一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法

2023-05-20 01:25:01

專利名稱：一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法
技術領域：
本發明涉及功能納米材料和生物化學領域，具體涉及一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，本發明通過蛋白酶對多肽底物的酶切反應，用所得的酶切產物作為表面配體來合成具有螢光效應的納米材料量子點，然後再根據所合成的量子點的螢光效應的變化，來反映酶切反應後產物的變化，從而來反映蛋白酶活性的變化。
背景技術：
蛋白酶對蛋白質和多肽底物的特異性催化水解反應，對於生物體的正常生命活動發揮著極其重要的作用。檢測酶含量及存在，很難直接用酶的量(例如質量、體積、濃度)來表示，而常用酶催化某一特定化學反應的能力來表示酶量，即用酶活性來表示。研究表明，蛋白酶活性的失調能夠引起疾病，如癌症，炎症、退化性疾病等，這已經引起了科學家的廣泛關注，因此在研究中需要檢測蛋白酶的活性，檢測蛋白酶的活性在蛋白酶活性相關疾病的醫學診斷和工業生產方面都具有十分重要的意義。傳統的酶活性檢測方法，如免疫螢光吸附方法(簡稱ELISA)，Tothill的研究表明免疫螢光吸附方法雖然方便，但其靈敏度有限；Lamore S.D.提出雖然質譜和凝膠電泳方法的檢測靈敏度高，但是需要昂貴的儀器設備，且不能定量；Lee J.S.等的研究表明螢光共振能量轉移方法的靈敏度雖高，但由於底物的局限性，使其不具備普適性。因此，如何設計一種高效的、方便快捷、成本低的新型蛋白酶活性檢測方法成為本發明研究的課題。

發明內容
本發明目的是提供一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，其目的在於解決目前蛋白酶檢測方法靈敏度有限、成本較高以及不具備普遍適用性的問題。為達到上述目的，本發明採用的技術方案是:一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，有兩個部分組成，
第一部分:
事先建立所需檢測的蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，所述相關關係的建立由下列步驟組成:
第一步，針對所需檢測的蛋白酶的種類，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物；
所述蛋白酶的種類是指具有特異性切割位點的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種；
所述多肽底物中包含一段由2 10個胺基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被所述蛋白酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸，其中，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸；
第二步，在第一步的基礎上，在所需檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適PH值條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的蛋白酶，各組已知濃度的蛋白酶之間具有濃度梯度，然後進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，多組已知濃度的蛋白酶中的最高濃度為所述多肽底物摩爾濃度的0.59Γ10 %，設定的每一組酶切反應的時間相同並且小於或等於最高濃度的蛋白酶100%酶切多肽底物的時間；投入的所述多肽底物中含有的巰基基團的摩爾濃度在0.5 10mmol/L之間； 第三步，向所述各組酶切產物中投入相同量的用於合成量子點的具有金屬離子和非金屬離子的前驅體，並在25 100°C下反應0.5^1小時，各組反應結束後生成量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子的摩爾濃度為所述多肽底物中含有的巰基基團的摩爾濃度的85 120%，非金屬離子的摩爾濃度為金屬離子摩爾濃度的20 9Γ100 % ；
所述金屬離子的前驅體選自鎘化合物、鉛化合物、銀化合物、鋅化合物、銦化合物、汞化合物、銅化合物、錳化合物中的任意一種或任意兩種，所述非金屬離子的前驅體選自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一種或任意兩種；但任意兩種金屬離子的前驅體與任意兩種非金屬離子的前驅體不同時應用於一個合成量子點的反應;
所述量子點是二元量子點，具體為締化鎘、硒化鎘、硫化鎘、硫化鉛、硒化鉛、硫化銀、硒化銀、硫化鋅、硒化鋅、碲化鋅、磷化鎘、砷化鎘、磷化銦、砷化銦中的任意一種，或者所述量子點是三元量子點，具體為鎘汞碲、鎘汞硒、鎘汞硫、鋅汞碲、鋅汞硒、鋅汞硫、鋅鎘碲、鋅鎘硒、鋅鎘硫，鋅締硒，鋅締硫、鋅硒硫、鎘締硒、鎘締硫、鎘硒硫、鋅銅硒、鋅猛硒、銅銦硫、銅銦硒中的任意一種；
第四步，對第三步中各組生成的量子點進行螢光光譜測定，得到所述量子點的螢光光譜波峰強度，再根據所需檢測的多組蛋白酶的已知濃度，最終得到蛋白濃度與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，即蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係；
第二部分:
針對胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種，蛋白酶活性檢測方法由以下步驟組成:
第一步，設計多肽底物
針對被檢測的蛋白酶種類，設計一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物； 第二步，進行酶切反應
設計好多肽底物後，在被檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適PH值條件下，向多肽底物中投入未知濃度的被檢測蛋白酶，然後進行酶切反應，得到酶切產物；其中，酶切反應的時間與所述第一部分的第二步中酶切反應時間相同，所述多肽底物的量與所述第一部分的第二步中多肽底物的量相同；
第三步，合成量子點
向第二步中的酶切產物中投入用於合成量子點的所述第一部分的第三步中的前驅體，並在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時間條件下反應，結束後生成量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅體中金屬離子和非金屬離子的量相同；第四步，獲得被檢測的未知濃度的蛋白酶的活性
對第三步中生成的量子點進行螢光光譜測定，得到該量子點的螢光光譜波峰強度，再將該螢光光譜波峰強度與所述第一部分中得到的相關關係進行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的蛋白酶活性。上述技術方案中的有關內容解釋如下:
1、上述方案中，多組已知濃度的蛋白酶中的最高濃度為所述多肽底物摩爾濃度的
0.59Γ10 %，酶切反應的時間小於或等於所述第一部分的第二步中最高濃度的蛋白酶100%酶切多肽底物的時間，也就是說當已知不同濃度的蛋白酶與相同量的多肽底物進行酶切反應時，若最高濃度的蛋白酶還沒有與多肽底物反應完，那麼其他低濃度的蛋白酶就一定沒有與多肽底物完全反應，則由已知不同濃度的蛋白酶與相同量的多肽底物進行酶切反應生成的酶切產物的量不同，進而用酶切產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度也不同。2、上述方案中，所述最適溫度是指酶促催化反應速度隨溫度升高而達到一最大值時的溫度，最適PH是指酶催化活性最高時溶液的pH值，pH過高或過低均可導致酶催化活性的下降。每一種蛋白酶都有各自的最適溫度以及最適pH，本領域普通技術人員能夠容易得到每一種蛋白酶的最適溫度以及最適pH。3、上述方案中，在所述第一部分的第二步與所述第二部分的第二步中，所述pH值採用PH緩衝溶液來調節，pH緩衝溶液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液(又稱Tris-HCl緩衝溶液)、碳酸氫氨緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液(又稱PBS緩衝溶液)中的任意一種；上述pH緩衝溶液中還可以含有體積分數為0.Γ %的血清，即指上述pH緩衝溶液中血清的體積佔溶液總體積的0.f 1% 。本發明設計原理是:量子點(英文名稱quantum dots, QDs)是一種尺度小於或者近似激子波爾粒徑的半導體納米晶體，具有獨特的光學性質，比如激發譜寬而連續分布，發射波長可通過粒徑大小和組成成分進行調節，螢光量子產率高，壽命長，因而在螢光標記成像，發光器件，光電材料等領域有著廣泛的應用前景。採用含巰基的胺基酸或多肽製備量子點的方法也已十分成熟，如Wing-Cheung Law採用半胱氨酸(英文名稱L-cysteine)合成CdTe量子點，Ying-Fan Liu採用穀胱甘肽(英文名稱GSH)合成CdTe量子點。Kimihiro Susum研究發現量子點的穩定性與其表面的巰基化合物配體的性質緊密相關。使用含雙巰基的化合物配體相比於含單巰基的化合物配體，對量子點進行表面配體交換後，量子點表現出更強的穩定性，即雙巰基配體與單巰基配體對量子點有著不同的影響。所以，可以推測，使用雙巰基和單巰基的配體來合成的量子點，會具有不同的螢光效應。反之，通過合成的量子點的螢光效應的變化，便可推測其合成配體化合物中含有的巰基的數目的變化。假設配體化合物為含有特定酶切位點的多肽，且該酶切位點兩邊各含一個巰基，那麼隨著酶濃度的升高，進行酶切反應後，獲得的產物中含雙巰基的多肽數量逐漸減少，含單巰基的多肽數量逐漸增多，合成的量子點的螢光也隨之發生變化，從而可以通過量子點的螢光變化反推酶濃度的變化，即對酶活性進行有效檢測。本發明在已有的技術基礎上，提出了一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，通過設計含有所需檢測的酶的特異性酶切位點的底物，在與不同濃度的蛋白酶作用後，所得到的不同產物作為表面配體來合成具有不同螢光效應的納米材料量子點，即通過所合成的量子點的螢光效應的變化，來反映作為配體的酶切產物的變化，從而最終來反映蛋白酶活性的變化。在本發明的新型高效的蛋白酶活性檢測方法中，雖然也利用量子點的螢光效應的變化來反映蛋白酶活性的變化，但完全不同於採用量子點進行的螢光共振能量轉移方法。本發明中的蛋白酶活性檢測方法的核心在於用相同含量的多肽底物與不同含量的蛋白酶進行酶切反應後的不同酶切產物來合成具有不同螢光效應的量子點，從而來反推蛋白酶的活性；而螢光共振能量轉移的方法在於連接有特定多肽底物的特定量子點在與不同含量的酶作用後，量子點的螢光效應發生變化，從而來推斷酶的活性。由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有的優點和效果是:由於酶切底物的特異性、量子點螢光與表面配體化合物的緊密相關性以及合成量子點的經濟和便捷性，使本發明的蛋白酶活性檢測方法相較於傳統的蛋白酶活性檢測方法，如免疫螢光吸附方法、質譜、凝膠電泳以及螢光共振能量轉移等方法具有更高的經濟實用性、更高的靈敏度以及更高的便捷性等特點。並且本發明的蛋白酶活性檢測方法具有普遍應用性，即只需根據所需檢測的蛋白酶的種類，相應改變多肽底物中的酶切位點，無需改變多肽底物中含巰基的胺基酸及其他部分，也無需改變量子點的合成過程，便可實現對不同種類的蛋白酶的活性的檢測。也就是說，本發明提供的蛋白酶活性檢測方法方便快捷、靈敏度高、成本低，並且具有普遍適用性。



附圖1為本發明一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法流程 附圖2為本發明實施例一的螢光比較 附圖3為本發明實施例一的第一質譜 附圖4為本發明實施例一的第二質譜 附圖5為本發明實施例一的量子點的螢光光譜圖
附圖6為本發明實施例一的量子點的螢光光譜波峰強度與蛋白酶活性的相關標準曲
線.-^4 ，
附圖7為本發明實施例一的量子點的紫外吸收圖譜；
附圖8為本發明實施例一的量子點的第一電鏡圖譜；
附圖9為本發明實施例一的量子點的第二電鏡圖譜；
附圖10為本發明實施例二的量子點的螢光光譜波峰強度與蛋白酶活性的相關標準曲
線.附圖11為本發明實施例三的量子點的螢光光譜波峰強度與蛋白酶活性的相關標準曲
線.附圖12為本發明實施例四的量子點的螢光光譜波峰強度與蛋白酶活性的相關標準曲線。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述:
實施例一:一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法
蛋白酶活性檢測方法流程可參見圖1所示。本實施例為胰蛋白酶(英文名稱:trypSin)活性檢測方法。第一部分:
事先建立胰蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，所述相關關係的建立由下列步驟組成:
第一步，針對胰蛋白酶，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4個胺基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被胰蛋白酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸(符號:C)，其特異性酶切位點是氨基端(化學式:NH2-)為賴氨酸(符號:K)，羧基端(化學式:C00H_)為甘氨酸(符號:G)的之間的肽鍵，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸，肽鏈的兩端還各連接有一個甘氨酸，即該多肽底物為NH2-GCKGCG-C00H，其被胰蛋白酶酶切後的產物為NH2-GCk-COOH和nh2-gcg-cooh。第二步，在第一步的基礎上，在胰蛋白酶的最適溫度以及最適pH條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的蛋白酶，然後進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，胰蛋白酶的最適溫度為人體的生理溫度37°C，最適pH值為疒9。所投入的多肽底物中的巰基含量為1.15 mmol/L，胰蛋白酶的梯度濃度設定為O μ mol/L、0.2 μ mol/L、I μ mol/L>2 μ mol/L L、5 μ mol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L、40 μ mol/L，在 pH = 8.2 並且含體積分數
0.1 %血清的碳酸氫銨緩衝液中，37 °C水浴條件下，反應2小時。設定的每一組酶切反應的時間相同並且小於最高濃度的胰蛋白酶100%酶切多肽底物的時間。第三步，向所述各組酶切產物中投入1.15 mmol/L的氯化鎘(化學式=CdCl2)前體和0.30 mmol/L的碲氫化鈉(化學式:NaHTe)前體，100 °C下反應I小時以合成CdTe量子點。第四步，對第三步中各組生成的CdTe量子點進行螢光光譜測定，得到所述量子點的螢光光譜波峰強度，再由多組胰蛋白酶的已知濃度，繪製標準曲線。梯度濃度的胰蛋白酶水解多肽底物的產物合成的CdTe量子點的螢光光譜波峰強度與胰蛋白酶梯度濃度的相關標準曲線,參見圖6所示。第二部分:
針對胰蛋白酶，所述胰蛋白酶活性檢測方法由以下步驟組成:
第一步，設計多肽底物
設計一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，進行酶切反應
設計好多肽底物後，在所述第一部分的第二步中的反應條件下，向多肽底物中投入未知濃度的胰蛋白酶，然後進行酶切反應，得到酶切產物。其中，酶切反應的溫度、PH條件、酶切反應的時間以及多肽底物的量均與所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子點
向第二步中的酶切產物中投入用於合成量子點的所述第一部分的第三步中的前驅體，並在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時間條件下反應，結束後生成CdTe量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅體中金屬離子和非金屬離子的量相同。第四步，獲得被檢測的未知濃度的胰蛋白酶的活性
對第三步中的CdTe量子點進行螢光光譜測定，得到量子點的螢光光譜波峰強度，再將該螢光光譜波峰強度與所述第一部分中得到的相關標準曲線進行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的胰蛋白酶的活性。
圖2表示多肽底物與梯度濃度中的最高濃度胰蛋白酶酶切反應後的產物合成的CdTe量子點以及只有多肽底物合成的CdTe量子點在紫外燈下的螢光比較照片。做法是在365 nm的普通紫外燈的照射下，用普通相機直接拍照。其中，圖2中右邊的EP管代表的是梯度濃度中最高濃度的胰蛋白酶切割多肽底物後生成的量子點，其螢光最強；左邊的EP管代表的是多肽底物完全沒有被胰蛋白酶切割(或胰蛋白酶濃度為O)時候，直接合成量子點是沒有螢光的。這個圖片直觀地表示了需要做的標準曲線的最高點和最低點。圖3和圖4表示梯度濃度的胰蛋白酶對多肽底物酶切後產物的質譜圖，做法是將200 μ L的胰蛋白酶對多肽底物剪切前後的產物在1200LC-6410B/QQQ/MS液相質譜儀(生產廠家:美國Agilent公司)上測試的，每個樣品的分析時間是15分鐘。其中，荷質比524為NH2-GCKGCG_C00H，荷質比307為NH2-GCK_C00H。圖3中分子量524為酶切之前的多肽底物NH2-GCKGCG-C00H，圖4中分子量307為多肽底物NH2-GCKGCG-C00H被酶切割後的產物，這說明胰蛋白酶與多肽底物作用後，確實是可以對多肽底物進行切割的，因此通過這樣的切割，得到的不同酶切產物，才能合成螢光強弱不同的量子點。圖5表示不同梯度濃度的胰蛋白酶水解多肽底物的產物合成的CdTe量子點的螢光光譜圖，做法是以365 nm的紫外光作為激發光源，採用AvaSpeC-ULS2048-USB2光纖光譜儀(生產廠家:荷蘭Avantes公司)進行測試的一個結果。其中，橫軸表示波長，單位為納米(nm)，縱軸表示相對螢光光譜的波峰強度。從圖5可以看出，不同濃度的胰蛋白酶切割多肽底物後，合成的量子點的螢光光譜的變化，從下到上，隨著胰蛋白酶濃度的升高，得到的量子點的螢光光譜的波峰強度也是逐漸增強，為建立酶濃度-量子點螢光強度標準曲線提供依據。在以上驗證實驗的基礎上，得到了不同梯度濃度的胰蛋白酶水解多肽底物的產物合成的CdTe量子點的螢光光譜波峰強度與胰蛋白酶梯度濃度的相關標準曲線，參見圖6所示，對圖5中的螢光光譜進行的一個轉化，橫軸是胰蛋白酶濃度，單位為ymol/L，縱軸是對應的CdTe量子點的螢光光譜的波峰強度數值與背景的比值(背景即為酶濃度為O時的螢光光譜的波峰強度)。圖7表示多肽底物與梯度濃度中的最高濃度胰蛋白酶酶切反應後的產物合成的CdTe量子點、只有多肽底物合成的CdTe量子點以及只有梯度濃度中的最高濃度胰蛋白酶合成的量子點的紫外吸收圖譜，橫軸表示波長，單位為納米(nm)，縱軸表示吸光度。做法是在CARY50紫外可見分光光度計(生產廠家:美國Varian公司)上測量的；圖7的紫外吸收光譜能反應其中量子點的粒徑大小和濃度，圖中越往右邊(即橫軸越大)，則量子點的粒徑越大；越往上邊(即縱軸越大)，則量子點的濃度越大。從這個圖片可以看出，只有多肽底物時(即酶濃度為O時)合成的量子點，標記為Peptide+CdTe，在橫軸右邊(SP350^600 nm)處，縱軸數值(即吸光度值)很低，即表明其中的量子點的粒徑偏小，或者說其中的大粒徑的量子點偏少；相反在加入最高濃度的胰蛋白酶之後，合成的量子點，標記為P印etide+Trypsin+CdTe，其在350 600 nm處，吸光度明顯變高，即表明其中的量子點粒徑偏大，或者說其中的大粒徑的量子點偏多。而最重要的是大粒徑的量子點才會發出螢光，小粒徑的量子點不會發出螢光，因此圖7從一個側面為本發明的檢測方法提供了理論依據。當不加胰蛋白酶，也不加合成量子點的前體，其在相同區域，吸光度基本為O，即基本沒有吸收；當僅有最高濃度的胰蛋白酶，不加多肽底物，也不加合成量子點的前體，其在相同區域，吸光度基本也為O，即基本沒有吸收。這兩個作為對照，證明上面的在35(T600 nm區域吸光度的變化不是因為多肽底物而改變的，也不是因為胰蛋白酶而改變，因此也就可以推斷只有合成的不同的量子點才是變化的原因。圖8表示多肽底物與梯度濃度中最高濃度的胰蛋白酶酶切反應後的產物合成的CdTe量子點的電鏡圖譜，圖9表示只有多肽底物合成的CdTe量子點的電鏡圖譜。做法是在200KV的JEM-2100透射電子顯微鏡(生產廠家:日本JEOL公司)下拍攝，得到電鏡圖譜。圖8和圖9更加直觀的說明了圖片7的內容。圖8是多肽底物加了梯度濃度中最高濃度的胰蛋白酶之後合成的量子點，顆粒粒徑明顯比圖9中的大(兩幅圖片中左上角的是高分辨的圖，更加直觀反映這個粒徑變化)，從而跟圖7相互印證，說明加入最高濃度的胰蛋白酶與濃度為O的胰蛋白酶，合成的量子點粒徑有明顯變化，從而為螢光變化提供依據，也為建立標準曲線提供依據。圖7、圖8以及圖9從一個側面還反應了:隨著酶濃度的提升，切割多肽底物後，量子點的螢光逐漸增強，其根本原因在於所合成的量子點的平均粒徑在逐步增大，或者說大粒徑的量子點所佔比例在逐漸升高。實施例二:一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法
蛋白酶活性檢測方法流程可參見圖1所示。本實施例為膠原酶(英文名稱:collagenase)活性檢測方法。第一部分:
事先建立膠原酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，所述相關關係的建立由下列步驟組成:
第一步，針對膠原酶，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4個胺基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被膠原酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸(符號:C)，其特異性酶切位點是脯氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸(符號=P-C-G-P)中半胱氨酸(符號:C)之後的肽鍵，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸，肽鏈的一端還連接有一個脯氨酸，該多肽底物為nh2-pcgpc-cooh，其被膠原酶酶切後的產物為NH2-PC-COOH和NH2-GPC-C00H。第二步，在第一步的基礎上，在膠原酶的最適溫度以及最適pH條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的膠原酶，然後進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，膠原酶的最適溫度為人體的生理溫度37°C，最適pH為7.4。所投入的多肽底物中的巰基含量為0.5mmol/L,膠原酶的梯度濃度設定為O μ mol/L、0.01 μ mol/L、0.2 μ mol/L、I μ mol/L、2 μ mol/L、5 μ mol/L、10 μ mol/L、25 μ mol/L,在 pH =7.4 的憐酸鹽緩衝溶液中，37°C水浴條件下，反應2小時。設定的每一組酶切反應的時間相同並且小於最高濃度的膠原酶100%酶切多肽底物的時間。第三步，向所述各組酶切產物中投入0.6 mmol/L的硝酸銀(化學式=AgNO3)前體和0.3 mmol/L的硫化鈉(化學式=Na2S)前體，100 °C下反應0.5小時以合成Ag2S量子點。第四步，對第三步中各組生成的Ag2S量子點進行螢光光譜測定，得到所述量子點的螢光光譜波峰強度，再由多組膠原酶的已知濃度梯度，繪製標準曲線。梯度濃度的膠原酶水解多肽底物的產物合成的Ag2S量子點的螢光光譜波峰強度與膠原酶梯度濃度的相關標準曲線，參見圖10所示，是對螢光光譜進行的轉化，其中，橫軸是膠原酶濃度，單位為μ mol/L,縱軸是對應的Ag2S量子點的螢光光譜的波峰強度數值與背景的比值(背景即為酶濃度為O時的螢光光譜)。第二部分:
針對膠原酶，所述膠原酶活性檢測方法由以下步驟組成:
第一步，設計多肽底物
設計一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，進行酶切反應
設計好多肽底物後，在所述第一部分的第二步中的反應條件下，向多肽底物中投入未知濃度的膠原酶，然後進行酶切反應，得到酶切產物。其中，酶切反應的溫度、PH條件、酶切反應的時間以及多肽底物的量均與所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子點
向第二步中的酶切產物中投入用於合成量子點的所述第一部分的第三步中的前驅體，並在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時間條件下反應，結束後生成Ag2S量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅體中金屬離子和非金屬離子的量相同。第四步，獲得被檢測的未知濃度的膠原酶的活性
對第三步中的Ag2S量子點進行螢光光譜測定，得到量子點的螢光光譜波峰強度，再將該螢光光譜波峰強度與所述第一部分中得到的相關標準曲線進行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的膠原酶的活性。實施例三:一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法 本實施例為凝血酶(英文名稱:thrombin)活性檢測方法。第一部分:
事先建立凝血酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，所述相關關係的建立由下列步驟組成:
第一步，針對凝血酶，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4個胺基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被凝血酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸(符號:C)，其特異性酶切位點是氨基端(NH2-)為精氨酸(R)，羧基端(C00H-)為甘氨酸(G)的之間的肽鍵，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸，該多肽底物為NH2-CRGC-C00H，其被凝血酶酶切後的產物為NH2-CR-COOH和NH2-GC-COOH。第二步，在第一步的基礎上，在凝血酶的最適溫度以及最適pH條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的凝血酶，然後進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，凝血酶的最適溫度為人體的生理溫度37°C，最適pH為疒9。所投入的多肽底物中的巰基含量為10 mmol/L,凝血酶的梯度濃度設定為O μ mol/L、0.01 μ mol/L、0.02 μ mol/L、0.05 μ mol/L、I μ mol/L、5 μ mol/L、20 μ mol/L、50 μ mol/L,在 pH =8.3 的含體積分數 0.5 %血清的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液(又稱Tris-HCl緩衝溶液)中，37 °C水浴條件下，反應2小時。設定的每一組酶切反應的時間相同並且小於最高濃度的凝血酶100%酶切多肽底物的時間。
第三步，向所述各組酶切產物中投入等體積的10 mmol/L的醋酸鋅(化學式:Zn (CH3COO)2)前體、I mmol/L氯化鎘(CdCl2)前體以及6 mmol/L的硒氫化鈉(NaHSe)前體，100 °C下反應I小時以合成ZnCdSe量子點。第四步，對第三步中各組生成的ZnCdSe量子點進行螢光光譜測定，得到所述量子點的螢光光譜波峰強度，再由多組凝血酶的已知濃度梯度，繪製標準曲線。梯度濃度的凝血酶水解多肽底物的產物合成的ZnCdSe量子點的螢光光譜波峰強度與凝血酶梯度濃度的相關標準曲線，參見圖11所示，是對螢光光譜進行的轉化，其中，橫軸是凝血酶濃度，單位為ymol/L，縱軸是對應的ZnCdSe量子點的螢光光譜的波峰強度數值與背景的比值(背景即為酶濃度為O時的螢光光譜)。第二部分:
針對凝血酶，所述凝血酶活性檢測方法由以下步驟組成:
第一步，設計多肽底物
設計一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，進行酶切反應
設計好多肽底物後，在所述第一部分的第二步中的反應條件下，向多肽底物中投入未知濃度的凝血酶，然後進行酶切反應，得到酶切產物。其中，酶切反應的溫度、pH條件、酶切反應的時間以及多肽底物的量均與所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子點
向第二步中的酶切產物中投入用於合成量子點的所述第一部分的第三步中的前驅體，並在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時間條件下反應，結束後生成ZnCdSe量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅體中金屬離子和非金屬離子的量相同。第四步，獲得被檢測的未知濃度的凝血酶的活性
對第三步中的ZnCdSe量子點進行螢光光譜測定，得到量子點的螢光光譜波峰強度，再將該螢光光譜波峰強度與所述第一部分中得到的相關標準曲線進行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的凝血酶的活性。實施例四:一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法
本實施例為Caspase-3 (半胱氨酸蛋白酶中的一種)活性檢測方法。第一部分:
事先首先建立Caspase-3活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，所述相關關係的建立由下列步驟組成:
第一步，針對Caspase-3，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由4個胺基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被Caspase-3酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸(符號:C)，其特異性酶切位點是天冬氨酸之後的肽鍵，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸，肽鏈的兩端還各連接有一個甘氨酸，該多肽底物為NH2-GCAGCG-C00H，其被Caspase-3酶切後的產物為NH2-GCA-C00H和
nh2-gcg-cooh。第二步,在第一步的基礎上,在Caspase-3的最適溫度以及最適pH條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的Caspase-3，然後進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，Caspase-3的最適溫度為25°C,最適pH為7.4。所投入的多肽底物中的巰基含量為 5 mmol/T,, Caspase-3 的梯度濃度設定為 O μ mol/L、0.01 μ mol/L、0.05 μ mol/L、0.2 μ mol/L、l μ mol/L、5 μ mol/L、20 μ mol/L、100 μ mol/L,在 pH =7.4 的含體積分數 I % 血清的碳酸氫銨緩衝溶液中，25°C水浴條件下，反應2小時。設定的每一組酶切反應的時間相同並且小於最高濃度的Caspase-3完全酶切多肽底物的時間。第三步，向所述各組酶切產物中投入0.6 mmol/L的氯化鎘(化學式=CdCl2)前體、等體積的0.20 mmol/L的碲氫化鈉(化學式:NaHTe)以及0.20 mmol/L的硒氫化鈉(化學式:NaHSe)前體，100 °C下反應I小時以合成CdTeSe量子點。第四步，對第三步中各組生成的CdTeSe量子點進行螢光光譜測定，得到所述量子點的螢光光譜波峰強度，再由多組Caspase-3的已知濃度梯度，繪製標準曲線。梯度濃度的Caspase-3水解多肽底物的產物合成的CdTeSe量子點的螢光光譜波峰強度與Caspase-3梯度濃度的相關標準曲線，參見圖12所示，是對螢光光譜進行的轉化，其中，橫軸是Caspase-3濃度，單位為μ mol/L,縱軸是對應的CdTeSe量子點的螢光光譜的波峰強度數值與背景的比值(背景即為酶濃度為O時的螢光光譜)。第二部分:
針對Caspase-3,所述Caspase-3活性檢測方法由以下步驟組成:
第一步，設計多肽底物
設計一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物。第二步，進行酶切反應
設計好多肽底物後，在所述第一部分的第二步中的反應條件下，向多肽底物中投入未知濃度的Caspase-3，然後進行酶切反應，得到酶切產物。其中，酶切反應的溫度、pH條件、酶切反應的時間以及多肽底物的量均與所述第一部分的第二步中相同。第三步，合成量子點
向第二步中的酶切產物中投入用於合成量子點的所述第一部分的第三步中的前驅體，並在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時間條件下反應，結束後生成CdTeSe量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅體中金屬離子和非金屬離子的量相同。第四步，獲得被檢測的未知濃度的Caspase-3的活性
對第三步中的CdTeSe量子點進行螢光光譜測定，得到量子點的螢光光譜波峰強度，再將該螢光光譜波峰強度與所述第一部分中得到的相關標準曲線進行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的Caspase-3的活性。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，能夠適用於本發明所述檢測方法的蛋白酶均在本發明要求的保護範圍內，也就是說本領域技術人員在上述實施例的啟發下，容易理解其他具有特異性切割位點的蛋白酶，例如蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、基質金屬蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶的活性也能夠用本發明的檢測方法進行檢測。上述實施例的目的在於讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，其特徵在於: 第一部分: 事先建立所需檢測的蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，所述相關關係的建立由下列步驟組成: 第一步，針對所需檢測的蛋白酶的種類，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物； 所述蛋白酶的種類是指具有特異性切割位點的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種； 所述多肽底物中包含一段由2 10個胺基酸構成的肽鏈，所述肽鏈中含有能夠被所述蛋白酶特異性切割的肽鍵以及兩個帶有巰基基團的半胱氨酸，其中，肽鏈的兩端分別是一個帶有巰基基團的半胱氨酸； 第二步，在第一步的基礎上，在所需檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適PH值條件下，向多組相同量的多肽底物中各投入已知濃度的蛋白酶，各組已知濃度的蛋白酶之間具有濃度梯度，然後進行酶切反應，得到各組酶切產物，其中，多組已知濃度的蛋白酶中的最高濃度為所述多肽底物摩爾濃度的0.59Γ10 %，設定的每一組酶切反應的時間相同並且小於或等於最高濃度的蛋白酶100%酶切多肽底物的時間；投入的所述多肽底物中含有的巰基基團的摩爾濃度在0.5 10mmol/L之間； 第三步，向所述各組酶切產物中投入相同量的用於合成量子點的具有金屬離子和非金屬離子的前驅體，並在25 100°C下反應0.5^1小時，各組反應結束後生成量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子的摩爾濃度為所述多肽底物中含有的巰基基團的摩爾濃度的85 120%，非金屬離子的摩爾濃度為金屬離子摩爾濃度的20 9Γ100 % ； 所述金屬離子的前驅體選自鎘化合物、鉛化合物、銀化合物、鋅化合物、銦化合物、汞化合物、銅化合物、錳化合物中的任意一種或任意兩種，所述非金屬離子的前驅體選自含硫化合物、含硒化合物、含碲化合物、含磷化合物、含砷化合物中的任意一種或任意兩種；但任意兩種金屬離子的前驅體與任意兩種非金屬離子的前驅體不同時應用於一個合成量子點的反應; 所述量子點是二元量子點，具體為締化鎘、硒化鎘、硫化鎘、硫化鉛、硒化鉛、硫化銀、硒化銀、硫化鋅、硒化鋅、碲化鋅、磷化鎘、砷化鎘、磷化銦、砷化銦中的任意一種，或者所述量子點是三元量子點，具體為鎘汞碲、鎘汞硒、鎘汞硫、鋅汞碲、鋅汞硒、鋅汞硫、鋅鎘碲、鋅鎘硒、鋅鎘硫，鋅締硒，鋅締硫、鋅硒硫、鎘締硒、鎘締硫、鎘硒硫、鋅銅硒、鋅猛硒、銅銦硫、銅銦硒中的任意一種； 第四步，對第三步中各組生成的量子點進行螢光光譜測定，得到所述量子點的螢光光譜波峰強度，再根據所需檢測的多組蛋白酶的已知濃度，最終得到蛋白濃度與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係，即蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係； 第二部分: 針對胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、膠原酶、基質金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一種，蛋白酶活性檢測方法由以下步驟組成: 第一步，設計多肽底物 針對被檢測的蛋白酶種類，設計一段與所述第一部分的第一步中相同的多肽底物； 第二步，進行酶切反應 設計好多肽底物後，在被檢測的蛋白酶的最適溫度以及最適PH值條件下，向多肽底物中投入未知濃度的被檢測蛋白酶，然後進行酶切反應，得到酶切產物；其中，酶切反應的時間與所述第一部分的第二步中酶切反應時間相同，所述多肽底物的量與所述第一部分的第二步中多肽底物的量相同； 第三步，合成量子點 向第二步中的酶切產物中投入用於合成量子點的所述第一部分的第三步中的前驅體，並在與所述第一部分的第三步中相同的溫度以及時間條件下反應，結束後生成量子點，其中，投入的所述前驅體中金屬離子和非金屬離子的量與所述第一部分的第三步中前驅體中金屬離子和非金屬離子的量相同； 第四步，獲得被檢測的未知濃度的蛋白酶的活性 對第三步中生成的量子點進行螢光光譜測定，得到該量子點的螢光光譜波峰強度，再將該螢光光譜波峰強度與所述第一部分中得到的相關關係進行比對，最終獲得被檢測的未知濃度的蛋白酶活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:在所述第一部分的第二步與所述第二部分的第二步中，所述PH值採用pH緩衝溶液來調節。
3.根據權利要求2 所述的方法，其特徵在於:所述pH緩衝溶液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝溶液、碳酸氫氨緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液中的任意一種。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於:所述pH緩衝溶液中含有體積分數為ο.Γι%的血清。
全文摘要
一種新型高效的蛋白酶活性檢測方法，其特徵在於事先建立所需檢測的蛋白酶活性與對應產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度之間的相關關係；再根據所需檢測的蛋白酶的種類，設計一段含有該蛋白酶特異性切割位點的多肽底物；根據蛋白酶的最適溫度和最適pH，投入未知濃度的蛋白酶含量，對相同量的多肽底物進行酶切反應；向多肽底物的酶切產物中投入相同量的合成量子點的前驅體，並在適宜溫度下反應以生成量子點；反應結束後，測定合成的量子點的螢光光譜，然後將未知濃度的蛋白酶的酶切產物合成的量子點的螢光光譜波峰強度與所述相關關係進行比對，即可獲得該未知濃度的蛋白酶活性。本發明的方法方便快捷、靈敏度高、成本低，具有普遍適用性。
文檔編號G01N21/64GK103149185SQ20131004556
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者馬楠, 何學文 申請人:蘇州大學