kDa ；
(3)將濃縮液冷凍乾燥，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉。所得亮氨酸氨肽酶的基本特性
A底物特異性
對收集獲得的澄清發酵液進行底物的特異性研究，發現其無內切型蛋白酶活性(酸性、中性和鹼性蛋白酶)，僅具有外切氨肽酶活性，並存在一定的特異性，對N末端為亮氨酸這種疏水胺基酸及精氨酸這種鹼性胺基酸的多肽有較強水解作用。B酶學特性
最適溫度50°C，溫度穩定範圍為30 60°C ;最適pH8. 5，pH穩定範圍為6. O 9. 5。C金屬離子影響
通過向發酵液中添加不同金屬離子，發現Co2+對該酶有較強的激活作用，Mg2+、K+、Na+對該酶酶活的影響較小，其中Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+有一定程度的抑制。酶活測定方法
採用LNA法，測定時，首先加入一定量的Tris-HCl緩衝液和底物(L-亮氨酸-對硝基苯胺L-leu-pNA)，然後再加入稀釋一定倍數的粗酶液，在50°C水浴反應IOmin後，405nm比色測定酶活。酶活力定義在水浴50°C下，每分鐘分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生IMfliol的對硝基苯胺所需酶量，定義為一個酶活單位。本發明的有益效果本發明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎上構建的高產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌PMA5-SAP，進一步進行發酵過程優化，採用培養基的預處理、培養基組成的調整、溶氧水平的控制等策略，使7L發酵罐產亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，發酵產酶又從7000U/L酶活單位提高到200000U/L左右。
圖I亮氨酸氨肽酶的製備流程。
具體實施例方式實施例I
將枯草芽孢桿菌工程菌重組質粒PMA5-SAP由甘油管接入種子液中，經擴大培養後，再按接種量2%接入4. 5L發酵培養基中，發酵罐為全自動式7L發酵罐，Bioflo 110、美國NBS公司，發酵培養基組成如說明書所述。發酵培養基初始pH8. O,培養溫度37°C，攪拌轉速300 600rpm,通氣量1.2 I，罐壓維持在O. 06-0. 08MPa,最低DO控制在30%, DO與轉速相偶聯，培養30h。發酵結束後，獲得發酵液4. 2L，向該發酵液中添加6. 3mL陽離子絮凝齊U (美國凱米拉公司)，在20 30°C溫度下，不斷攪拌，開始快速攪拌使絮凝劑與發酵液混合均勻，之後緩慢攪拌，使其形成絮凝體，再加入12. 6g助濾劑硅藻土，混合均勻後，過濾獲得澄清發酵液3. 8L，接著選用30kDa的超濾膜濃縮，最終獲得濃縮發酵液O. 8L，濃縮倍數為 4. 75，最後再將濃縮發酵液冷凍乾燥，獲得固體亮氨酸氨肽酶36g，酶活單位為7500 U/g。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵製備亮氨酸氨肽酶的方法，其特徵在於將該枯草芽孢桿菌工程菌接入種子培養基中，待長到對數生長期後，以2%的接種量接入發酵培養基中，發酵培養30h，收集發酵液，通過絮凝、過濾除菌、超濾濃縮和冷凍乾燥操作，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉，工藝為 A枯草芽孢桿菌工程菌的發酵 (1)出發菌株採用枯草芽孢桿菌工程菌以重組質粒PMA5-SAP為出發菌株； 重組質粒PMA5-SAP詳見中國專利CN102492645A ； (2)種子培養基以g/L計蛋白腖10，酵母膏5，NaCl10，以去離子水配製，控制pH7.4 ； (3)發酵培養基以g/L計可溶性澱粉6，豆柏18，酵母膏24，胰蛋白腖8，甘油0.2% V/V，K2HPO4CH2O 6，CoCl2 0. 5mmol/L，硫酸卡那黴素50l^g/mL，以去離子水配製，控制pH8. 0 ； (4)發酵條件 搖瓶條件接種量2%，裝液量50mL/250mL，攪拌轉速200r/min，溫度37°C，培養時間34h ； 發酵罐發酵條件7L發酵罐，罐中裝液量為4. 5L，發酵溫度37°C，接種量為2%V/V，攪拌轉速30(T600rpm，通氣比為I. 2 I，罐壓控制在0. 06^0. 08Mpa,溶氧與攪拌轉速偶聯，維持最低溶氧在30%，培養時間控制在30h ;通過對原料預處理條件優化，控制溶氧水平，不時加消泡劑控制起泡策略，使發酵產酶水平得到進一步提高； 其中原料豆柏的預處理 豆柏的適當水解將豆柏與一定的水混勻，調節PH至7. 5，中性蛋白酶用量為中性蛋白酶300U/g豆柏，在40°C下，不停地攪拌，酶解Ih ； B亮氨酸氨肽酶的提取 (1)發酵液的收集、絮凝過濾除菌向發酵結束的發酵液中加入0.15%V/V的陽離子絮凝劑，進行絮凝，之後再以3g/L的量加入助濾劑硅藻土，混勻，過濾除去絮凝物及菌體，獲得澄清發酵液； (2)將得到的澄清發酵液進行超濾濃縮，濃縮倍數在4 10倍，獲得較純的濃縮液，所選用的超濾膜截留分子量為30kDa ； (3)將濃縮液冷凍乾燥，獲得亮氨酸氨肽酶酶粉。
全文摘要
一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵製備亮氨酸氨肽酶的方法，屬於酶製劑、食品添加劑技術領域。本發明涉及利用枯草芽孢桿菌工程菌的發酵生產，發酵液經絮凝、過濾除菌、超濾濃縮、冷凍乾燥等提取操作，獲得亮氨酸氨肽酶的酶粉，並對所製備的酶考察其基本酶學特性。本發明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎上構建的高產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌PMA5-SAP，進一步進行發酵過程優化，採用培養基的預處理、培養基組成的調整、溶氧水平的控制等策略，使7L發酵罐產亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，發酵產酶又從7000U/L酶活單位提高到200000U/L左右。
文檔編號C12N9/48GK102703407SQ201210199820
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者曹松龍, 林穎, 田亞平, 高新星 申請人:江南大學