通過同步化植物細胞培養的次級代謝產物批量生產的穩定化方法

2023-05-19 19:58:51 1

專利名稱：：通過同步化植物細胞培養的次級代謝產物批量生產的穩定化方法
技術領域：
：植物在我們生活中的應用越來越重要了，它不僅是我們食物的供應者，而且還是許多化學物質的來源，如藥物、香精、顏料、農業化學藥品和染料等都來源於植物。由植物生產的生物活性物質大部分是次級代謝產物。因為絕大多數次級代謝產物用作生理活性物質，所以人們對這些次級代謝產物具有很大的興趣，諸如生物鹼、過敏原、胺基酸、蒽醌、白血病抑制劑、殺菌劑、腫瘤抑制劑、抗病毒試劑、酶、類黃酮、殺蟲劑、鴉片劑、香料、色素、維生素和多糖等。根據Zhong(2002)報導，大約存在100，000種次級代謝產物已被人們所知；在實踐使用的藥物中有25%以上來源於植物。每年都有新發現的次級代謝產物產生。在獲得這些代謝產物的方法中仍然存在許多問題，諸如，雖然近年來有機化學飛速發展但是仍難於化學合成這些代謝產物，因過度開採和汙染環境造成對自然界的破壞和因季節、地區和氣候等生產條件的變化代謝產物的成分發生改變並造成生產成本增加。因此，通過體外培養技術生產次級代謝產物的方法正處在積極研製階段，這種體外培養技術即使在很小的空間內也可以適當控制外部環境條件進行大規模生產。
背景技術：
：根據韓國專利0130100，通過植物細胞培養生產生物活性物質比直接從植物中提取這些物質有更多的優點。植物細胞培養不僅不受環境影響而且可以解決生態破壞的問題，所以這種方法被認為是能夠進行連續生產的最佳方法。但是，Nail和Roberts(2004)指出用植物細胞培養生產次級代謝產物生長速率慢且產率較低。為了解決這一問題，Zhong(2002)進行了優化培養基、培養條件、工藝和誘導條件等從而提高產率的研究)。在國際專利W093/17121中，各種培養基被用於培養多種紫杉以便增加細胞生長速率和紫杉醇(paclitaxel)產率。實驗的結果指出了生產大量紫杉醇的誘導條件。儘管這種方法提高了有價值的次級代謝產物的生產，然而對於從紫杉中生產紫杉醇或從許多植物中生產有價值的代謝物質來說可變性仍然是主要問題。只有當在長期培養過程中穩定地保持細胞快速生長和代謝產物的高產量時，通過大規模的植物細胞培養來生產次級代謝產物才有商業化的可能。可產生獨特代謝產物的細胞系的性能不穩定，這種不穩定在繼代培養中導致細胞系喪失它們最初的產率；還不能太多的說成功和失敗取決於我們如何克服這些問題。在植物細胞培養中，儘管細胞來源於一種植物，但每個細胞系代謝產物的產率不同且不穩定。因此，建立具有高產率和遺傳穩定性的細胞系比任何其它事情都重要。來自單細胞和多細胞的細胞系來自單細胞植物細胞系比來自多細胞的植物細胞系具有較低的可變性；這導致細胞系的產率來自單細胞高於來自多細胞的。在在先發明中，莖、根、種子、針葉和葉子被用作最好的外植體來誘導細胞系的產生。這些莖、根、種子、針葉和葉子是由不同功能和形態的細胞構成的組織。來自這些組織中的愈傷組織細胞系不止一種。因此，在試圖降低來自由多細胞構成的組織的愈傷組織的變種產率方面存在一些限制。細胞凝集植物細胞培養的一個明顯特徵是細胞凝集。根據專利0364478記載，植物細胞的直徑為30-300pm，大約比動物細胞大30倍。由於植物細胞具有粘附在一起的天然趨勢，所以不可能得到僅僅由分散的單個細胞構成的懸浮液。細胞凝集的比例和尺寸隨植物種類和培養物生長的培養基變化而變化。Nail和Roberts指出，細胞凝集導致細胞內外局部環境的不同，這導致了培養物的異質性並最終可導致生長和代謝的變化。懸浮培養的目的是得到純的單個細胞。為了實現該目標，可以使用過濾、離析和通過酶的原生質培養方法。但是，過濾和離析並不能獲得完全純化的單個細胞。去除細胞壁的原生質培養技術是產生單細胞的最可靠方法，但是用於培養原生質的酶可引起細胞壁損傷或破損，最終導致細胞生理系統的變化。此外，疏水的次級代謝產物諸如紫杉醇可儲存在細胞壁中，使細胞壁的變化與產率之間具有意義深遠的關係。而且，細胞凝集已經是對細胞生長的計數精確測定和對獨立細胞的生物化學分析的主要障礙。根據Nail和Roberts(2004)報導，如果單個細胞培養成為可能，將會容易地獲得關於培養中細胞單位活動的更快的信息，諸如次級代謝產物中的生物合成、儲存和降解等信息。去分化由於無性系變異，作為愈傷組織的去分化細胞系在次級代謝方面有很大的可變性。即便微環境略微不同，來自永久組織諸如由具有不同功能和形態的細胞構成的葉片、莖、根和種子的愈傷組織也通常顯示戲劇性的變化，因為其為通過去分化形成的次級分裂組織。由於這種敏感性，Hirasuna等(1996)的調查證實了細胞培養的條件，尤其是初始細胞密度，繼代培養間隔和溫度，並儘可能精確地保持它們。按比例擴大為了通過植物細胞培養生產次級代謝產物以便商業化，按比例擴大是必須的。在許多專利和已出版的文章報導了有關通過實驗室細胞培養成功產生代謝產物之後，生物反應器已經被用於大規模生產。根據專利0290004記載，通過生物反應器進行大規模生產的培養環境條件解決了在實驗室生產代謝產物生長速率慢和產率低的問題。當生物反應器被用於大規模生產時，生長速率、產率和代謝產物的變化變成了通過細胞培養生產生物活性物質商業化的問題。在植物細胞培養的按比例擴大中，通過外部動力接收空氣的生物反應器或者通過混合和通風率的具有葉輪的生物反應器是優選的。但是，在生物反應器中細胞發育能力突然下降是因為植物細胞對於切變很脆弱。因此，降低切變的方法成為了必須要解決的問題。植物細胞的切變敏感性的原因在於其較大的尺寸、剛性細胞壁、凝集和廣泛形成的液泡(Yokoi等，1993)。為了解決生物反應器中的這些問題，過去通過控制其攪拌速度並修改葉輪類型，從而研究了切變生成較低的生物反應器。但是，這仍然沒有得到積極的結果，因為細胞系不能克服微環境差別的影響。低溫儲藏低溫儲藏通過在極低溫度下停止細胞的絕大部分新陳代謝來長期保持細胞。這意味著在低溫儲藏以後，細胞的遺傳、特性和生物合成的變化都處於停止狀態。使用低溫儲藏可消除因為汙染造成的細胞損失並且可最小化連續細胞系中的遺傳變異。在環鳥苷酸(cGMP)中，為了穩定供應原材料，必須強制保證細胞系的長期保藏。通常培養的動物細胞可低溫儲藏許多年，但用類似的低溫儲藏技術保藏培養的植物細胞卻具有很大的挑戰性。培養的植物細胞是不均質的並顯示出生理和形態上的差異。因此，植物懸浮細胞要求許多程序才能低溫儲藏，不充分的低溫儲藏可引起變異。調節因子Kim等(2000)證明如果把具有分裂活性培養物的培養基加入到喪失細胞分裂能力的培養物中，可刺激細胞分裂。在通過玫瑰花懸浮培養生產花青素時，當將一些草莓懸浮培養物的培養基加入到玫瑰花懸浮培養物中時花青素產率會增加。在該方式中，從培養的細胞中產生和分泌刺激細胞生長的或者次級代謝產物產生的因子被稱為調節因子。然而，這些調節因子並沒有被具體地鑑別，僅僅理解為用於細胞生長和代謝產物產生的化學信號。而且，很少有報導認為它們是有效物質，諸如被認為是調節因子的磷酸鹽和鈣調素(calmodulin)等。調節因子可通過條件培養基或者輔助細胞供應。灌流培養法在細胞培養方法中，有一種在開始時一起接種細胞和培養基並且不再添加養分的成批培養法。另有一種連續培養法，其在培養過程中，當回收用過的培養基中的代謝產物的同時以一致的速度補充新的培養基以防止養分損耗。由於產率較低，成批培養法很難商業化。在連續培養方法中，近年來灌流培養逐漸引起了注意。在灌流培養中，細胞保持在生物反應器中，當回收用過的培養基中的代謝產物的同時補充新的培養基。根據Zhang等(2000)報導，誘導是在細胞培養中促進次級代謝產物產生的最有效方式之一。誘導雖然促進了次級代謝產物的合成，但其抑制了細胞生長和降低了細胞發育能力。因此，通過誘導的次級代謝產物合成僅僅可被保持很短一段時間，且數量非常有限。如同Wang等(2001)所提出的那樣，灌流培養法是一種能使這些誘導產生的負面效果最小化和使產率最大化的策略。Wang等(2001)，Wu和Lin(2003)報導了如下內容。通過誘導產生的次級代謝產物被存儲在細胞內部(液泡或者細胞壁中)或者被釋放到細胞之外(培養基中)。在培養過程中，從細胞中釋放次級代謝產物並將其從培養基中除去可使純化更容易並可減小生物合成和降解的反饋抑制以及產物轉化。因此，通過回收用過的培養基並提供新的培養基，內外代謝產物的分泌物可延長細胞的發育能力和生物合成。並且這種方法可顯著地增加產率。由於細胞系的不同，次級代謝產物的儲存和分泌也有非常大的差異。紫杉培養基細胞系(Wickremesinhe和Arteca，1994)沒有分泌任何物質。因此，需要建立具有顯著分泌能力的細胞系。前形成層或形成層培養前形成層或形成層是位於植物側面上的側生分生組織。在裸子植物和木本雙子葉植物中，由於分生組織的連續不斷的增長造成了增殖性生長；結果，存在具有11,000年以上生長輪的巨大植物。在遺傳學中，前形成層或形成層可被分為初級分生組織和次級分生組織。初級分生組織以種子萌發後在植物生長過程中胚胎發生和生長過程中形成的分生組織為代表。次級分生組織以由植物永久組織去分化形成的分生組織為代表。形成層是前形成層的連續性分生而沒有永久組織介入的初級分生組織。初級分生組織的生長是不確定的，如果條件適合還可繼續生長。因此，前形成層或形成層培養已經被用於細胞的快速大量繁殖中。在前述研究中，形成層外植體製備如下在樹皮被剝去後，樹幹上切有兩個約lmm深間隔為5mm的縱向切口以便到達木質部。這些外植體被稱為'形成層'，其由部分韌皮部、形成層和小片木質部構成(Jouria等，1998)。合理地說，通過上述方法誘導的細胞不僅僅是形成層來源，而是多種組織的來源，其在解剖學上可嚴格地被劃分為諸如韌皮部、形成層和木質部。因此，可指出上述方法不是從構成樹幹的各種組織中僅僅分離形成層的理想技術。也因此需要發明從樹幹的各種組織僅分離前形成層或形成層的創造性方法
發明內容技術問題本發明的目的是產生通過僅僅從短枝和樹幹分離和培養前形成層或形成層的生產單細胞克隆的方法。為了使其更具體，本發明的目標是解決植物細胞培養的變化，並通過結合物理細胞分離法和生理化學細胞分離法，利用解剖刀分離前述純的前形成層或形成層，創造植物生物學活性物質的穩定生產方法。本發明的另一目的是僅僅分離並培養來自紫杉短枝的前形成層或形成層和創造紫杉醇的生產方法。技術方案為了實現上述目標，本發明通過分離並培養來自紫杉短枝或者樹幹的前形成層或形成層而得到單細胞克隆並提供穩定的細胞增殖和紫杉醇的生產方法。特別是，通過得到單細胞克隆的穩定的細胞增殖和生產紫杉醇的方法如下1)製備植物材料並分離前形成層或形成層；2)從分離的前形成層或形成層誘導單細胞克隆；3)建立長期培養；4)建立細胞懸浮培養物；5)按比例擴大；6)通過誘導子、調節因子和灌流培養進行紫杉醇生產；7)用低溫儲藏建立細胞庫。有益效果根據本發明的方法，能夠培養單細胞克隆，單細胞克隆不通過從木本植物短枝或樹幹的各種組織僅僅精確分離前形成層或形成層的去分化而具有初級分生組織的連續分生性。由於在長期培養過程中細胞生長率和生長模式變化的變少，本發明的細胞系能夠保持生物活性物質的穩定生產。其對於商業水平大規模生產來說同樣是理想的，因為與來自於前述技術的細胞系相比，由於凝集和多液泡的減少，其對生物反應器中切變的敏感性降低。通過向細胞系中添加調節因子可剌激代謝產物的活化，並且通過灌流培養細胞將相當大量的產物釋放到細胞外培養基中可延長細胞活力和生物合成性能。由於在低溫儲藏之後這種細胞系的均質性和分裂能力能夠很好地恢復，所以設計了用低溫儲藏建立細胞庫。本發明確認了培養物的均質性和次級代謝產物的變異之間具有密切關係。由於本發明的方法控制並降低了不同生物活性物質產生的變異性，所以本發明的方法可用於商業化的戰略。圖l顯示從前形成層或形成層誘導單細胞克隆過程中被分離的部分。圖2顯示來自前形成層或形成層、胚芽和針葉的三種不同細胞培養物的總生物產量表達得生長率。圖3顯示來自兩種不同組織(胚芽或針葉和形成層)的培養物的細胞凝集圖像。圖4顯示紫杉懸浮培養過程中紫杉醇產生方面的誘導效果。圖5是紫杉懸浮培養過程中紫杉醇產生方面的調節因子的效果。具體實施例方式下面將解釋本發明的實施例。從前形成層或形成層誘導和增殖單細胞克隆的方法不僅在紫杉醇生產系統中被利用，而且還可在所有植物次級代謝產物生產系統中利用。下列實施例僅作為說明，而不是對本發明的限制。植物材料的製備和前形成層或形成層的分離收集紫杉樹的種子、針葉、短枝。收集完後，將它們立即沉澱在100mg/L抗氧化劑和抗壞血酸溶液(L-抗壞血酸，DUCHEFA，Netherlands)中並轉移和保藏。考慮材料的形態和生理特性，對它們的表面進行滅菌。①種子用70%的酒精對種子滅菌一分鐘，之後將它們浸入到1%的次氯酸鈉溶液中48小時，隨後用無菌水洗滌3到4次。接著，在0.5%的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，DUCHEFA，Netherlands)和50mg/L抗壞血酸(L-抗壞血酸，DUCHEFA，Netherlands)以及70mg/L擰檬酸(DUCHEFA，Netherlands)溶液中，胚芽從種子中分離並在愈傷組織誘導培養基中培養。②針葉和短枝用含有1%苯菌靈(DongbuHannongChemical,Korea)+1%百菌清(DongbuHannongChemical，Korea)+1%硫酸鏈黴素(DUCHEFA，TheNetherlands)+0.1%頭孢噻月虧鈉(DUCHEFA，TheNetherlands)的溶液處理24小時之後,將針葉和短枝用自來水漂洗30秒以除去殘餘化學物質和酚化合物。將它們按順序用70%的酒精(DCChemical,Korea)滅菌1分鐘、30%過氧化氫(LGChemical,Korea)滅菌15分鐘，1%CLOROX溶液滅菌15分鐘、3%CLOROX溶液滅菌5分鐘後，將它們用蒸餾水洗滌3到4次。為了防止氧化，將針葉的兩端在0.5y。PVP，50mg/L抗壞血酸和70mg/L擰檬酸溶液中切割並在愈傷組織誘導培養基上培養。③從短枝或莖製備前形成層或形成層通過用鉗子保持短枝或莖的中心區的木質部，剝去皮層、表皮組織和包括前形成層或形成層的韌皮部。將剝下的含有前形成層或形成層的組織放置在培養基上；允許前形成層或形成層與培養基表面接觸。從分離的前形成層或形成層誘導單細胞克隆從培養的第4到7天之後觀察前形成層或形成層的細胞分裂，培養的第15天愈傷組織開始從皮層、表皮組織和韌皮部的上部即前形成層或形成層中形成。在培養的第30天，前形成層或形成層開始從包含韌皮部和皮層以及表皮的上層組織中分離；在這兩層完全自然分離之後，分別將它們在不同的培養板上培養(圖1)。為了誘導細胞和愈傷組織，可使用植物細胞和組織培養的公知培養基例如mB5(改性的Gamberg，sB5培養基)，MS(Murashige&Skoog培養基)，WPM(Lloyed&McCown)，SM(schenk&Hildebrand培養基)，LP(Quoirin&Lepiovre)。所有這些培養基都可以應用。在需要時，可添加各種添加劑，並且根據需要培養基的成分可減少或除去。在這些培養基中，最合適的培養基是mB5。表l列出了mB5的成分。表l紅豆杉中細胞系誘導和維持培養基tableseeoriginaldocumentpage13L-精氨酸175甘氨酸75脯氨酸115激素a-醋酸萘2蔗糖10,000活性炭100Gelrite2,000在25士rc黑暗環境下，培養物在添加植物生長調節因子、植物激素(l-3mg/L)的培養基中生長。前形成層或形成層由均質細胞構成，所以其細胞以均勻方式分裂並且以板的形式增殖。另一方面，韌皮部、皮層及表皮的組織因為細胞組成不同造成細胞分裂後產生不同的細胞，從而表皮層以不規則的形式增殖。於是，前形成層或形成層和含有韌皮部、皮層及表皮的組織之間自動分層(圖1)。前形成層或形成層是均質的，含有韌皮部、皮層及表皮的組織是異質的，所以上下層之間的自動裂層視為不同分裂速率造成的結果。培養的第15天之後，在由異質細胞構成的胚芽和針葉的外植體上經過分化形成愈傷組織，並且由於各種細胞的分裂速率不同，這些愈傷組織以不規則的形式增殖，就像包含韌皮部、皮層以及表皮的組織那樣(圖l)。<實施例3〉長期培養的建立在這些愈傷組織中，白色的、易碎的愈傷組織具有良好生長率，這些部分每21天在新的培養基上繼代培養。來源於胚芽和針葉的培養物的生長速率非常不穩定，通常顯示變褐的趨勢。相反，來源於前形成層或形成層的培養物的生長速度很快並且培養物沒有顏色變化。因此，這樣的培養物能夠選出穩定的細胞。在培養六個月之後，絕大多數來源於胚芽和針葉的培養物為黃色或者淺褐色並形成凝集。來源於前形成層或形成層的培養物為白-黃色並以單個細胞或者小的細胞蔟形式存在。轉變成褐色並凝集的形成使培養物的生長速率降低，培養物由於它們所分泌的酚類化學物質存在而逐漸死亡。本發明表明維持和大量增殖來源於胚芽和針葉的培養物在6個月後就變得很困難；但對於來源於前形成層或形成層的培養物來說，穩定維持20個月以後，細胞生長速率、生長模式和凝集水平仍沒有任何變化(圖2)。換言之，生長模式方面的變化，取決於初始植物材料均質性和異質性。<實施例4〉細胞懸浮培養物的建立來源於胚芽和針葉以及來源於前形成層或形成層的培養物分別在含有液體培養基的長頸瓶中培養(表2)。表2紅豆杉中的懸浮培養基tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16以兩周為繼代間隔，培養物在25士rC黑暗的100rpm搖床上培養，這樣培養物可以連續保持較高活力即指數生長期。測定作為細胞產率變化的主要原因的凝集水平。用生物顯微鏡(CX31,Olympus,Japan)測定細胞凝集量。上述實驗結果見表3。表3紫杉長期培養的細胞凝集類型tableseeoriginaldocumentpage16大細胞凝集尺寸大於1.5xl0^im;中等細胞凝集lxl03jnm;小細胞凝集4xl0^mK尺寸〈xl3^im在來自胚芽和針葉的培養物懸浮液中，大約60%的細胞凝集尺寸超過1.5mm，但在來自前形成層或形成層的培養物懸浮液中，90%的細胞都以單個細胞形式培養。按比例擴大在25±rc的黑暗環境下，來自胚芽和針葉以及來自前形成層或形成層的培養物在3L氣升式生物反應器(Sung-WonSdTech，Korea)中培養。與在長頸瓶中培養物相比，來自胚芽和針葉的培養物的細胞大小和形狀有很大變化。凝集細胞的直徑可大到2-3mm，從而抑制了生物反應器內物質的流動性增加了未混合區域。由粘附在生物反應器的內壁上的細胞為準形成生長環。因為不能提供充分培養基，生長環中心的細胞在20天後死亡。死亡的細胞會分泌毒性物質並且這些毒性物質會降低生物反應器中所有細胞的活力。相反，來自前形成層或形成層培養物細胞的較少凝集會引起生物反應器中空氣的平緩循環；因此其能夠將送氣量從每分鐘200ml降低到每分鐘150ml，在培養基表面上形成的氣泡的量也因此極大地減少。來自胚芽和針葉的培養物在長頸瓶中的倍增時間為12天，但在生物反應器中延長為21天。這是因為由於細胞凝集和剛性細胞壁對切變敏感而導致了生長環形成和細胞活力的快速下降。來自前形成層或形成層的培養物的倍增時間為4到5天，並且在長頸瓶和生物反應器中沒有差別，甚至倍增時間在生物反應器中變短(表4)。來自前形成層或形成層的培養物在生物反應器中形成非常小的生長環，並且生長環很容易通過以簡單的刺激攪拌培養基而溶解。此外，由於細胞凝集較少和更多的液泡，對切變敏感性較低，因此細胞活力沒有下降。表4東北紅豆杉(7:cMpWato)細胞培養物在長頸瓶和生物反應器中倍tableseeoriginaldocumentpage17誘導子誘導子能夠控制植物細胞中的分子信號，因此對於增加次級代謝物的產率有廣泛的應用。在用茉莉酮酸甲酯誘導子和其它IO種誘導子處理之後，我們觀察到茉莉酮酸甲酯對紫杉醇生產具有積極影響。通過結合茉莉酮酸甲酯與其它誘導子能夠得到相當高的代謝物產率。特別是，使用茉莉酮酸甲酯、殼聚糖和苯丙氨酸進行處理對於紫杉醇生產非常有效(圖4)。調節因子當細胞正在生長或者停止生長時會產生來源於次級代謝的物質。因此，兩階段培養對於生產代謝產物是合適的，例如紫杉醇的細胞生長階段和代謝產物產生階段是分開的，這樣非常適合生產代謝產物。在第一階段，通過優化細胞生長使細胞最大化增殖，在第二階段，通過改變培養條件來優化產生的代謝產物。與具有低產率的細胞系相比，具有高次級代謝產物產率的細胞系長得更慢但死得更快。因此，大量增殖是困難的並代謝產物的大量生產是不可能的。在本發明中，沒有將具有低增殖和高產率能力的細胞系用於大規模增殖，而將它們用作有助於次級代謝產物產生的調節因子的輔助細胞。在加入輔助細胞之後我們觀察到產生了紫杉醇。其結果可參見圖5。灌流培養在培養的第14天，用誘導子處理來自胚芽和針葉以及來自前形成層或形成層的培養物。從誘導的那一時間起，每5天用吸液管在無菌狀態下回收用過的培養基並同時補充相同量的新培養基。在45天長期培養後可觀察到細胞和培養基中紫杉醇的產生。其結果可參見表5。表5來源於各種外植體的東北紅豆杉細胞的紫杉醇的產生和釋放紫杉醇產量(mg/kg)紫杉醇釋放tableseeoriginaldocumentpage18tableseeoriginaldocumentpage19誘導5天之後將更新培養基一起合成到細胞培養物中，即將50mg/L殼聚糖、0.1mM苯基丙氨酸和10(HiM茉莉酸甲酯添加到用過14天的培養物中。以每5天重複更新培養基而進行實驗。細胞釋放到培養基中的紫杉醇依細胞系不同而不同。來源於前形成層或形成層的培養物的釋放能力高於現有技術的培養物的釋放能力。此外，灌流培養的應用有利於次級代謝產物釋放到培養基中。周期性地更換培養基對加強由來源於前形成層或形成層的單細胞克隆向細胞外釋放次級代謝產物是非常重要的，因為其允許生物量和簡單純化的連續循環。換言之，在來源於前形成層或形成層的單細胞克隆培養中培養基的周期性更換可被認為是在長期培養中產生有價值的代謝產物的穩定方法，因為它防止了細胞中積累的代謝產物的反饋抑制、培養基中代謝產物的降解和轉化。低溫儲藏在培養的第6或第7天，懸浮的細胞在含有0.16M甘露醇的培養基中室溫下預培養3天，然後在4"下保持3小時。收集細胞並將其置於含有40%乙二醇(Sigma,USA)和30%山梨醇(DUCHEFA，TheNetherlands)的培養基的4ml冷凍管中，在4C下培養3分鐘。細胞在液氮中浸泡後，用低溫冷凍儲藏法處理懸浮細胞。為了融化，將放入液氮中超過10分鐘的培養細胞在4(TC水浴中融化1-2分鐘。為了使細胞再生長，低溫儲藏的細胞被轉移到含有0.5M山梨醇的半固體生長培養基(表1)上並在室溫下緩解(alleviate)30分鐘。細胞在含有0.1M山梨醇的半固體生長培養基上培養24小時。然後，細胞在不含山梨醇的半固體生長培養基上培養24小時，兩次。評估細胞活力。<實施例IO紫杉醇含量分析將細胞從回收的樣品培養基中分離之後，分析紫杉酮的含量。在用真空烘乾器(SamShinGlass,Korea)完全乾燥細胞後，測定細胞量。在室溫下混合大約lOOmg(乾重)細胞與4ml甲醇(Sigma,USA)溶液(1:1v/v)以及氯甲烷(Sigma,USA)，以一小時為間隔用超聲波除垢器(Branson,USA)提取3次。待細胞完全乾燥後，用4ml氯甲烷多次提取。真空乾燥分離的有機溶劑層並且將殘渣溶解在1ml甲醇中。溶解的提取物同樣通過超聲波除垢器攪拌。然後，離心後除去顆粒(8，000gX5min)。從細胞分離的培養基(l-5ml)與相同體積的氯甲烷混合併在充分攪拌後提取3次。有機溶劑經完全真空乾燥後，將其再次溶解到0.5ml的甲醇中。用HPLC(高效液相色譜，Shiseido,Japan)進行含量分析，用Sigma產品進行紫杉醇標準物質測定。通過使用爐子用Capcellpak(C18,MGII，5um，3.0mmX250mm,Shiseido,Japan)保持在40。C的溫度，以水和氰化甲烷(acetonitril，Burdick&Jackson,USA)(50:50,v/v)為流動相，並以0.5ml/min的速度有規律的滴落。使用UV-VIS探測器(227nm,Shiseido,Japan)。工業實用性在本發明中，通過單純從短枝或樹幹中分離由於比現有技術的細胞系更短的倍增時間而導致的更高產率的前形成層或形成層，獲得單克隆細胞、具有分裂組織連續性而不去分化的初級分裂組織。由於在長期培養過程中細胞生長和生長模式中更小地變化，還允許穩定的產率，並且由於細胞系的更少凝集和多個液泡，按比例擴大是可能的。在低溫儲藏之後該細胞系可被回收而在遺傳上沒有任何變化。權利要求1、一種植物細胞培養方法，其特徵在於，從植物組織分離前形成層或形成層，其包括下列步驟①收集植物組織後滅菌②從滅菌的植物組織分離前形成層或形成層③從前形成層或形成層誘導單細胞系2、根據權利要求l所述的植物細胞培養方法，其特徵在於，通過使用單細胞克隆利用具有用於植物細胞培養的調節因子的輔助細胞進行植物細胞培養。3、根據權利要求1所述的植物細胞培養方法，其特徵在於，通過回收單細胞克隆培養的用過的培養基並供給新的培養基來延長細胞活力和生物合成。4、根據權利要求l所述的植物細胞培養方法，其特徵在於，使用單細胞克隆的低溫儲藏建立細胞庫。5、一種植物生物活性物質的生產方法，其特徵在於，利用通過權利要求1所述的方法利用單細胞克隆或其培養基進行誘導。6、根據權利要求5所述的植物生物活性物質的生產方法，其特徵在於，通過茉莉酮酸甲酯處理來增加產率。7、根據權利要求6所述的植物生物活性物質的生產方法，其特徵在於，通過茉莉酮酸甲酯、苯丙氨酸和殼聚糖處理來增加產率。8、根據權利要求5所述的植物生物活性物質的生產方法，其特徵在於，通過使用單細胞克隆利用具有用於植物生物活性物質的調節因子的輔助細胞進行植物生物活性物質的生產。9、根據權利要求5所述的植物生物活性物質的生產方法，其特徵在於，回收單細胞克隆培養的用過的培養基並供給新的培養基來延長細胞活力和生物合成。10、根據權利要求5所述的植物生物活性物質的生產方法，其特徵在於，使用單細胞克隆的低溫儲藏建立細胞庫。全文摘要本發明涉及一種通過改進均質細胞系使細胞生長和生產的變化最小化的方法。更具體地，其為從前形成層或形成層分離並增殖單細胞克隆的方法，通過解決在長期培養過程中細胞生長和產率的下降問題，增強來自植物的生物活性物質生產的穩定性。文檔編號C12N5/04GK101297028SQ200680039945公開日2008年10月29日申請日期2006年4月25日優先權日2005年10月31日發明者陳榮雨申請人:雲火