鯽肝細胞原代培養方法

2023-05-19 17:10:46

專利名稱：鯽肝細胞原代培養方法
技術領域：
本發明涉及一種新的鯽肝細胞原代培養方法，屬於細胞生物學及生物技術學領域。
背景技術：
肝臟是機體的主要解毒器官，是許多毒物損傷的靶器官，同時也是體內化學物代謝的重要器官。體內複雜多變的環境對在體研究化學物引起肝臟損傷帶來一定的難度，原代培養細胞離體時間短，生物性狀尚未發生很大變化，在一定程度上能反應體內狀態，利用原代培養細胞生理生化及遺傳特性穩定性，研究化學物的毒性及肝細胞對毒物的應答及解毒機制。魚類是生活在水體中的脊椎動物，是用來檢測水體汙染物良好的生物指示體。原代培養的肝細胞較好地保留及維持了肝細胞的完整性和代謝活性，可真實地反應體內代謝情況。同時，肝細胞是外源化學物轉化及代謝的重要場所，也是外源物質造成化學和生物損傷的主要作用靶點。因此體外肝細胞在研究化學物生物轉化和毒性作用機制方面有著許多優勢，是研究體外毒性的理想模型。魚類培養的細胞作為實驗對象，有著活體魚無法比擬的優點(1)實驗材料成本低，細胞的維護不需要大量的換水、充氣和養殖設備；(2)重複性好，實驗條件可以精確控制，對細胞進行深入研究，無論在理論研究方面，還是在實際應用方面，都有著深遠意義。鯽是我國重要的食用魚，在我國水產市場佔有重要地位，以鯽魚作為實驗對象，不論從市場經濟上和科學研究都有強大的推動作用。肝實質由大量肝細胞為主組成，含間質少，肝細胞具有多種功能，代謝旺盛，在體外所需條件高。《中國比較醫學雜誌》，2006年14卷3期，在劍尾魚肝組織塊培養方法中，對組織塊消毒採用的是70%乙醇浸泡30s，實驗提及浸泡時間應嚴格控制在30S內，過長的時間會影響組織活性，降低細胞貼壁能力和存活率。相對於乙醇，洗必泰更適合用於組織塊的消毒。目前雖然有一些分離和鑑定肝細胞的方法，然而分離的肝細胞純度比較低，活性相對較低。本實驗對已有的細胞培養方法進行改良、借鑑，欲通過建立較高純度的肝細胞培養方法，為研究環境汙染對鯽肝細胞的毒害及致毒機制提供良好的實驗模型。我們在模型建立中發現，從組織分離到細胞獲取，中間有3個關鍵因素1.無菌培養；2.消化過程； 3.細胞生長的貼壁程度，這三個因素會決定細胞的生長狀態，影響著後續試驗的開展。

發明內容
本發明的目的是為了在鯽肝細胞原代培養方法中得到純度和活性相對較高的肝細胞。在對已有的細胞培養方法進行改良、借鑑的基礎上，本發明提供了一種鯽肝細胞原代培養方法，它包括以下工藝步驟
a、從健康的鯽中分離肝組織首先剪斷其鰓部脈弓，放血處死，用酒精擦拭鯽體表進行消毒，在超淨工作檯內解剖鯽，並取出肝組織，將分離的肝組織浸泡於葡萄糖洗必泰中IOmin ；
b、採用分步消化法對剪碎的肝組織進行消化獲得細胞團
將浸泡過葡萄糖洗必泰的組織用D-hank』S漂洗2次，剪碎成2_3mm3的組織塊；為了提高消化效果採用分步消化法消化組織
將剪碎的組織倒入離心管，置入28°C的水浴鍋內；首先加入組織量4-5倍體積的胰蛋白酶和EDTA消化，期間不停搖勻，15min消化完畢後，離心棄上清。加入3ml的D-hank』 s 同底部沉澱混勻後離心棄上清，將殘留的胰蛋白酶和EDTA去除，終止消化；
向所得沉澱組織中加3-4倍體積的II型膠原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴鍋，期間不停搖勻，每隔IOmin後取出3/4的上清液移入另一個離心管；在燒杯中添加新的II型膠原蛋白酶和CaCl2繼續消化組織塊；
30min消化完畢後，將收集的上清液細胞懸液通過200目孔徑不鏽鋼濾網，濾掉組織塊；離心棄上清，加入3ml的無血清培養基同底部沉澱混勻後離心棄上清，將殘留的II型膠原蛋白酶和CaCl2去除，終止消化；
c.對獲得的細胞團進行純化和培養
①使用紅細胞裂解液去除血細胞向離心管中加IOmlD-hank』 s，將沉澱細胞團用移液器吹打分散成單個細胞懸液，同時加Iml的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，上下顛倒6-8次， 靜置5min;離心倒棄紅色部分，留下管底白色細胞團；加D-hank』S同白色細胞團混勻，吹打並離心，溶解於3ml的D-hank』 s配成肝細胞懸液；
②加Percoll試劑對分離的肝細胞純化取肝細胞懸液懸浮於2.5倍體積的Percoll 分離液II上，離心棄上清；取沉澱細胞團用5ml的D-hank』 s重懸，槍頭吹打混勻；1500rpm， 5min離心，棄上清，得到純化過後的肝細胞；
其中，所述的 D-hank，s 溶液為將 8g NaCl,0. 4g KCl、0. 13g Na2HPO4 · 12Η20、0· 06g ΚΗ2Ρ04、0. 35g NaHCO3定容於IL純水中，高溫高壓滅菌，待溫度下降後於4°C保存；
其中所述的用Percoll分離液II配製為先用Percoll試劑原液和lOXD-hank』 s以 9:1的比例配置分離液I，用配置成的分離液I和lXD-hank』 s按2:3的體積比配置成所需的分離液II ；③將純化後的肝細胞用培養基再懸浮，其中所述的培養基為DMEM/F12培養基中加入20%新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。其中步驟a中所述的葡萄糖洗必泰的濃度優選為0. 1%。其中步驟b中所述的胰蛋白酶濃度優選為0. 25% ；EDTA的工作濃度優選為0. 02% ； 胰蛋白酶和EDTA的體積比優選為1:1。其中步驟b中所述的II型膠原蛋白酶的濃度優選為0. 1%，CaCl2的濃度優選是 3mmol/L0其中步驟c中所述的所述的培養方法的培養溫度為28°C。其中步驟c中所述的培養方法的培養基PH值為7-8。其中步驟b中所述的所述消化過程中離心速度為lOOOrmp，5min。其中步驟c中所述的紅細胞裂解液離心過程中離心轉速為1500rpm，5min。其中步驟c中所述的步驟c中的血清優選用新生牛血清；所述的用培養基為先用DMEM/F12培養基加入20%的新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ ml促肝細胞生長因子，8小時後換成DMEM/F12培養基加入10%的新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。其中，a步驟中選取組織時選擇靠近膽附近的肝組織，該處的肝組織較大，容易和胰臟分開，避免其他細胞的混淆。具體的解剖步驟是用鑷子翻開看到綠色的膽，在膽的周圍是大片的肝組織。用另一隻鑷子鑷取靠近膽附近的組織。將離體的肝組織浸泡在葡萄糖洗必泰中。其中步驟b中消化酶對組織的消化以及純化的工藝步驟優選為 (1)將葡萄糖洗必泰溶液倒掉。加入D-hank』 S漂洗2次。(2)用眼科剪將所得組織剪成大約2_3mm3的組織塊。28°C的水浴鍋中消化。(3)加入組織量4-5倍體積的胰蛋白酶和EDTA消化，期間不停搖勻。(4) 15min消化完畢後，IOOOrpm, 5min離心棄上清。(5)加3ml的D-hank』 s同底部沉澱混勻後1000rpm，5min離心，將殘留的胰蛋白酶和EDTA去除，終止消化。(6)在所得的沉澱組織中加入3-4倍體積的II型膠原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴鍋，期間不停搖勻。(7)每隔IOmin後取出3/4的上清液移入另一個離心管。(8)在燒杯中添加新的II型膠原蛋白酶和CaCl2繼續消化組織塊。(9)30min消化完畢後將收集的上清液細胞懸液通過200目孔徑不鏽鋼濾網，濾掉組織塊。(10) IOOOrpm, 5min離心棄上清，加3ml的無血清培養基混勻後離心，去除殘留的 II型膠原蛋白酶和CaCl2，終止消化。(11)在收集細胞的離心管中加IOml的D-hank』 s，以及Iml的紅細胞裂解液混勻， 上下顛倒6-8次後靜置5min。(12) 1500rpm,5min離心倒棄紅色部分，留下管底白色細胞團；加D-hank』 s溶液同白色細胞團混勻後1500rpm，5min離心，去除殘留的紅細胞裂解液。(13)如果第一次血細胞分離不徹底，可以重複步驟(11) (12)。(14)用Percoll原液與10XD-hank' s以9:1的比例配置成分離液I。(15)用配置成的分離液I和lXD-hank』 s按2:3的體積比配成分離液II。(16)將紅細胞裂解液處理後管底的白色細胞團溶解於3ml的D-hank』 s，加入2. 5 倍體積即7. 5ml的分離液II。(17)4500rpm,5min離心棄上清液。取沉澱細胞團用5ml的D-hank，s重懸，槍頭吹打混勻。1500rpm, 5min離心。(18)培養基(20%新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子的DMEM/F12培養基)再懸浮，計數細胞密度，使其密度達到1 X IO6個/ml。(19)將肝細胞在多孔培養板或培養瓶中培養，所用的培養基配方為先用DMEM/ F12培養基加入20%的新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。於28°C的0)2培養箱中培養。(20)過8小時後，換成血清含量低的培養基培養。所述培養基為DMEM/F12培養基加入10%的新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。(21)其中，上述分離液I的pH為7. 6，滲透壓為335m0sm。(21)其中，消化期間需要經常混勻，IOmin後將3/4的上清液移入另一個離心管。 在燒杯中添加新的消化液繼續消化組織塊。總共消化30min。本發明鯽肝細胞原代培養的方法採用實驗動物鯽，成本低，來源廣。細胞培養操作及環境要求高，為了儘可能減少外部帶來的汙染，保證無菌操作，在本發明中使用葡萄糖洗必泰浸泡離體的肝組織，取得了良好效果，實施期間未發現細胞受汙染。當然，葡萄糖洗必泰不是無菌培養的決定因素，但卻可以在操作中減少細菌汙染的可能，加上它的毒性對細胞存活及生長沒有不利的影響，適於對組織的消毒，實驗中我們還發現，洗必泰浸泡過的組織塊收集細胞後血細胞數量少於未浸泡的肝組織，造成這種現象的原因尚不清楚，但效果是肯定的。所以增加該部分的操作不僅可以減少汙染，還可以消除一部分血細胞。0. 25%胰蛋白酶中加入0. 02%EDTA能夠螯合Ca2+和Mg2+，能夠有利於提高胰蛋白酶的消化效果。因為加入EDTA，所以要用D-hank，s終止消化。離心去除胰蛋白酶和EDTA 後，加入II型膠原蛋白酶和CaCl2, Ca2+能夠有效地提高II型膠原蛋白酶的消化能力，並用無血清培養基終止消化。在消化過的細胞懸液中加入紅細胞裂解液能夠有效的降低分離細胞團中的血細胞含量。使用紅細胞裂解液純化細胞同未使用的相比血細胞數量明顯減少。Percoll細胞分離液作為純化介質，是一種新型的密度梯度分離液，由聚乙醯胺吡咯烷酮的矽膠顆粒構成，顆粒大小不一，通過離心後可形成的不連續密度梯度，將不同密度的細胞分離開，從而達到細胞純化效果。雖然使用Percoll試劑能夠降低肝細胞的數量，但是由於雜質細胞或者血細胞以及細胞碎片對細胞的培養有很大的影響，因此用Percoll試劑對肝細胞進行純化是必要的一步。使用Percoll純化鯽肝細胞，細胞存活率和純度上顯著高於非純化組，在肝細胞功能以及貼壁率上純化組具有明顯優勢，隨著時間的增加，這種優勢越發明顯。本發明同時對比了新生牛血清以及胎牛血清對細胞培養的影響，結果發現，培養 24h後，新生牛血清組肝細胞貼壁較胎牛血清組多，所以培養時選擇新生牛血清作為培養基血清成分。綜上所述，本發明方法原料來自於常見水生實驗動物鯽，用葡萄糖洗必泰浸泡離體組織塊，對離體的組織塊進行消毒，減少汙染。利用分步消化法對組織進行消化，使用紅細胞裂解液降低細胞中血細胞的含量，並用Percoll梯度離心，純化肝細胞。聯合取材、分步消化法、紅細胞裂解液以及Percoll三種方式純化肝細胞，本發明得到的肝細胞數量充足，且存活率達90%以上，符合原代培養的要求。


圖1剛分離的細胞(放大倍數10X20)。圖2培養12h的細胞(放大倍數10X40)。圖3培養48h的細胞(放大倍數IOX 10)。
具體實施例方式實施例1鯽肝細胞原代培養方法 1主要材料配方及來源
1)無血清培養基DMEM/F12培養基加入100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml 促肝細胞生長因子。2)培養基配方為在DMEM/F12培養基(上海旭飛生物有限公司)中加入新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。3)消化酶0.25%的胰蛋白酶(上海旭飛生物有限公司)，0. 02%的EDTA以及 0. 1% II型膠原蛋白酶(上海旭飛生物有限公司)，3mm0l/LCaCl2。4)紅細胞裂解液購買於上海旭飛生物有限公司。5) Percoll分離液用Percoll原液(上海旭飛生物有限公司)與lOXD-hank，s 以9:1的比例配置成分離液I ；用配置成的分離液I和lXD-hank』 s按2:3的體積比配成分離液II。6) D-hank，s 溶液將 8g NaCl,0. 4g KCl、0. 13g Na2HPO4 · 12Η20、0· 06g ΚΗ2Ρ04、 0. 35g NaHCO3定容於IL純水中，高溫高壓滅菌，待溫度下降後於4°C保存。7)0. 1% II型膠原蛋白酶準確稱取II型膠原蛋白酶粉末0. Ig溶於IOOmL的 D-hank』S中，4°C過夜混勻，調節pH值為7.4左右。用注射濾器過濾除菌，小瓶分裝(離心管)於-20°C凍存。8 )實驗動物健康鯽3隻，體重300g。實驗操作遵照國家動物保護法執行。2操作步驟
1)採取適當的解剖方式，從健康的鯽中分離出肝組織。試驗魚暫養3天，取健康鯽，首先剪斷其鰓部脈弓，放血5min，用酒精擦拭魚體表消毒，在超淨工作檯內解剖鯽，並取肝組織，為了減少細菌的汙染，用葡萄糖洗必泰(氯苯雙胍己烷)浸泡離體組織lOmin。用D-hank』 s漂洗2次至無血色。2)用眼科剪將組織剪成2_3mm3的碎塊，置於燒杯中。3)為了提高消化效果採用分步消化的方法消化組織。將剪碎的組織倒入離心管， 置入28°C的水浴鍋內。首先加入組織量4-5倍體積的胰蛋白酶和EDTA消化，期間不停搖勻，15min消化完畢後。4)離心去上清，加3ml的D-hank』 s同組織混勻後lOOOrpm，5min離心，去除殘留的胰蛋白酶和EDTA，終止消化。5)向所得的沉澱組織中加3-4倍體積的II型膠原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴鍋，期間不停搖勻。6)每隔IOmin後取出3/4的上清液移入另一個離心管。在燒杯中添加新的II型膠原蛋白酶和CaCl2繼續消化組織塊。7) 30min消化完畢後將收集的上清液細胞懸液通過200目孔徑不鏽鋼濾網，濾掉組織塊。8)離心棄上清，加3ml的無血清培養基同底部沉澱細胞團混勻後lOOOrpm，5min離心，去除殘留的II型膠原蛋白酶和CaCl2，終止消化。9)棄上清，向所得沉澱細胞中加IOml的D-hank』 s重懸細胞。然後加Iml的紅細胞裂解液，混勻後，上下顛倒6-8次，靜置5min。1500rpm，5min離心，棄上清和紅色細胞部分，留下白色的細胞團。10)用3ml的D-hank』 s重懸細胞團，同時加入7. 5ml的Percoll分離液II。 4500rpm，5min離心。棄上清液，取細胞團。11)取細胞團用5ml的D-hank』 s重懸，槍頭吹打混勻。1500rpm，5min離心。得到純化過後的細胞。12)培養基(20%新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子的DMEM/F12培養基)再懸浮，計數細胞密度，使其密度達到1 X IO6個/ml。13)加入含20%新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子的DMEM/F12培養基，28°C置於CO2培養箱中。8小時後換成含10%新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子的DMEM/F12培養基。用本發明所提供的方法，獲得了純度高，數量足，生長狀態好的細胞。方法重複三次以上，結果近似，重複率高。測試例
1、活細胞計數用臺酚藍進行活細胞計數。臺酚藍計數細胞從組織消化，經過多次洗滌及離心，會發生一定的損傷，通過細胞分離液的分離可以將完整細胞同破碎細胞，血細胞分離開，純化的細胞經臺盼藍染色，活細胞數目達90%以上，滿足原代培養的要求。2、形態學鑑定在OLYMPUS倒置顯微鏡下觀察所得細胞的外部形態特徵。形態學觀察光鏡下可見剛分離的肝細胞呈圓形或類圓形(圖1)，細胞呈單個分散狀態，界限清晰，核仁清晰可見，細胞透亮。培養12h後(圖2)，細胞形態仍然呈圓形，排列緊密。開始出現貼壁、伸展現象。培養48h後(圖3)，細胞緊密相連，形成島狀連接。表明細胞生長情況良好。
權利要求
1.一種鯽肝細胞原代培養方法，它包括以下工藝步驟a.從健康的鯽中分離肝組織首先剪斷鯽鰓部脈弓，放血處死，用酒精擦拭鯽體表進行消毒，在超淨工作檯內解剖鯽，並取出肝組織，將分離的肝組織浸泡於葡萄糖洗必泰中IOmin ；b.採用分步消化法對剪碎的肝組織進行消化獲得細胞團將浸泡過葡萄糖洗必泰的組織用D-hank』S漂洗2次，剪碎成2_3mm3的組織塊；為了提高消化效果採用分步消化法消化組織將剪碎的組織倒入離心管，置入28°C的水浴鍋內；首先加入組織量4-5倍體積的胰蛋白酶和EDTA消化，期間不停搖勻，15min消化完畢後，離心棄上清；加入3ml的D-hank』 s同底部沉澱混勻後離心棄上清，將殘留的胰蛋白酶和EDTA去除，終止消化；向所得沉澱組織中加3-4倍體積的II型膠原蛋白酶和CaCl2置入28°C水浴鍋，期間不停搖勻，每隔IOmin後取出3/4的上清液移入另一個離心管；在燒杯中添加新的II型膠原蛋白酶和CaCl2繼續消化組織塊；30min消化完畢後，將收集的上清液細胞懸液通過200目孔徑不鏽鋼濾網，濾掉組織塊；離心棄上清，加入3ml的無血清培養基同底部沉澱混勻後離心棄上清，將殘留的II型膠原蛋白酶和CaCl2去除，終止消化；c.對獲得的細胞團進行純化和培養①使用紅細胞裂解液去除血細胞向離心管中加IOmlD-hank』 s，將沉澱細胞團用移液器吹打分散成單個細胞懸液，同時加Iml的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，上下顛倒6-8次， 靜置5min;離心倒棄紅色部分，留下管底白色細胞團；加D-hank』S同白色細胞團混勻，吹打並離心，溶解於3ml的D-hank』 s配成肝細胞懸液；②加Percoll試劑對分離的肝細胞純化取肝細胞懸液懸浮於2.5倍體積的Percoll 分離液II上，離心棄上清；取沉澱細胞團用5ml的D-hank』 s重懸，槍頭吹打混勻；1500rpm， 5min離心，棄上清，得到純化過後的肝細胞；其中，所述的 D-hank，s 溶液為將 8g NaCl,0. 4g KC1、0. 13g Na2HPO4 · 12Η20、0· 06g KH2P04、0. 35g NaHCO3定容於IL純水中，高溫高壓滅菌，待溫度下降後於4°C保存；其中所述的用Percoll分離液II配製為先用Percoll試劑原液和lOXD-hank』 s以 9:1的比例配置分離液I，用配置成的分離液I和lXD-hank』 s按2:3的體積比配置成所需的分離液II ；③將純化後的肝細胞用培養基再懸浮，其中所述的培養基為DMEM/F12培養基中加入20%新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。
2.根據權利要求1所述的培養方法，葡萄糖洗必泰的濃度為0.1%。
3.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於胰蛋白酶濃度為0.25%，EDTA的工作濃度為0. 02%，胰蛋白酶和EDTA的體積比為1:1。
4.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於膠原酶的濃度為0.1%，CaCl2的濃度是 3mmol/L0
5.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於所述的培養溫度為28°C。
6.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於所述的培養基PH為7-8。
7.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，b步驟所述消化過程中離心速度為IOOOrmp，5min。
8.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述的步驟c中加紅細胞裂解液離心過程中離心轉速為1500rpm，5min。
9.根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述的步驟c中的血清選用新生牛血清；所述的用培養基為先用DMEM/F12培養基加入20%的新生牛血清、100U/ml青黴素、 100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子，8小時後換成DMEM/F12培養基加入10% 的新生牛血清、100U/ml青黴素、100U/ml的鏈黴素以及20ug/ml促肝細胞生長因子。
全文摘要
本發明提供了一種新的鯽肝細胞原代培養方法。它主要包括以下步驟a、從鯽中分離出肝組織；b、採用分步消化法對剪碎的肝組織進行消化獲得細胞團；c、對獲得的細胞團進行純化和培養。本發明方法原料來自於常見水生實驗動物鯽，用葡萄糖洗必泰(氯苯雙胍己烷)浸泡離體組織塊，對離體的組織塊進行消毒，減少汙染。利用分步消化法對組織進行消化，使用紅細胞裂解液降低細胞中血細胞的含量，並用Percoll梯度離心，純化肝細胞。聯合取材、分步消化法、紅細胞裂解液以及Percoll四種方式純化肝細胞，本發明得到的肝細胞數量充足，且存活率達90%以上，符合原代培養的要求。
文檔編號C12N5/071GK102304492SQ201110248769
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月27日 優先權日2011年8月27日
發明者吳婷婷, 孫楊, 郭敏, 魏華 申請人:上海海洋大學