多項心肌標誌物並行檢測方法及系統、晶片試紙的製作方法

2023-05-19 17:35:26

專利名稱：多項心肌標誌物並行檢測方法及系統、晶片試紙的製作方法
技術領域：
本發明屬於體外免疫分析技術領域，涉及一種標誌物並行檢測方法，尤其涉及一種多項心肌標誌物並行檢測方法；本發明還涉及一種多項心肌標誌物並行檢測系統；同時，本發明還涉及一種用於多項心肌標誌物並行檢測的晶片試紙。
背景技術：
急性心肌損傷、慢性心力衰竭和動脈粥樣硬化等心血管疾病是嚴重危害人類健康的常見疾病。從50年代以來，動態測定一些代謝酶活性一直是診斷急性心肌梗死(acutemyocardial infarction, AMI)的金標準。但這些酶並不是心肌所特有,在人體的其他器官和肌肉中也大量存在，除AMI外，因運動、炎症也可引起升高，而且這些心肌酶的分子量較大，從壞死組織進入血液較一些小分子物質慢，而且酶的活性時間短，其窗口時間也短，對臨床診斷的幫助價值常因此而受到限制。由於酶活性檢測對輔助診斷心肌損傷的敏感性和特異性較差，特別是當心電圖(electrocardiogram, ECG)改變不明顯或為無Q波的心肌梗死(MI)、不穩定心絞痛、心肌炎或中毒性心肌損傷及伴有腎功能衰竭、多器官功能不全或伴骨骼肌損傷等疾病時，更難以準確診斷。而對於心力衰竭患者而言，過去一直沒有一項很好的實驗室檢測指標用於評價心力衰竭程度，而僅依賴心電圖、超聲心動圖和心臟核磁共振等。由於心力衰竭的患病率和死亡率極高，且近年來一直呈上升趨勢，早期發現和預防心力衰竭進一步加重具有非常重要的臨床價值。近幾年來，一些新的具有高度特異性和敏感性的心肌標誌物檢測指標已較為普遍地用於臨床實驗室診斷，如肌鈣蛋白T或I、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶(isoenzymeof creatine kinase containing M and B subunits, CK-MB)、B型尿鈉肽、超敏C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)等。對這些新的心肌標誌物的正確應用為臨床準確診斷、鑑別診斷和判斷治療效果起到了革命性的作用。由於這些新的指標是近幾年才開始在國內逐步普及應用，因此掌握與之相關的生物學特點，是臨床對其合理運用和選擇的前提條件。心肌損傷標誌物的類型及應用I.心肌標誌物的類型心肌損傷標誌物主要有肌鈣蛋白T(tix)p0nin T)、肌鈣蛋白I (troponinl)、肌酸激酶同工酶質量(CK-MB mass)和肌紅蛋白(myoglobin)。肌I丐蛋白由3個亞單位組成，它們各自有獨立的結構和不同的調節作用，心肌肌鈣蛋白在鈣離子參與下調節介導肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互反應，從而維持心肌的舒張與收縮。在心肌細胞膜完整時，心肌肌鈣蛋白不會透出細胞膜進入血循環，只有當心肌細胞膜破壞時，肌鈣蛋白才能釋放入血。其血循環中肌鈣蛋白的濃度與心肌受損的程序呈正比，且具有長達15d的半衰期，是回顧性檢測的最佳指標。CK為細胞內重要的能量代謝酶，分布廣泛，以肌細胞中最多，由二個亞基組成二聚體；CK-MB主要存在於心肌細胞的外漿層，一直是臨床診斷心肌損傷的心肌酶譜中最具特異性的酶，但長期以來用免疫抑制法測定酶活性的幹擾因素很多，檢測的敏感性、特異性均大受影響，現由美國心臟病協會和歐洲心臟病協會推薦用化學發光方法測定CK-MB的質量可不受酶活性的影響，直接檢測CK-MB分子的濃度，可更加敏感、特異地為臨床提供幫助。肌紅蛋白主要存於橫紋肌(心肌、骨骼肌)細胞中，在細胞膜的氧化功能中具有重要作用。因其為小分子物質(相對分子質量17000 18000)，當心肌細胞發生損傷時，Mb是最早進入血液的生物的標誌物，其擴散入血的速度比CK-MB mass或cTnl/cTnT更快。但因肌紅蛋白在骨骼肌中也有表達，故骨骼肌損傷時也可有大量肌紅蛋白釋放，其不具有心 肌特異性。2.心肌損傷時心肌標誌物的正確選擇美國紐約心臟病協會的建議認為，肌紅蛋白是用於心肌損傷的最佳早期標誌物。由於其為小分子物質，在急性心肌梗死(AMI)時可快速入血，故在AMI發生的I. 5 6h內，通過動態檢測二次血清肌紅蛋白水平可早期診斷是否有急性心肌梗死發生。如第二次檢測值明顯高於第一次檢測值，則具有極高的陽性預報價值；如動態檢測二次測定值間無差異，則具有100%的陰性預報價值，排除急性心肌梗死的可能性。但應注意的是，嚴重休克、嚴重的廣泛性創傷、終末期腎功能不全、心肌炎、急性感染、肌炎或肌病時肌紅蛋白均可能升高。因而應注意與急性心肌梗死進行鑑別診斷。由於肌紅蛋白的窗口時間最短，僅為3 4d，故在疾病發生後該指標不能用於回顧性分析。cTnl/cTnT被美國和歐洲心臟病協會一致評為是診斷急性心肌梗死的高特異性和高敏感性的確診標誌物。在心肌細胞損傷早期，游離於胞漿內的cTnl/cTnT快速釋放出來，血清/血漿中水平在4 6h升高。隨著肌原纖維不斷崩解破壞，以固定形式存在的cTn不斷釋放，血清/血漿中cTn水平在AMI發生後8 14h達高峰，I 2周後降至正常。由於cTnl/cTnT具用心肌特異性，胸痛發生4h後的患者，可直接採用cTnl/cTnT檢測，其血清/血漿中水平升高具有診斷的特異性，AMI的早期診斷可為患者的治療贏得寶貴時間。對於一直不能通過心電圖改變，又能無臨床典型症狀的微小心肌損傷患者，cTnl/cTnT的檢測是目前的最佳輔助診斷指標。cTnl/cTnT除了用於AMI的早期診斷外，尚可作為臨床溶栓治療後再灌注的監測指標。但也有學者建議，儘管溶栓治療後血漿中的cTnl/cTnT水平因再灌注達到一個新的高峰值，但因其窗口時間較長，不利於區分損傷時的峰值與治療後的峰值，故在溶栓治療前後選用CK-MB mass或肌紅蛋白的檢測作為判斷溶栓後治療效果的實驗室指標可能更佳。只要在溶栓治療開始90min後，CK-MB mass或肌紅蛋白值較治療前升高4倍以上，提示治療有效。因此，cTnl/cTnT在用於確定臨床診斷急性用心肌損傷的準確性、對未及時應診患者的後期回顧性診斷、區別同時有著骨骼肌和心肌損傷時的心肌損傷程度、溶栓治療再灌注的療效評估、心臟手術時對心肌損傷程度和修復的評估都是非常有用的、全新的確診性指標。CK-MB mass檢測的敏感性和特異性都大大高於CK-MB活性(activity)，故當沒有開展cTnl或cTnT檢測時，可用CK-MB mass協助臨床診斷，其對於診斷急性冠脈症候群和評價心肌損傷程度，以及在敏感性和特異性方面都接近肌鈣蛋白。心力衰竭標誌物的應用各種心臟疾病最終均可發展到心力衰竭。由於心力衰竭的發展比較緩慢，心臟是在各種病症累積多年後，才漸漸失去其泵血能力和各方面功能的減弱及下降。而在心衰的早期，心臟功能的減退是依靠心臟所分泌的短肽激素來調節心臟的代償功能，故在臨床上往往不易出現症狀。傳統診斷心衰的指標為心臟超聲診斷，以評價心臟左室的射血分數了解心臟功能。近幾年，由美國和歐洲心臟病協會推薦使用的B型尿鈉肽(B-type brainnatriuretic peptide, B-BNP),是目前唯--個最好的用於評價心力衰竭的實驗室檢測指標，在歐洲心臟協會(European Society of Cardiology, ESC) 2001年的心衰診斷指南中心，已將其作為實驗室檢測項目中的唯一指標。B型尿鈉肽又稱腦尿鈉肽(Brain natriuretic peptide,BNP),是由心肌細胞合成的具有生物學活性的天然激素，主要在心室表達，同時也存在於腦組織中。當左心室功能不全時，由於心肌擴張而快速合成釋放入血，有助於調節心臟功能。心肌細胞所分泌的BNP先以108個胺基酸組成的前體形式存在，當心肌細胞受到刺激時，在活化酶的作用下裂解為由76個胺基酸組成的無活性的直線多肽和32個胺基酸組成的活性環狀多肽，釋放入血循環，分別被稱為NT-proBNP和BNP。NT-proBNP的生物學半衰期為60 120min，而BNP僅為20min。B-BNP的釋放與心衰程度密切相關，心衰程度加重，B-BNP的釋放增加。B-BNP的主要生物學作用是參與鈉調節，促進尿鈉排洩和利尿，擴張血管，維持血壓的動態平衡，同時拮抗腎素-血管緊張素-醛 固酮系統使心輸出量增加。現已發表的研究資料顯示，B-BNP水平與左心室射血分數有極好的負相關性，認為B-BNP可作為左心室射血分數的替代檢測指標。現有不同公司的檢測方法問世，主要分為檢測外周血中NT-pix)BNP水平，或檢測BNP水平。無論是檢測NT-proBNP還是BNP，在臨床應用價值上都沒有太大差異。由於正常人血清/血漿B-BNP水平極低，故B-BNP水平的升高具有極好的診斷價值。B-BNP主要用於診斷心力衰竭、監測病程進展、對療效和預後進行評估，同時用於AMI患者在治療後對其心室功能的恢復狀況進行評估。當治療有效時，BNP水平可明顯下降，BNP水平的持續升高或持續不降低，通常提示患者的心衰未得到糾正或正進一步加重；在急診室對呼吸急促患者的鑑別診斷，也可通過測定B-BNP水平準確篩選出非心衰患者引起的呼吸困難，由於其所具有的心肌特異性，B-BNP水平測定就具有很高的陰性預測價值；BNP在用於心臟外科手術患者的術前心臟功能評價，也是一項非常重要的指標。國外許多研究也顯示，B-BNP用於對高危人群的篩查，具有重要的指導意義，如糖尿病、遺傳性心臟病、高血壓、既往心梗、風溼性心臟病已行換瓣手術患者，都應定期作B-BNP的檢測，及時了解心臟功能狀況。還有研究提不，B-BNP水平升聞與聞危患者的死亡率增加和再次住院治療的風險均呈聞度相關，並認為 B-BNP 檢測值比左室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)和 V02峰值更具有預測價值。由於B-BNP是目前唯一最好的評價心衰的實驗室檢測指標，其檢測快速、敏感、特異，檢測該指標來幫助篩選是否需做超聲心動圖，從衛生經濟學角度來講，也是一個最好的節約方案。超敏CRP在冠心病危險因素評價的作用冠心病和動脈粥樣硬化是一類嚴重危害人類健康、影響生活質量的常見心血管疾病。隨著生活水平的提高，其發生率也日趨增長。對這類疾病進行早期預防和幹預，是維護人類健康的一項重要任務，用於評價冠心病危險因素的指標很多，除了臨床資料和遺傳資料以外，尚有很多實驗室指標，如載脂蛋白(apoprotein，AP0)中的AP0-A1、AP0-B、HDL-C、VLDL-C、LDL-C等。近幾年，隨著檢測技術的發展，一些新的檢測指標也用於臨床，其中最具代表性的指標為超敏CRP(hs-CRP)。CRP由肝細胞合成(相對分子質量為100000 144000)，正常情況下在血清/血漿中含量極低，而當炎症或組織損傷時CRP含量可成倍增力口，被臨床作為炎症及感染的最佳實驗室指標。而hs-CRP水平用一般的免疫化學方法不能檢測到，只能用超敏乳膠增強散射比濁法才能準確測定血漿中hs-CRP的濃度。國外學者研究發現，健康人血清/血漿中hs-CRP水平小於0. 55mg/L,當有心血管疾病危險性者，其hs-CRP水平往往大於2. lmg/L。因此，歐美等發達國家已將hs-CRP作為預防心血管疾病的相對獨立的一個新的篩查指標。大量的數據分析顯示，當hs-CRP低於2mg/L時，發生心血管疾病的危險性很低，而當hs-CRP大於2. lmg/L時，發生心血管疾病的危險性增加。隨著hs-CRP水平的進一步升高，發生冠脈症候群或心肌梗死的危險因素顯著升高，如將hs-CRP與總膽固醇和HDL濃度的比率聯合應用，評價高危人群患冠心病的危險因素更具有客觀的應用價值。因此，hs-CRP主要用於冠心病危險因素的篩查。目前國內因受經濟條件限制，尚不能作為常規項目，但可用於高危人群的篩查。但切記應全面評價冠心病的危險因素，不 能將危險因素當作診斷指標，應恰如其分地評價危險因素的臨床應用價值，才能有效地協助醫生預防冠心病的發生發展。綜上所述，新的心肌標誌物的應用為臨床治療提供了有力的實驗室保障。但對這些新的心肌標誌物特性的正確了解和掌握臨床應用指標，只有正確分析各類心肌標誌物檢測方法的靈敏度、特異性與檢測結果的關係，才能更好地為臨床治療提供可靠的實驗數據和諮詢，體現檢驗醫學在臨床醫學中的作用，為保障人類健康做出貢獻。至上世紀70年代，發明酶標檢測技術平臺以來，免疫診斷行業已發生了翻天覆地的變化，使免疫檢測領域得到了快速成長。但由於酶標檢測體系檢測時間長，中間過程操作煩瑣，試劑檢測範圍窄，靈敏度低等缺點，因此該系統也慢慢的退出了臨床檢測的歷史舞臺。隨之而來的相繼又發明了膠體金標技術平臺，化學發光，時間分辨螢光檢測技術平臺以及免疫晶片技術平臺等。膠體金標技術在快速檢測領域起到了重要作用，為病人的診斷贏得了時間，而且使用方便，已深得用戶的喜歡；但由於檢測靈敏度低，無法準確定量的瓶頸，導致其不能充分發揮其快速診斷的需求，繼而不能與精準的化學發光等技術抗衡。化學發光，時間分辨螢光等技術平臺使檢測靈敏度得到了大大提高，並且通過全自動檢測系統的輔助，使檢測誤差和檢測效率都有了大大的提升；但是由於其檢測時間還是比較長，而且儀器設備比較龐大，只能在中心實驗室進行，從樣本收集到醫生得到檢測結果還是需要很長的一段時間，同時一個檢測只能得到一個標誌物的結果，不能同時測出病人相關的多個生物標誌物的結果，故此也大大限制了該技術平臺的充分發展。隨著晶片技術的發展，相繼出現了膜晶片，液體晶片，玻璃晶片等技術平臺，這為同一樣品達到多項生物標誌物同步測試的目的，為病人檢測節約了時間和費用，同時節約了樣本的採集量；但該平臺技術還是存在煩瑣的實驗反應和操作增加了檢測誤差，同時儀器設備也比較龐大，也只能在中心實驗室進行，從樣本採集到醫生拿到實驗結果同樣需要較長的時間因此也限制了其發展。限制了在免疫檢測領域的進一步發展。都不能滿足快速發展的免疫領域的需求。有鑑於此，由於目前的檢測方法存在檢測時間長、快速檢測不能定量、同一個檢測只能得到一個標誌物結果的問題，如今迫切需要一種新的檢測方法，即可以快速準確檢測、又可以同步檢測多項心肌標誌物製備，並且還便於攜帶，隨時隨地都可以使用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種多項心肌標誌物並行檢測方法，可以同時定量檢測多項心肌標誌物，並可提高檢測的靈敏度，節約檢測時間。本發明還提供一種多項心肌標誌物並行檢測系統，可以同時定量檢測多項心肌標誌物，並可提高檢測的靈敏度，節約檢測時間。此外，本發明進一步提供一種用於多項心肌標誌物並行檢測的晶片試紙，可以同時定量檢測多項心肌標誌物，並可提高檢測的靈敏度，節約檢測時間。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案一種多項心肌標誌物並行檢測方法，用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO,CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述方法包括如下步驟步驟SI :將上述被檢測物質相應的捕獲單抗固定在晶片試紙的第一膜片上，所述晶片試紙包括第一膜片、第二膜片；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾或虹吸或磁場或電場或重力場作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成 第一膜片-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲第一膜片同時裝配，留檢測孔；步驟S2 :滴加樣本血清，當滴加的樣本血清中存在上述蛋白抗原物質時,層析過程中先於同時層析的第二膜片上的標記二抗結合，此結合物再被第一膜片上的捕獲抗體截
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犾；步驟S3 :將螢光信號固定在第一膜片上於螢光檢測儀檢測，螢光強度與樣本血清中目的蛋白濃度成正比，螢光強度通過在檢測儀中轉換成數位訊號，根據內標標準曲線直接用於計算蛋白濃度。作為本發明的一種優選方案，所述步驟S3包括所述螢光檢測儀的雷射發射器發出雷射，該雷射同時激發晶片試紙內的多種信號標記物，該些標記物受雷射激發後發生能量躍遷，釋放出另外一種變異的光波或者電子物質；所述螢光檢測儀的信號接收裝置接收信號標記物釋放出的光波或者電子傳遞物信號，並且把信號轉化為數位訊號，信號標記物釋放信號的大小與數值大小正相關；然後螢光檢測儀將處理過的接收的信號進行計算，然後轉換為模擬信號，輸出該模擬信號，該輸出的模擬信號與進行模擬計算，最後輸出被檢測物質的濃度相對應。作為本發明的一種優選方案，所述信號標記物包括螢光素、螢光蛋白、納米金、銀、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素中的一種或多種。作為本發明的一種優選方案，所述螢光素包括FITC、Cy2 TM、Alexa TM 488, Cy3TM、Alexa TM 546中的一種或多種。作為本發明的一種優選方案，所述螢光蛋白包括GFP、R-PE, R-PC中的一種或多種。一種用於多項心肌標誌物並行檢測的晶片試紙，所述晶片試紙用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP 中的部分或全部；所述晶片試紙包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上設有各標誌物的配體An，在第二膜片上吸附有信號標記物偶聯的配基Bn ；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾或虹吸或磁場或電場或重力場作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成第一膜片-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲第一膜片同時裝配，留檢測孔。
作為本發明的一種優選方案，所述信號標記物包括螢光素、螢光蛋白、納米金、銀、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素中的一種或多種。一種多項心肌標誌物並行檢測系統，用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO,CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述系統包括晶片試紙,包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上設有各標誌物的配體An,在第二膜片上吸附有信號標記物偶聯的配基Bn ;將上述被檢測物質相應的捕獲單抗固定在晶片試紙的第一膜片上；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾或虹吸或磁場或電場或重力場作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成第一膜片-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲第一膜片同時裝配，留檢測孔；滴加樣本血清，當滴加的樣本血清中存在上述蛋白抗原物質時，層析過程中先於同時層析的第二膜片上的標記二抗結合，此結合物再被第一膜片上的捕獲抗體截獲； 螢光檢測儀，用以檢測固定在第一膜片上的螢光信號，螢光強度與樣本血清中目的蛋白濃度成正比，螢光強度通過在檢測儀中轉換成數位訊號，根據內標標準曲線直接用於計算蛋白濃度。作為本發明的一種優選方案，所述信號標記物包括螢光素、螢光蛋白、納米金、銀、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素中的一種或多種。作為本發明的一種優選方案，所述螢光檢測儀的雷射發射器發出雷射，該雷射同時激發晶片試紙內的多種信號標記物，該些標記物受雷射激發後發生能量躍遷，釋放出另外一種變異的光波或者電子物質；所述螢光檢測儀的信號接收裝置接收信號標記物釋放出的光波或者電子傳遞物信號，並且把信號轉化為數位訊號，信號標記物釋放信號的大小與數值大小正相關；然後螢光檢測儀將處理過的接收的信號進行計算，然後轉換為模擬信號，輸出該模擬信號，該輸出的模擬信號與進行模擬計算，最後輸出被檢測物質的濃度相對應。本發明的有益效果在於本發明提出的多項心肌標誌物並行檢測方法、系統及用到的晶片試紙，可以同時定量檢測多項心肌標誌物，並可提高檢測的靈敏度，節約檢測時間。I、本發明系統使用方便，攜帶方便，電源使用方便可以是乾電池，也可以是普通交流電源；2、本發明適用於各種檢測體系，可以是免疫反應，可以是核酸反應等符合配體-受體結合的反應；3、該方法的檢測反應非常快速，從樣品採集到得到檢測結果不到半小時即可完成,又叫床邊檢測；4、該方法可以同時檢測多種生物標誌物；5、該方法可以對生物標誌物進行精確定量檢測，也可以用於定性檢測；6、該方法還適合基因檢測，和所有適合配體與受體形成親和結合的反應。


圖I為本發明檢測系統的組成示意圖2為本發明晶片試紙的結構示意圖；圖3為本發明檢測系統中檢測儀的示意圖；圖4為晶片試紙試用測試樣本後的圖示。
具體實施例方式下面結合附圖詳細說明本發明的優選實施例。實施例一請參閱圖1，本發明揭示了一種多項心肌標誌物並行檢測系統，檢測項目為心肌常見金標準型標誌物cTNI，cTNT, MYO, CK-MB, BNP, CRP, FABP ;所述檢測系統包括螢光檢測儀
I、試劑盒2。檢測儀的控制系統10控制著檢測儀的各種工作狀態。雷射發射器11發出雷射，該雷射同時激發晶片試紙2內的多種信號標記物21，該些標記物受雷射激發後發生能量躍遷21後，釋放出另外一種變異的光波或者電子物質23。同時檢測儀I的信號接收裝置12接收信號標記物釋放出的光波或者電子傳遞物信號23，並且把信號23轉化為數位訊號13，信號標記物釋放信號的大小與數值大小正相關。然後儀器的數據處理系統將處理過的接收的信號進行計算，然後轉換為模擬信號15，該模擬信號通過控制裝系統輸出，該輸出的模擬信號與進行模擬計算，最後輸出被檢測物質的濃度相對應。請參閱圖2，為本發明用於多項心肌標誌物並行檢測的晶片試紙的結構如圖2所示；其中5為纖維膜(纖維膜作為第一膜片，第一膜片還可以為矽晶片或矽片或塑料薄片或塑料膜片或金屬片)，51為玻璃纖維(玻璃纖維作為第二膜片，第二膜片還可以為玻璃纖維或者矽土纖維或者金屬纖維或者有機纖維或者高分子纖維)，52為配基Bn-信號標記物，53為加樣孔，54為配基An。所述晶片試紙用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP,FABP中的部分或全部；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾(或虹吸、磁場、電場、重力場)作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成纖維膜-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於纖維膜上形成複合物陣列，與捕獲纖維膜同時裝配，留檢測孔。將與纖維膜上單抗配對形成夾心檢測的被檢測物質的檢測單抗分別標記信號標記物，然後固定於玻璃纖維，與捕獲纖維膜同時裝配，留檢測孔。請參閱圖3所示，2為晶片試紙，在晶片試紙2上設有纖維膜，在纖維膜上設有配體21為An，該配體21為枝狀，該配體An上固定有生物標誌物22為n，在標誌物n上有配體24為Bn，多種被檢測物質與固相配基形成親和結合，在配體的周圍或項部為一個以上信號標記物23。其中n = 1，2，3，4，5......複合物。該複合物(n種)在上述檢測儀上檢測其信
號物質的強弱並且轉化為相應物質的濃度，即可檢測出被檢測生物標誌物(n種)的濃度大小或者強弱。以此對疾病進行輔助判斷達到快速診斷的目的。前述的標記物23為螢光素(螢光素有FITC，Cy2 TM，Alexa TM 488，Cy3 TM，Alexa TM546常規螢光素)、螢光蛋白(GFP，R-PE, R-PC)、納米金、銀、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素。前述的標記物23釋放信號的大小與數值大小為正關聯。前述的標記物23受雷射激發後釋放出的光波或電子物質不同於標記物本身的光波或電子物質。前述的被檢測物質物中的生物標誌物n、信號標記物-配基Bn複合物在固相支持物上的運動作用力為層析、虹吸、滲濾、電泳、磁泳或重力方式等。前述的纖維膜可以為PV膜、玻片、塑料板或凝膠板。前述的信號標記物23為螢光素(螢光素有FITC，Cy2 TM，Alexa TM 488，Cy3 TM，Alexa TM 546 常規螢光素)、螢光蛋白(GFP，R-PE，R-PC)、納米金(可以是納米金，納米銀，納米銅等)、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素。快速檢測儀器特點包括體積小，攜帶方便，可以使用普通電源和乾電池電源，可以同時檢測多點螢光。上述免疫反應原理為試紙上進行的免疫反應原理是配基Bn-信號標記物(配基Bn可以是抗體，抗原，生物素-親和素，配體，核酸，凝集素等，可以是同種物質或者不同種物質中的一種或者多種)，與樣品中的被檢測物質在運動過程中形成複合物即標記信號物-配基Bn-被檢測物n ;配基An (可以是抗體，抗原，生物素-親和素，配體，核酸，凝集素等，可以是同種物質或者不同種物質中的一種或者多種)是被固定在固體支持物上的，同時與運動中的標記信號物-配基Bn-被檢測物n形成親和結合，這樣就在試紙固體支持物上形成配基An-被檢測物質n-配基Bn-信號標記物質的複合物。採用虹吸(或者電泳，磁場等)技術讓樣品在纖維膜(或者塑料板，膠板，玻璃板等)載體上運動，在運動過程中生物標誌物與放置在載體上的標記配體23(包括抗體，抗原，核酸，凝集素等)結合，並且一起運動到固定在載體上的配體24 (配體24可以是通過吸附，或者共價偶聯等方式固定，該固定可以是點狀，線條狀等)檢測儀(多功能快速晶片試紙檢測儀)是一種非常靈活的多功能檢測技術平臺。其原理是針對不同檢測物的蛋白(如抗原，抗體)以微整列形式結合到特定的固體支持物(如玻片，纖維膜，凝膠等)上，然後與被檢測物(被測物可以是體液或者血清中的抗原、抗體、藥物小分子，核酸或酶等)結合，同時被檢測物還與信號標記物(可以是螢光素，量子點，納米金、銀顆粒，或螢光蛋白分子等)標記的蛋白結合，形成配基A-被檢測物質n-配基B-標記信號物的複合物。儀器通過發射固定波長的雷射掃描照射這個反應結合有多種螢光標記的微整列複合物上的信號標記物；標記物被雷射激發後釋放出另一種變異的固定波長的光量子，這個光量子依次被儀器的接收器捕獲，並且轉化為數位訊號；相應複合物的數值信號通過數據處理軟體計算而得出相應複合物的濃度，依次計算出被檢測物的各種生物標誌物的濃度。晶片試紙的製作方法
配基An微整列晶片的製作配基An是針對被檢測生物標誌物n (生物標誌物n可以是抗原，抗體，藥物，化學小分子，核酸，多肽)能夠形成特異結合的物質(配基An可以是蛋白分子中的抗原、抗體，核酸，藥物小分子，多肽，酶等(n = 1、2、3、4...))。將針對不同被檢測物的配基An用生物緩衝液按一定濃度(可以是Ing-IOmg)配製,然後用點樣儀把配基An以微整列的方式依次點在固體支持物(固體支持物可以是硝酸纖維膜，凝膠，玻片，塑料板等，其形狀可以是長條形，方形，圓心等)上，在經過一定的化學和物理的方法處理使配基An保持應有的生物活性。另外微整列上還有相應檢測物的內控點(或者內標)和樣品正常反應與否的質控點。
配基Bn標記信號物質的製備配基Bn的來源和種類同配基An(n= 1、2、3、4...)，標記信號物質可以是螢光染料(螢光染料有FITC，Cy2 TM，Alexa TM 488，Cy3 TM，AlexaTM546等常規螢光素)，螢光蛋白(GFP，R-PE，R-PC等)，納米金(可以是納米金，納米銀，納米銅等)，量子點，稀土元素，放射元素，小分子化學物或色素。配基Bn和標記信號物質通過其相應的物理化學性質採用相應的物理、化學或生物學方法將兩種物質連接在一起使其穩定存在即可。晶片試紙的製作晶片試紙根據其流體學方法可以有各種形狀，其基本構成要素包括，樣品加樣孔，配基Bn標記物存放位置，配基An微陣列及支持物，樣品流動驅動力裝置(可以是吸水紙，滲濾紙，虹吸槽，毛細管或電磁場等)。可用本發明方法檢測的樣品沒有特別限制，可以是任何含有生物標誌物的樣品，代表性的例子包括血液樣品、血清樣本、尿液樣本、唾液樣本、體液樣品；各種食品蔬菜洗滌液，浸泡液；核酸抽提物，PCR擴增產物等。 樣品檢測時用移液器量取一定體積的樣品滴加在晶片試紙的加樣孔中，樣品進入加樣孔後在流體力學或者外加作用力下依次流經配基Bn標記信號物質材料並且與配基Bn發生親和結合形成信號物質-配基Bn-生物標誌物n的三元符合物；此三元複合物在流體或者外加作用力下繼續向前移動到配基An微整列晶片支持物上，同時與固定在支持物上的配基An發生親和結合，形成配基An-生物標記物n_配基Bn-信號標記物質的四元複合物，並且被捕獲在支持物上，形成含有多種生物標記物n的複合物信號標記物小點。此反應過程在2_15mins裡完成。將反應好的晶片試紙放入檢測儀上，儀器將自動獲取四原複合物上信號標記物質的信號，並且將其轉換為數位訊號再通過數據處理軟體內部計算，即可檢測出被檢測樣品裡的n種生物標誌物的濃度。同時通過數據輸出形式(或者列印輸出形式)記錄檢測結果。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。以下為具體實施例有關晶片試紙檢測儀的實施方式請參閱圖4所示，該檢測儀包括雷射器31、濾鏡組32、濾光片33、雙向色鏡38、反光鏡35、第一物鏡34、第二濾光片36、第二物鏡37、光欄40和晶片試紙39，以及PMT(光電倍增管)元件，AMP (信號放大器)元件，轉換器A/D (信號數據轉換器)元件，CD晶片，輸出列印設備，主板和電源設備(圖中未示)。檢測儀的組裝和測試按照設計圖示，依次將光學元件，連接在儀器箱裡面，並且分配好電源及控制主板，並且依次檢測各段線路和元件的工作情況，考察是否符合要求。在完全符合後接通主板控制程序和電源，測試系統工作情況。檢測儀按以下指標進行調試激發波長532nm或者635nm ;發射波長570nm或者675nm (可根據客戶需要擴充至6種)；雷射強度I %-100%連續可調PMT 450-950連續可調；解析度5 iim、IOii m、20 iim、40iim靈敏度0. I個螢光分子/iim2 ;線性度R2>0. 99 ;重複性95%以上；掃描速度30seC/cm2 (10 u m解析度);焦距深度±250 u m。該儀器在晶片試紙插孔裡面可以添加電場和或磁場，可以使晶片試紙上的帶電或磁性物質在相應的作用力下發生定向運動，以達到被檢測物質的運動作用力。有關晶片試紙的實施方式晶片試紙材質可以為NC膜或玻璃片或塑料片等，晶片點陣為5X6或其它排列(根據具體產品確定)，間距為1mm，點直徑大小為10um-500um，試紙總體寬度為3_30mm，長度範圍30-100_。外觀包括加樣孔，晶片照射窗，密封卡，定位標誌等。晶片試紙內部結構包 括濾樣紙，信號標記物配體所在的玻璃纖維，配體點陣(包括測試點、校準品點和質控點)
坐寸o晶片試紙檢測儀根據以上設計和生產測試，完全符合其快速，靈敏，定量檢測，多項聯檢，攜帶方便等優點。是一款未來應用及其廣泛的產品，將為未來臨床檢測的發展起到推動作用。實施例二多項心肌標誌物晶片檢測試紙(快速螢光免疫定量檢測晶片試紙法)實驗材料cTNI, cTNT, MYO, BNP, CRP, FABP 抗體對為 LINC-BI0 和 Hytest 公司提供；CK-MB,抗體對為Medix公司提供MYO, CK-MB，抗原為 LINC-BI0 公司提供；BNP, cTNI，cTNT，CRP 抗原也是 LINC-BI0 公司提供；兔抗小鼠IgG為自製；常規試劑為市售品。實驗方法I.準備11分別將六個項目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7. 5配製為l_5mg/ml濃度。I. 2 將兔抗小鼠 IgG 用 50Mm Tris-HCl PH7. 5 配製為 l_5mg/ml 濃度。I. 3準備硝酸纖維素膜(NC膜，Whatman公司貨號BA85) 20mmX5mm大小。I. 4準備玻璃纖維和吸水紙(3M公司)。2.實驗操作2. I七個項目的一抗和兔抗小鼠IgG點膜，採用GeSim Nano-Plotter TM 2. I晶片點樣系統將準備好的七種一抗和兔抗小鼠IgG分別點在NC膜上，每點噴點10-200nl，分別排成3排，兔抗小鼠IgG在左上角和右下角，加上七個項目的一抗分為三排，每排三點，點間距1mm，排間距為2mm。並且將點好樣品的膜條放入真空乾燥箱中風乾保存備用。2. 2七個項目的二抗用藻紅蛋白標記2. 2. I用25mM CBS PH9. 6緩衝液配製藻紅蛋白為0. lmg/ml ；2. 2. 2將待標記二抗裝入透析袋中，紮好透析袋，並且將待標記抗體透析袋放入上述配製的藻紅蛋白溶液中4°C透析攪拌過夜；2. 2. 3將標記過夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7. 4緩衝液中4°C透析攪拌透析4hours換液一次,共3次即可；2. 2. 4將處理好的藻紅蛋白的抗體取出測定濃度備用。2. 3藻紅蛋白標記抗體的玻璃纖維固定2. 3. I將標記好的抗體七個項目的二抗用20mM PBS PH7. 4緩衝液，配製成5-30ug/ml的濃度的混合溶液；2. 3. 2將玻璃纖維浸泡在2. 3. I藻紅蛋白標記抗體緩衝液中4°C過夜；2. 3. 2取出浸泡好的玻璃纖維放入真空風乾箱中風乾保存備用。3.晶片試紙的組裝 3. I材料準備3. I. I吸水紙準備，將吸水紙剪切為5mmX10mm大小備用；3. I. 2將固定好藻紅蛋白標記好二抗的玻璃纖維剪切為5mmX5mm大小備用。3. 2 組裝3. 2. I將吸水紙和玻璃纖維及點有抗原抗體的NC膜固定在一起，吸水紙在上，玻璃纖維在中間，NC膜在下面，並且NC膜抗體端在玻璃纖維連接處；3. 2. 2再在NC膜抗原端固定一段吸水紙；3. 2. 3使用塑料卡將固定好的晶片試紙封裝在塑料卡裡面，吸水紙的一端放在留有加樣孔的下面；3. 2. 4將生產好的晶片試紙卡片放入鋁箔袋中密封保存備用，並且加印好名稱和使用方法。4.定量曲線的制定4. I原料準備和抗原標準品的配製，將購買的cTNI，cTNT，CK-MB, MYO, BNP, CRP,FABP抗原用50%的小牛血清緩衝液，根據標識濃度分別配製為cTNI抗原濃度為0，0. 5，
2.5,12. 5,25, 50ng/ml 六個梯度，體積各 3ml 備用；cTNT 抗原濃度為:0，0. 5，2. 5，12. 5，25，50ng/ml六個梯度，MYO抗原濃度為0，10，50，250，1000,4000ng/ml六個梯度，BNP抗原濃度為:0,1,5,20,100, 200ng/ml 六個梯度，CRP 抗原濃度為:0,0.01,0.3,0.9, 3，9ug/ml 六個梯度，CK-MB抗原濃度為0，2. 5，10，50，200，500ng/ml六個梯度，FABP抗原濃度為0，2，10，50,100, 200ng/ml六個梯度,體積各3ml備用。並且每種梯度配製3批。4. 2測試實驗，取出生產好的心肌標誌物六項聯檢晶片試紙；分別取配製的心肌標誌物六項梯度lOOul，依次加入一個試紙的加樣孔，並且將晶片試紙插入晶片試紙檢測儀(LincxMAP平臺)器插孔中接通磁場電源，讓其在磁場中運動(即樣品先進入晶片試紙加樣空，經過樣品濾紙，進入玻璃纖維層，樣品中的六項抗原分別與磁性量子螢光標記的抗體結合，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原複合物，磁性量子點在儀器磁場下運動，當運動到固定有抗心肌標誌物六項的抗體點時，複合物被固定的抗體捕獲，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原-抗體I的複合物，並且複合物不能繼續運動，而其他的未被捕獲的物質繼續流動到頂端的吸水紙上)反應約5mins後，晶片試紙檢測儀(Line xMAP平臺)器讀取複合物上的的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試20次記錄其相應的螢光信號值。依次加入一個試紙的加樣孔，讓其反應5mins後放入Line xMAP檢測儀器讀取四個點的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試3次記錄其相應的螢光信號值。4. 3數據處理和標準曲線方程的生成，將3批720次測定的360個數據輸入電腦數據分析軟體，分別模擬出心肌標誌物六項的函數曲線方程。5.樣品臨床檢測實驗5. I樣品收集，分別收集3家三甲醫院檢驗科的當天樣本共270例，其中心肌標誌物六項陽性樣本各30例，正常樣本60例，心肌標誌物六項檢測兩項以上同時陽性的30例。5. 2將270例樣本同時與roche電化學發光試劑作為對照。6.數據處理6. I原始數據6. 2處理數據結果 實施例三四項(cTNI，MYO, BNP, CK-MB)心肌標誌物晶片檢測試紙(快速螢光免疫定量檢測晶片試紙法)實驗材料cTNI, MYO, BNP 抗體對為 LINC-BI0 和 Hytest 公司提供；CK-MB，抗體對為Medix公司提供MYO, CK-MB,抗原為 LINC-BI0 公司提供；BNP, cTNI抗原也是LINC-BI0公司提供；兔抗小鼠IgG為自製；常規試劑為市售品。實驗方法I.準備I. I分別將四個項目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7. 5配製為l_5mg/ml濃度。I. 2 將兔抗小鼠 IgG 用 50Mm Tris-HCl PH7. 5 配製為 l_5mg/ml 濃度。I. 3準備硝酸纖維素膜(NC膜，Whatman公司貨號BA85) 20mmX5mm大小。I. 4準備玻璃纖維和吸水紙(3M公司)。2.實驗操作2. I四個項目的一抗和兔抗小鼠IgG點膜，採用GeSim Nano-Plotter TM 2. I晶片點樣系統將準備好的四種一抗和兔抗小鼠IgG分別點在NC膜上，每點噴點10-200nl，分別排成3排,兔抗小鼠IgG在第一排,加上四個項目的一抗分為兩排,每排兩點，點間距3mm,排間距為2mm。並且將點好樣品的膜條放入真空乾燥箱中風乾保存備用。2. 2四個項目的二抗用藻紅蛋白標記2. 2. I用25mM CBS PH9. 6緩衝液配製藻紅蛋白為0. lmg/ml ；2. 2. 2將待標記二抗裝入透析袋中，紮好透析袋，並且將待標記抗體透析袋放入上述配製的藻紅蛋白溶液中4°C透析攪拌過夜；2. 2. 3將標記過夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7. 4緩衝液中4°C透析攪拌透析4hours換液一次,共3次即可；2. 2. 4將處理好的藻紅蛋白的抗體取出測定濃度備用。2. 3藻紅蛋白標記抗體的玻璃纖維固定2. 3. I將標記好的抗體四個項目的二抗用20mM PBS PH7. 4緩衝液，配製成5-30ug/ml的濃度的混合溶液；
2. 3. 2將玻璃纖維浸泡在2. 3. I藻紅蛋白標記抗體緩衝液中4°C過夜；2. 3. 2取出浸泡好的玻璃纖維放入真空風乾箱中風乾保存備用。3.晶片試紙的組裝3. I材料準備3. I. I吸水紙準備，將吸水紙剪切為5mmX10mm大小備用；3. I. 2將固定好藻紅蛋白標記好二抗的玻璃纖維剪切為5_X5_大小備用。3. 2 組裝
3. 2. I將吸水紙和玻璃纖維及點有抗原抗體的NC膜固定在一起，吸水紙在上，玻璃纖維在中間，NC膜在下面，並且NC膜抗體端在玻璃纖維連接處；3. 2. 2再在NC膜抗原端固定一段吸水紙；3. 2. 3使用塑料卡將固定好的晶片試紙封裝在塑料卡裡面，吸水紙的一端放在留有加樣孔的下面；3. 2. 4將生產好的晶片試紙卡片放入鋁箔袋中密封保存備用，並且加印好名稱和使用方法。4.定量曲線的制定4. I原料準備和抗原標準品的配製，將購買的cTNI CK-MB, MYO, BNP，抗原用50%的小牛血清緩衝液，根據標識濃度分別配製為cTNI抗原濃度為0，0. 5，2. 5，12. 5，25，50ng/ml六個梯度，體積各3ml備用；MY0抗原濃度為0，10，50，250，1000,4000ng/ml六個梯度，BNP抗原濃度為:0，l，5，20，100，200ng/ml六個梯度;CK_MB抗原濃度為0,2. 5,10，50, 200, 500ng/ml六個梯度，,體積各3ml備用。並且每種梯度配製3批。4. 2測試實驗，取出生產好的心肌標誌物六項聯檢晶片試紙；分別取配製的心肌標誌物六項梯度lOOul，依次加入一個試紙的加樣孔，並且將晶片試紙插入晶片試紙檢測儀(LincxMAP平臺)器插孔中接通磁場電源，讓其在磁場中運動(即樣品先進入晶片試紙加樣空，經過樣品濾紙，進入玻璃纖維層，樣品中的六項抗原分別與磁性量子螢光標記的抗體結合，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原複合物，磁性量子點在儀器磁場下運動，當運動到固定有抗心肌標誌物六項的抗體點時，複合物被固定的抗體捕獲，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原-抗體I的複合物，並且複合物不能繼續運動，而其他的未被捕獲的物質繼續流動到頂端的吸水紙上)反應約5mins後，晶片試紙檢測儀(Line xMAP平臺)器讀取複合物上的的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試20次記錄其相應的螢光信號值。依次加入一個試紙的加樣孔，讓其反應5mins後放入Line xMAP檢測儀器讀取四個點的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試3次記錄其相應的螢光信號值。4. 3數據處理和標準曲線方程的生成，將3批720次測定的360個數據輸入電腦數據分析軟體，分別模擬出心肌標誌物六項的函數曲線方程。5.樣品臨床檢測實驗5. I樣品收集，分別收集3家三甲醫院檢驗科的當天樣本共270例，其中心肌標誌物六項陽性樣本各30例，正常樣本60例，心肌標誌物四項檢測兩項以上同時陽性的30例。5. 2將270例樣本同時與roche電化學發光試劑作為對照。6.數據處理6. I原始數據
6. 2處理數據結果實施例四Ctnl/BNP/CRP三項心肌標誌物晶片檢測試紙(快速螢光免疫定量檢測晶片試紙法)實驗材料cTNI, CRP, BNP 抗體對為 LINC-BI0 和 Hytest 公司提供；BNP, CtnI，，CRP 抗原也是 LINC-BI0 公司提供； 兔抗小鼠IgG為自製；常規試劑為市售品。實驗方法I.準備I. I分別將三個項目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7. 5配製為l_5mg/ml濃度。I. 2 將兔抗小鼠 IgG 用 50Mm Tris-HCl PH7. 5 配製為 l_5mg/ml 濃度。I. 3準備硝酸纖維素膜(NC膜，Whatman公司貨號BA85) 20mmX5mm大小。I. 4準備玻璃纖維和吸水紙(3M公司)。2.實驗操作2. I三個項目的一抗和兔抗小鼠IgG點膜，採用GeSim Nano-Plotter TM 2. I晶片點樣系統將準備好的七種一抗和兔抗小鼠IgG分別點在NC膜上，每點噴點10-200nl，分別排成2排，兔抗小鼠IgG在左上角，加上三個項目的一抗分為一排，每排兩點，點間距1mm，排間距為2mm。並且將點好樣品的膜條放入真空乾燥箱中風乾保存備用。2. 2三個項目的二抗用藻紅蛋白標記2. 2. I用25mM CBS PH9. 6緩衝液配製藻紅蛋白為0. lmg/ml ；2. 2. 2將待標記二抗裝入透析袋中，紮好透析袋，並且將待標記抗體透析袋放入上述配製的藻紅蛋白溶液中4°C透析攪拌過夜；2. 2. 3將標記過夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7. 4緩衝液中4°C透析攪拌透析4hours換液一次,共3次即可；2. 2. 4將處理好的藻紅蛋白的抗體取出測定濃度備用。2. 3藻紅蛋白標記抗體的玻璃纖維固定2. 3. I將標記好的抗體三個項目的二抗用20mM PBS PH7.4緩衝液，配製成5-30ug/ml的濃度的混合溶液；2. 3. 2將玻璃纖維浸泡在2. 3. I藻紅蛋白標記抗體緩衝液中4°C過夜；2. 3. 2取出浸泡好的玻璃纖維放入真空風乾箱中風乾保存備用。3.晶片試紙的組裝3. I材料準備3. I. I吸水紙準備，將吸水紙剪切為5_X10_大小備用；3. I. 2將固定好藻紅蛋白標記好二抗的玻璃纖維剪切為5_X5_大小備用。3. 2 組裝3. 2. I將吸水紙和玻璃纖維及點有抗原抗體的NC膜固定在一起，吸水紙在上，玻璃纖維在中間，NC膜在下面，並且NC膜抗體端在玻璃纖維連接處；
3. 2. 2再在NC膜抗原端固定一段吸水紙；3. 2. 3使用塑料卡將固定好的晶片試紙封裝在塑料卡裡面，吸水紙的一端放在留有加樣孔的下面；3. 2. 4將生產好的晶片試紙卡片放入鋁箔袋中密封保存備用，並且加印好名稱和使用方法。4.定量曲線的制定4. I原料準備和抗原標準品的配製，將購買的cTNI，CRP, BNP,抗原用50%的小牛血清緩衝液，根據標識濃度分別配製為cTNI抗原濃度為0，0. 5,2. 5，12. 5，25，50ng/ml六個梯度，體積各3ml備用；CRP抗原濃度為0，0.01，0. 3，0.9，3，9ug/ml六個梯度，BNP抗原 濃度為0，1，5，20，100，200ng/ml六個梯度；C六個梯度，，體積各3ml備用。並且每種梯度配製3批。4. 2測試實驗，取出生產好的心肌標誌物六項聯檢晶片試紙；分別取配製的心肌標誌物六項梯度lOOul，依次加入一個試紙的加樣孔，並且將晶片試紙插入晶片試紙檢測儀(LincxMAP平臺)器插孔中接通磁場電源，讓其在磁場中運動(即樣品先進入晶片試紙加樣空，經過樣品濾紙，進入玻璃纖維層，樣品中的六項抗原分別與磁性量子螢光標記的抗體結合，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原複合物，磁性量子點在儀器磁場下運動，當運動到固定有抗心肌標誌物六項的抗體點時，複合物被固定的抗體捕獲，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原-抗體I的複合物，並且複合物不能繼續運動，而其他的未被捕獲的物質繼續流動到頂端的吸水紙上)反應約5mins後，晶片試紙檢測儀(Line xMAP平臺)器讀取複合物上的的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試20次記錄其相應的螢光信號值。依次加入一個試紙的加樣孔，讓其反應5mins後放入Line xMAP檢測儀器讀取四個點的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試3次記錄其相應的螢光信號值。4. 3數據處理和標準曲線方程的生成，將3批720次測定的360個數據輸入電腦數據分析軟體，分別模擬出心肌標誌物六項的函數曲線方程。5.樣品臨床檢測實驗5. I樣品收集，分別收集3家三甲醫院檢驗科的當天樣本共270例，其中心肌標誌物六項陽性樣本各30例，正常樣本60例，心肌標誌物六項檢測兩項以上同時陽性的30例。5. 2將270例樣本同時與roche電化學發光試劑作為對照。6.數據處理6. I原始數據6. 2處理數據結果實施例五五項(cTNI，MYO, BNP, CK-MB, FABP)心肌標誌物晶片檢測試紙(快速量子螢光免疫定量檢測晶片試紙法)實驗材料cTNI, MYO, BNP, FABP 抗體對為 LINC-BI0 和 Hytest 公司提供；CK-MB,抗體對為Medix公司提供MYO, CK-MB,抗原為 LINC-BI0 公司提供；BNP, cTNI抗原也是LINC-BI0公司提供；
兔抗小鼠IgG為自製；量子螢光為50nm量子點，吸收波長為532nm，激發光波長為757nm，購自英俊生物。常規試劑為市售品。實驗方法I.準備I. I分別將五個項目的一抗用50Mm Tris-HCl PH7. 5配製為l_5mg/ml濃度。I. 2 將兔抗小鼠 IgG 用 50Mm Tris-HCl PH7. 5 配製為 l_5mg/ml 濃度。
I. 3準備硝酸纖維素膜(NC膜，Whatman公司貨號BA85) 20mmX5mm大小。I. 4準備玻璃纖維和吸水紙(3M公司)。2.實驗操作2. I五個項目的一抗和兔抗小鼠IgG點膜，採用GeSim Nano-Plotter TM 2. I晶片點樣系統將準備好的五種一抗和兔抗小鼠IgG分別點在NC膜上,每點噴點10-200nl,分別排成2排，兔抗小鼠IgG在左上角，加上五個項目的一抗分為兩排，每排3點，點間距2mm，排間距為3mm。並且將點好樣品的膜條放入真空乾燥箱中風乾保存備用。2. 2五個項目的二抗用量子螢光標記2. 2. I用25mM CBS PH9. 6緩衝液配製量子螢光為0. lmg/ml ；2. 2. 2將待標記二抗裝入透析袋中，紮好透析袋，並且將待標記抗體透析袋放入上述配製的量子螢光溶液中4°C透析攪拌過夜；2. 2. 3將標記過夜的透析袋取出再放入20mM PBS PH7. 4緩衝液中4°C透析攪拌透析4hours換液一次,共3次即可；2. 2. 4將處理好的量子螢光的抗體取出測定濃度備用。2. 3量子螢光標記抗體的玻璃纖維固定2. 3. I將標記好的抗體四個項目的二抗用20mM PBS PH7. 4緩衝液，配製成5-30ug/ml的濃度的混合溶液；2. 3. 2將玻璃纖維浸泡在2. 3. I量子螢光標記抗體緩衝液中4°C過夜；2. 3. 2取出浸泡好的玻璃纖維放入真空風乾箱中風乾保存備用。3.晶片試紙的組裝3. I材料準備3. I. I吸水紙準備，將吸水紙剪切為5mmX10mm大小備用；3. I. 2將固定好藻紅蛋量子螢光標記好二抗的玻璃纖維剪切為5mmX5mm大小備用。3. 2 組裝3. 2. I將吸水紙和玻璃纖維及點有抗原抗體的NC膜固定在一起，吸水紙在上，玻璃纖維在中間，NC膜在下面，並且NC膜抗體端在玻璃纖維連接處；3. 2. 2再在NC膜抗原端固定一段吸水紙；3. 2. 3使用塑料卡將固定好的晶片試紙封裝在塑料卡裡面，吸水紙的一端放在留有加樣孔的下面；3. 2. 4將生產好的晶片試紙卡片放入鋁箔袋中密封保存備用，並且加印好名稱和使用方法。
4.定量曲線的制定4. I原料準備和抗原標準品的配製，將購買的cTNI，CK-MB, MYO, BNP, FABP抗原用50%的小牛血清緩衝液，根據標識濃度分別配製為cTNI抗原濃度為0，0. 5,2. 5，12. 5，25,50ng/ml 六個梯度，體積各 3ml 備用；MY0 抗原濃度為:0，10，50，250，1000，4000ng/ml六個梯度，BNP抗原濃度為0，l，5，20，100，200ng/ml六個梯度；CK-MB抗原濃度為0，2. 5，10，50，200，500ng/ml ；FABP 抗原濃度為:0，2，10，50，100，200ng/ml 六個梯度，，體積各 3ml備用。並且每種梯度配製3批。4. 2測試實驗，取出生產好的心肌標誌物六項聯檢晶片試紙；分別取配製的心肌標誌物六項梯度lOOul，依次加入一個試紙的加樣孔，並且將晶片試紙插入晶片試紙檢測儀(LincxMAP平臺)器插孔中接通磁場電源，讓其在磁場中運動(即樣品先進入晶片試紙加樣空，經過樣品濾紙，進入玻璃纖維層，樣品中的六項抗原分別與磁性量子螢光標記的抗體結合，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原複合物，磁性量子點在儀器磁場下運動，當運動到固定有抗心肌標誌物六項的抗體點時，複合物被固定的抗體捕獲，形成磁性量子螢光-抗體2-抗原-抗體I的複合物，並且複合物不能繼續運動，而其他的未被捕獲的物質繼續流動到頂端的吸水紙上)反應約5mins後，晶片試紙檢測儀(Line xMAP平臺)器讀取複合物上的的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試20次記錄其相應的螢光信號值。依次加入一個試紙的加樣孔，讓其反應5mins後放入Line xMAP檢測儀器讀取四個點的螢光信號，並且每批的每個樣品重複測試3次記錄其相應的螢光信號值。4. 3數據處理和標準曲線方程的生成，將3批720次測定的360個數據輸入電腦數據分析軟體，分別模擬出心肌標誌物六項的函數曲線方程。5.樣品臨床檢測實驗5. I樣品收集，分別收集3家三甲醫院檢驗科的當天樣本共270例，其中心肌標誌物六項陽性樣本各30例，正常樣本60例，心肌標誌物四項檢測兩項以上同時陽性的30例。5. 2將270例樣本同時與roche電化學發光試劑作為對照。6.數據處理6. I原始數據6. 2處理數據結果綜上所述，本發明提出的多項心肌標誌物並行檢測方法、系統及用到的晶片試紙， 可以同時定量檢測多項心肌標誌物，並可提高檢測的靈敏度，節約檢測時間。這裡本發明的描述和應用是說明性的，並非想將本發明的範圍限制在上述實施例中。這裡所披露的實施例的變形和改變是可能的，對於那些本領域的普通技術人員來說實施例的替換和等效的各種部件是公知的。本領域技術人員應該清楚的是，在不脫離本發明的精神或本質特徵的情況下，本發明可以以其它形式、結構、布置、比例，以及用其它組件、材料和部件來實現。在不脫離本發明範圍和精神的情況下，可以對這裡所披露的實施例進行其它變形和改變。
權利要求
1.一種多項心肌標誌物並行檢測方法，其特徵在於，用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO, CK-MB, BNP、CRP, FABP中的部分或全部；所述方法包括如下步驟 步驟SI :將上述被檢測物質相應的捕獲單抗固定在晶片試紙的第一膜片上，所述晶片試紙包括第一膜片、第二膜片；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾或虹吸或磁場或電場或重力場作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成第一膜片-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲第一膜片同時裝配，留檢測孔；步驟S2 :滴加樣本血清，當滴加的樣本血清中存在上述蛋白抗原物質時,層析過程中先於同時層析的第二膜片上的標記二抗結合，此結合物再被第一膜片上的捕獲抗體截獲；步驟S3 :將螢光信號固定在第一膜片上於螢光檢測儀檢測，螢光強度與樣本血清中目的蛋白濃度成正比，螢光強度通過在檢測儀中轉換成數位訊號，根據內標標準曲線直接用於計算蛋白濃度。
2.根據權利要求I所述的多項心肌標誌物並行檢測方法，其特徵在於 所述步驟S3包括 所述螢光檢測儀的雷射發射器發出雷射，該雷射同時激發晶片試紙內的多種信號標記物，該些標記物受雷射激發後發生能量躍遷，釋放出另外一種變異的光波或者電子物質； 所述螢光檢測儀的信號接收裝置接收信號標記物釋放出的光波或者電子傳遞物信號，並且把信號轉化為數位訊號，信號標記物釋放信號的大小與數值大小正相關；然後螢光檢測儀將處理過的接收的信號進行計算，然後轉換為模擬信號，輸出該模擬信號，該輸出的模擬信號與進行模擬計算，最後輸出被檢測物質的濃度相對應。
3.根據權利要求I所述的多項心肌標誌物並行檢測方法，其特徵在於 所述信號標記物包括螢光素、螢光蛋白、納米金、銀、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素中的一種或多種。
4.根據權利要求3所述的多項心肌標誌物並行檢測方法，其特徵在於 所述螢光素包括FITC、Cy2 TM、Alexa TM 488,Cy3 TM、Alexa TM 546 中的一種或多種。
5.根據權利要求3所述的多項心肌標誌物並行檢測方法，其特徵在於 所述螢光蛋白包括GFP、R-PE, R-PC中的一種或多種。
6.一種用於多項心肌標誌物並行檢測的晶片試紙，其特徵在於，所述晶片試紙用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO, CK-MB, BNP、CRP, FABP中的部分或全部； 所述晶片試紙包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上設有各標誌物的配體An，在第二膜片上吸附有信號標記物偶聯的配基Bn ； 將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾或虹吸或磁場或電場或重力場作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成第一膜片_配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲第一膜片同時裝配，留檢測孔。
7.根據權利要求6所述的用於多項心肌標誌物並行檢測的晶片試紙，其特徵在於 所述信號標記物包括螢光素、螢光蛋白、納米金、銀、納米螢光微球、量子點、稀土元素、放射元素、小分子化學物或色素中的一種或多種。
8.—種多項心肌標誌物並行檢測系統，其特徵在於，用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述系統包括 晶片試紙，包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上設有各標誌物的配體An，在第二膜片上吸附有信號標記物偶聯的配基Bn ;將上述被檢測物質相應的捕獲單抗固定在晶片試紙的第一膜片上；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾或虹吸或磁場或電場或重力場作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成第一膜片-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲第一膜片同時裝配，留檢測孔；滴加樣本血清，當滴加的樣本血清中存在上述蛋白抗原物質時，層析過程中先於同時層析的第二膜片上的標記二抗結合，此結合物再被第一膜片上的捕獲抗體截獲； 螢光檢測儀，用以檢測固定在第一膜片上的螢光信號，螢光強度與樣本血清中目的蛋白濃度成正比，螢光強度通過在檢測儀中轉換成數位訊號，根據內標標準曲線直接用於計算蛋白濃度。
9.根據權利要求8所述的多項心肌標誌物並行檢測系統，其特徵在於 所述突光檢測儀包括雷射器、濾鏡組、濾光片、雙向色鏡、反光鏡、第一物鏡、第二濾光片、第二物鏡、光欄和晶片試紙，以及光電倍增管PMT兀件,信號放大器AMP兀件,轉換器A/D元件，⑶晶片，輸出列印設備，主板和電源設備。
10.根據權利要求8所述的多項心肌標誌物並行檢測系統，其特徵在於 所述螢光檢測儀的雷射發射器發出雷射，該雷射同時激發晶片試紙內的多種信號標記物，該些標記物受雷射激發後發生能量躍遷，釋放出另外一種變異的光波或者電子物質； 所述螢光檢測儀的信號接收裝置接收信號標記物釋放出的光波或者電子傳遞物信號，並且把信號轉化為數位訊號，信號標記物釋放信號的大小與數值大小正相關；然後螢光檢測儀將處理過的接收的信號進行計算，然後轉換為模擬信號，輸出該模擬信號，該輸出的模擬信號與進行模擬計算，最後輸出被檢測物質的濃度相對應。
全文摘要
本發明揭示了一種多項心肌標誌物並行檢測方法及系統、晶片試紙，所述晶片試紙用以檢測心肌標誌物cTNI、cTNT、MYO、CK-MB、BNP、CRP、FABP中的部分或全部；所述晶片試紙包括第一膜片、第二膜片；在第一膜片上設有各標誌物的配體An，在第二膜片上吸附有信號標記物偶聯的配基Bn；將與配體An和Bn形成夾心檢測的被檢測物質從加樣孔加入後通過滲濾(或其他)作用力下移動分別與配體Bn和An結合形成第一膜片-配體An-被檢測物-配體Bn-信號標記物的複合固定於第一膜片上形成複合物陣列，與捕獲纖維膜同時裝配，留檢測孔。本發明提出的多項心肌標誌物並行檢測方法、系統及用到的晶片試紙，可以同時定量檢測多項心肌標誌物，並可提高檢測的靈敏度，節約檢測時間。
文檔編號G01N21/63GK102636651SQ20121010047
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月6日 優先權日2012年4月6日
發明者羅朝領, 茅柳娟 申請人:上海領潮生物科技有限公司