一種基底、基因晶片及其製備方法以及檢測靶標的方法

2023-05-20 10:15:06 5

專利名稱：一種基底、基因晶片及其製備方法以及檢測靶標的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基底、基因晶片及其製備方法以及檢測 靶標的方法。
背景技術：
基因晶片技術是一種被廣泛應用於研究基因表達，蛋白質與基因序列相互作用以 及單核苷酸多態性的高通量的分析方法。在基因晶片的應用過程中，檢測的靈敏度和選擇 性是兩個非常重要的考察參數，所以，製作一種理想的，具有高的固定化效率，並且不與反 應體系中的其他物質進行非特異性反應的晶片基底成為了基因晶片技術的關鍵。基因晶片由基底和靶標探針組成。基底大致分為兩類1、表面修飾有醛基、環氧基 或羧基等官能團的二維(2D)平板基底；2、在2D平板基底上塗覆聚丙烯醯胺凝膠使其表面 具有三維(3D)結構的3D基底。相對於2D基底，3D基底具有高的固定化效率，能提供較多 的反應位點與靶標反應，這樣就大大提高了晶片的檢測靈敏度，但是塗覆凝膠依然存在反 應點少，與靶標探針結合不完全，生物相容性和可降解性不好的缺點。樹枝狀大分子是一種特殊的聚合物，它不像鏈狀高聚物那樣會發生捲曲，因此能 夠提供很多末端基團用於功能化反應。此外，這種樹枝狀的分子還具有比較好的生物相容 性。鑑於它的這種優良的性質，很多的研究工作者已經利用它來修飾基底，製作3D的基因 晶片。這種大分子修飾的3D基底不僅具有很高的固定化效率，而且在後面的一系列反應和 洗滌過程中性能穩定。目前，對表面修飾有樹枝狀大分子的3D基因晶片的檢測主要依賴傳統的螢光分 子染料檢測方法，但是螢光染料檢測方法不僅光穩定性差，還必須使用高精度的儀器，檢測 過程步驟複雜，不易控制。在不斷尋求創新方法的過程中，本領域人員發現，金屬、半導體以 及磁納米粒子具有比較特殊的性質，能夠取代螢光染料而用於基因檢測。尤其是金屬納米 粒子的共振光散射檢測法靈敏度更高，甚至能夠檢測單分子識別反應。Mirkin研究小組將 金納米粒子應用於晶片上來檢測靶標，文中用金標記的靶標探針來識別靶標，再用基於無 電導的銀沉積步驟來提高共振光散射信號。這種方法能夠靈敏的檢測靶標而不用聚合酶鏈 反應(PCR)等靶標放大技術。此外，這種基於金納米粒子共振光散射的基因晶片的信號提 取可以直接使用普通的白光掃描儀，因此，能夠節省很多經費，但是Mirkin只報導了金納 米粒子應用於2D基底或塗覆凝膠的3D基底製備的晶片，應用於樹枝狀大分子修飾的晶片 還未有報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題是針對現有的生物晶片檢測靈敏度和識別度欠佳的缺 陷，提供一種靈敏度和識別度更高的基因晶片和檢測靶標的方法。為了解決以上問題，本發明提供了一種用於生物晶片的基底，由聚醯胺-胺型樹 枝狀大分子通過共價鍵結合在固體支持物上形成，所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚醯 胺_胺型樹枝狀大分子經醛基活化。優選的，所述固體支持物為玻片。優選的，所述生物晶片為基因晶片、蛋白質晶片、糖晶片或組織晶片。本發明還提供了一種基因晶片，包括表面通過共價鍵結合了聚醯胺-胺型樹枝 狀大分子的固體支持物，以及通過共價鍵固定在所述聚醯胺_胺型樹枝狀大分子上的靶標 探針；所述靶標探針含有能與靶標雜交的序列；所述聚醯胺_胺型樹枝狀大分子為以乙二 胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220;所述聚醯胺-胺 型樹枝狀大分子經醛基活化。
優選的，所述固體支持物為玻片。優選的，所述玻片為二氧化矽玻片或有機矽玻片。優選的，所述靶標探針為3' -NH2修飾的DNA探針或RNA探針。本發明還提供了所述基因晶片的製備方法，包括以下步驟步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡於聚醯胺-胺型樹枝狀大分子溶液中 IOh 14h得到與聚醯胺_胺型樹枝狀大分子共價結合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子共 價結合的固體支持物活化；步驟3 取靶標探針在步驟2所得固體支持物上點樣，得到基因晶片。本發明還提供了利用所述基因晶片進行靶標檢測的方法，包括以下步驟步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應，製備與檢 測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與靶標雜交；步驟2 使固定於權利要求4所述基因晶片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣 品反應，洗滌後使所述基因晶片與步驟1所製備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所 述靶標探針不與檢測探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶 液按體積比1 1.5 1混合後，與經步驟2處理後的基因晶片在室溫下反應，洗滌後檢測 共振光散射信號。優選的，所述靶標為DNA序列或RNA序列。本發明提供了一種用於生物晶片的基底，由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子通過共價 鍵結合在固體支持物上形成，所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子經 醛基活化。該基底可以用於基因晶片、蛋白質晶片、糖晶片和組織晶片的製備。本發明還提 供了一種基因晶片，包括表面通過共價鍵結合了聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的固體支持 物，以及通過共價鍵固定在所述聚醯胺_胺型樹枝狀大分子上的靶標探針；所述靶標探針 含有能與靶標雜交的序列；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個 氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子經醛 基活化。本發明提供的基因晶片，使用聚醯胺_胺樹枝狀大分子修飾玻片，並將靶標探針通 過共價鍵固定在所述樹枝狀大分子上，由於所述聚醯胺_胺樹枝狀大分子具有64個氨基末 端，與現有技術相比增加了反應點，這樣就能夠連接更多的相同的靶標探針，增加了基因晶片的靈敏度；也可以同時連接不同的靶標探針，以增加基因晶片的檢測通量。本發明還提供了一種基因晶片的製備方法，包括步驟1 將表面醛基化的玻片浸泡於聚醯胺-胺型樹枝 狀大分子溶液中IOh 14h得到與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子共價結合的玻片；步驟2 用 PH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子共價結合的玻片活化； 步驟3 取靶標探針在步驟2所得玻片上點樣，得到基因晶片。由於使用的是聚醯胺-胺型 樹枝狀大分子，所以具有多個反應點，與靶標探針和玻片的反應及固化速率都很高，降低了 反應條件，不需要大型的複雜的設備，節約了成本。本發明還提供了一種利用基因晶片檢測 靶標的方法，包括步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應， 製備與檢測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與靶標雜交；步驟2 使固定於權利要求 4所述基因晶片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣品反應，洗滌後使所述基因晶片與步 驟1所製備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所述靶標探針不與檢測探針雜交；步驟 3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶液按體積比1 1.5 1混合後，與經步驟2處理後的基因晶片在室溫下反應，洗滌後檢測共振光散射信號。 本發明提供的檢測方法，用檢測探針耦合的金納米粒子做為靶標的標記物。如果靶標探針 與靶標不能完全配對，靶標探針序列與靶標序列中的錯位鹼基越多，金納米粒子的共振光 散射信號就越弱，因此通過共振光散射信號的強弱以及靶標探針的序列就可以判斷靶標的 序列，與現有技術相比本發明提供的靶標檢測方法提高了識別度。靈敏度和準確性。


圖1示本發明所述基底的製備過程；a為玻片通過醛基共價結合聚醯胺_胺型樹枝狀大分子的過程，b為用硼氫化鈉 除去希夫鹼的過程，c為聚醯胺-胺型樹枝狀大分子與戊二醛反應的過程。GA為戊二醛、 PAMAM為聚醯胺-胺型樹枝狀大分子；圖2示用本發明所述基因晶片進行靶標檢測的過程，其中a為通過醛基共價結合 聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的玻片，P為靶標探針，τ為靶標，G為檢測探針耦合的金納米粒 子；圖3示共振光散射信號與靶標探針P1濃度的關係，白色對應於未通過醛基共價 結合聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的玻片製作的基因晶片，黑色對應通過醛基共價結合聚醯 胺-胺型樹枝狀大分子的玻片製備的基因晶片；圖4示不同基底製備的基因晶片的信噪比、質量因子對比，其中，共振光散射強度 在3X IO4 4X IO4之間的正方形點對應使用修飾有聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的基底制 備的基因晶片上各個檢測點的共振光散射信號，而IX IO4 2X IO4之間的圓形點是未使用 聚醯胺_胺型樹枝狀大分子修飾的基底製備的基因晶片上各個檢測點的共振光散射信號， 0 IXIO4之間的正方形點和圓點為背景的共振光散射信號；圖5示共振光散射信號與靶標T濃度的關係，圖中正方形點對應於未使用聚醯 胺_胺型樹枝狀大分子修飾的基底製備的基因晶片上的共振光散射信號，圓點對應於使用 聚醯胺_胺型樹枝狀大分子修飾的基底製備的基因晶片上的共振光散射信號；圖6示未使用聚醯胺-胺型樹枝狀大分子修飾的基底製備的基因晶片檢測靶標序 列結果，圖中橫坐標為5 μ mol/L的不同靶標探針，縱坐標為共振光散射相對強度，即以完全匹配的靶標探針P1的信號為基準，其他靶標探針的信號與P1信號的比值；圖7示使用醛基共價結合聚醯胺-胺型樹枝狀大分子修飾的基底製備的基因晶片 檢測靶標序列結果，圖中橫坐標為5 μ mol/L的不同靶標探針，縱坐標為共振光散射相對強 度，即以完全匹配的探針P1的信號為基準，其他探針的信號與P1信號的比值。
具體實施例方式為了進一步了解本發明，下面結合實施例對本發明的優選實施方案進行描述，但 是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特徵和優點而不是對本發明專利要求的 限制。本發明提供了一種用於生物晶片的基底，由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子通過共價 鍵結合在固體支持物上形成，所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子 經醛基活化。按照本發明，利用醛基修飾的玻片(2D基底)與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子 通過共價鍵結合，得到聚醯胺_胺型樹枝狀大分子修飾的玻片(3D基底)，再通過所述聚醯 胺_胺樹枝狀大分子表面的氨基末端醛基化即可用於製備基因晶片、蛋白質晶片、糖晶片、 組織晶片等生物晶片。本發明提供的用於生物晶片的基底利用樹枝狀大分子的多氨基末端 增加了反應點，使生物晶片靈敏度提高。本發明提供了一種使用所述基底的基因晶片，包括表面通過共價鍵結合了聚醯 胺_胺型樹枝狀大分子的固體支持物，以及通過共價鍵固定在所述聚醯胺_胺型樹枝狀大 分子上的靶標探針；所述靶標探針含有能與靶標雜交的序列；所述聚醯胺_胺型樹枝狀大 分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ； 所述聚醯胺_胺型樹枝狀大分子經醛基活化。按照本發明，玻片優選為本領域人員熟知的二氧化矽玻璃片或有機矽半導體玻 片，本發明不做限定，所述玻片的表面預先經過了醛基修飾。聚醯胺_胺型樹枝狀大分子優 選以乙二胺為中心的含有64個氨基末端的第四代聚醯胺-胺型樹枝狀大分子(PAMAM)，而 所述64個氨基末端形成了一個近似的圓球狀，增加了玻片的表面積與反應點，能夠結合更 多的靶標探針，使製備的基因晶片靈敏度更高，檢測更準確，所述PAMAM與玻片上醛基的個 數比為1 2 4。所述靶標探針為10 12個核苷酸組成的基因序列，是靶標一部分序列的 互補鏈，用於和靶標結合。本發明優選使用西格瑪(SIGMA)公司生產的分子量為14214. 17 的 PAMAMjl^S 64. 7°C，在 25°C下，密度為 0. 813g/mL。本發明還提供了一種基因晶片的製備方法，包括步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡於聚醯胺-胺型樹枝狀大分子溶液中 IOh 14h得到與聚醯胺_胺型樹枝狀大分子共價結合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子共 價結合的固體支持物活化；步驟3 取靶標探針在步驟2所得固體支持物上點樣，得到基因晶片。按照本發明，將醛基修飾的玻片放入25mL 35mL的第四代PAMAM甲醇溶液中，第 四代PAMAM的質量百分數優選為0. 05% 0. 15%，在輕微攪拌下，PAMAM上的氨基末端會與 玻片上的醛基反應，將PAMAM通過共價結合在醛基修飾的玻片上，室溫反應IOh 14h後，用25mL 35mL甲醇洗滌2 3次，每次2min 3min，目的是用甲醇除去未反應的PAMAM， 洗滌結束後用N2吹乾所述通過醛基共價結合有PAMAM的玻片。PAMAM與玻片的共價結合 過程中，PAMAM上的氨基末端和玻片上的醛基反應後，會生成希夫鹼，而希夫鹼中含有不穩 定的亞胺鍵，容易水解，通過硼氫化鈉還原亞胺鍵會變為較穩定的仲胺，按照本發明，將上 述通過醛基共價結合PAMAM的玻片浸泡在體積為25mL 35mL，濃度為8mmol/L 12mmol/ L硼氫化鈉(NaBH4)溶液中，還原所述希夫鹼。然後，將通過醛基共價結合PAMAM的玻片放 入25mL 35mL的戊二醛溶液中反應3h 5h，使PAMAM上的未與玻片表面上醛基反應的 氨基波段與戊二醛反應。所述戊二醛溶液優選包括2wt % 5wt %的戊二醛和95wt % 98wt%的磷酸鹽緩衝溶液，所述磷酸鹽緩衝液優選為含有40mmol/L 60mmol/L的磷酸鹽、 0. 10mol/L 0. 20mol/L的氯化鈉的PBS溶液，添加磷酸鹽緩衝液的目的在於保持整個戊二 醛溶液的PH值為7 7. 4。所述反應結束後用25mL 35mL上述磷酸鹽緩衝溶液洗滌所述 玻片2 3次，每次2min 3min，再優選使用Milli-Q超純水洗滌所述玻片2 3次，每次 2min 3min，所有洗滌步驟結束後，優選使用離心乾燥器將所述通過共價鍵結合PAMAM的 玻片離心乾燥後得到3D基底，並將所述基底在3°C 4°C下保存待用。基底的製備過程如 圖1所示。3D基底製備完成後，將點樣緩衝液與靶標探針混合得到靶標探針溶液。本發明 提供的靶標探針末端均有一個氨基修飾，目的是為了能和PAMAM上的醛基反應，將靶標 探針連結到基底上。所述點樣緩衝液包括40mmol/L 50mmol/L檸檬酸三鈉，0. 4mol/ L 0. 5mol/L的氯化鈉，lmol/L 2mol/L甜菜鹼，0. 004wt% 0. 006wt%十二烷基磺酸 鈉。取10 μ L 20 μ L所述樣品溶液於樣品板中，用Smartarrayer48點樣系統，在3D基 底上點樣。將點好樣的基底放入恆溼箱中，在20 30°C下恆溫反應至少10小時，再升溫 90°C 100°C，反應IOmin 20min。使得靶標探針上的氨基與醛基反應，將靶標探針連接 在3D晶片基底上，反應結束後用25mL 35mL洗液洗滌2 3次每次2min 3min，再用 Milli-Q超純水洗滌2 3次每次2min 3min以除去未被固定的靶標探針。所述洗液優 選包括15mmol/L 17mmol/L檸檬酸三鈉緩衝溶液，0. 15mol/L 0. 16mol/L的氯化鈉， 0.01wt% 0.03wt%十二烷基磺酸鈉。洗滌結束後得到基因晶片。按照本發明首先恆溫 反應是為了時靶標探針能夠均勻的與3D基底均勻結合，而升溫反應是為了防止基底表面 通過共價鍵結合的的靶標探針自雜交而降低基因晶片的檢測靈敏度。按照本發明優選將制 備好的基因晶片放入封閉溶液中，在25 30°C下反應Ih 1. 5h，目的是為了除去基因芯 片表面未反應的活性醛基。所述封閉溶液為40mmol/L 60mmol/L磷酸鹽、0. 15mol/L 0. 2mol/L 氯化鈉、0. lmol/L 0. 2mol/L 乙醇胺的 PBS 溶液，pH = 7 7. 4。本發明還提供了一種靶標的檢測方法，包括步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應，製備與檢測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與 靶標雜交；步驟2 使固定於權利要求4所述基因晶片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣品反應，洗滌後使所述基因晶片與步驟1所製備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所 述靶標探針不與檢測探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶液按體積比1 1.5 1混合後，與經步驟2處理後的基因晶片在室溫下反應，洗滌後檢測共振光散射信號。按照本發明，優選使用「Turkevich-Frens」方法製備金納米粒子GNPs，即用檸檬 酸三鈉還原氯金酸製備的金納米粒子，所述金納米粒子的直徑優選為IOnm 13nm。按照 本發明，檢測探針耦合的金納米粒子優選為將檢測探針通過共價鍵與金納米粒子GNPs耦 合得到檢測探針耦合的金納米粒子，所述檢測探針優選為二硫鍵修飾的探針(SP)。在本發 明中首先將體積為20 μ L 30 μ L、濃度為30 μ mol/L 40 μ mol/L的SP水溶液與體積優 選為450 μ L 550 μ L、濃度優選為4nmol/L 8nmol/L的GNPs溶液混合，靜置過夜；然後 加入450 μ L 550 μ L磷酸鹽緩衝溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸鹽緩衝溶液的ρΗ值 為7. 0 7. 4。所述磷酸鹽緩衝溶液中優選含8mmol/L 12mmol/L磷酸鹽、0. lmol/L 0. 5mol/L氯化鈉的PB S溶液。將所述第一混合溶液靜置1. 5h 2. 5h後優選使用真空離 心濃縮儀將第一混合液溶液濃縮至120 μ L 180 μ L得到第一濃縮液。然後再以8000 10000轉/min的轉速，10 20min的時間離心第一濃縮液2 3次，除去游離在第一濃縮 液中未與金納米粒子耦合的檢測探針，將離心濃縮後得到的檢測探針耦合的金納米粒子溶 於雜交緩衝液中並保持檢測探針耦合的金納米粒子最終濃度為4nmol/L 6nmol/L。所述 雜交緩衝液優選包括50mmol/L 70mmol/L檸檬酸三鈉，0. 5mol/L 0. 7mol/L的氯化鈉， 0. 05wt% 0. 15襯％十二烷基磺酸鈉。所述檢測探針耦合的金納米粒子為靶標檢測中靶標 的標記物，如果靶標探針與靶標不能完全配對，那麼檢測探針就無法與靶標雜交，就無法檢 測到金納米粒子的共振光散射信號，靶標探針序列與靶標序列中的錯位鹼基越多，共振光 散射信號就越弱，因此通過共振光散射信號的強弱以及靶標探針的序列就可以判斷靶標的 序列。利用預先製備好的基因晶片以及檢測探針耦合的金納米粒子就可以用來檢測靶 標的基因序列，檢測分為兩個階段，第一階段為靶標與基因晶片的雜交反應，然後所述靶標 再與檢測探針耦合的金納米粒子進行雜交反應得到金納米粒子標記的連接有靶標的基因 晶片，第二階段為用銀粒子沉積在所述檢測探針耦合的金納米粒子上的金納米粒子的表 面，擴大金納米粒子的半徑，增強了共振光散射信號強度，從而提高檢測的靈敏度和準確 性。按照本發明，靶標探針為靶標互補鏈的一部分，而與金納米粒子耦合的檢測探針 為靶標互補鏈的另一部分，當把靶標與靶標探針雜交後，再用檢測探針耦合的金納米粒子 與靶標雜交，且靶標探針不與檢測探針雜交，通過金納米粒子特有的共振光散射性質，可以 通過檢測信號的強弱來判斷互補鏈與靶標是否完全匹配。具體雜交步驟為指將靶標溶解在雜交緩衝液中得到靶標溶液，取15 μ L 25 μ L 的靶標溶液與在所述封閉溶液中封閉好的基因晶片在25°C 35°C下反應25min 35min。 所述雜交緩衝液優選包括60mmol/L 70mmol/L檸檬酸三鈉溶液，0. 6mol/L 0. 8mmol/L 的氯化鈉溶液，0. lwt% 0. 2襯％十二烷基磺酸鈉。洗滌反應後的晶片，所述洗滌包括用上 述雜交緩衝液在30°C下洗滌2 3次，每次2min 3min，再用所述洗液在室溫下洗滌2 3次，每次2min 3min，最後用Milli-Q超純水洗滌2 3次，每次2min 3min，洗滌結束 後，再離心乾燥Imin 2min，讓晶片與之前製備好的檢測探針耦合的金納米粒子在30°C下 反應30min，再對晶片進行以上洗滌和乾燥過程過程。按照本發明在晶片與檢測探針耦合的金納米粒子反應完之後，用銀增強溶液在室溫下反應6min lOmin，用水洗滌所述銀增強處理後的基因晶片2 3次，每次2min 3min，離心乾燥Imin 2min。所述銀增強溶液優選為體積比為1 1. 5 1的硝酸銀溶液 和對苯二酚溶液。最後，用微陣列掃描儀(Arraylt Spotffare Colorimetric Microarray Scanner)掃描所述銀增強後的基因晶片，提取共振光散射信號(RLS)。本發明中討論所用 的RLS信號值都是扣除背景以後的信號值，通過RLS信號的強弱可以判斷靶標探針和靶標 的匹配度進而推斷出靶標的序列信息。以下用具體實施例來詳細闡述本發明的方案實施例1按照以下步驟來製備檢測探針耦合的金納米粒子用Turkevich-Frens法製備直徑為13nm金納米粒子。將體積為25 μ L、濃度為 40 μ mol/L的SP水溶液與500 μ L、6nmol/L的GNPs溶液混合，靜置過夜，然後加入500 μ L 磷酸鹽緩衝溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸鹽緩衝溶液的PH為7. 4，且所述磷酸鹽緩 衝溶液為含有lOmmol/L磷酸鹽、0. 2mol/L氯化鈉的PBS溶液。將所述第一混合溶液靜置 2h後優選使用真空離心濃縮儀將溶液濃縮至150 μ L得到濃縮液。然後再以9000rad/min 的轉速離心濃縮液3次每次15min，將離心濃縮後得到的檢測探針耦合的金納米粒子溶於 60mmol/L檸檬酸三鈉，0. 6mol/L的氯化鈉，0. Iwt %十二烷基磺酸鈉組成的雜交緩衝液中 並保持檢測探針耦合的金納米粒子溶液的最終濃度為5nmol/L。實施例2按照以下方法來製作3D基底將醛基修飾的玻片放入30mL質量分數為0. Iwt%的第四代的PAMAM甲醇溶液中， 在攪拌下，室溫反應12h後，用30mL甲醇洗滌3次，每次3min，再用N2吹乾。用30mL，IOmmol/ L的硼氫化鈉(NaBH4)溶液還原上述反應中生成的希夫鹼。然後，將修飾有樹枝狀分子的基 底放入30mL的戊二醛溶液中反應4小時，所述戊二醛溶液優選包括5wt%的戊二醛和95% 的磷酸鹽緩衝溶液，所述磷酸鹽緩衝液為含有50mmol/L磷酸鹽、0. 15mol/L的氯化鈉的PBS 溶液，PH值為7. 4。用30mL上述磷酸鹽緩衝溶液洗滌3次，每次3min，用Milli-Q超純水 洗滌3次，每次3min，離心乾燥Imin後得到PAMAM修飾的3D基底，將該3D基底保存於4°C 下待用。其具體製作過程參看圖1。實施例3PAMAM修飾的3D基底製備的基因晶片的反應效率實驗首先，按照實施例1，實施例2的方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM修 飾的3D基底；其次，用45mmol/L檸檬酸三鈉緩衝液，0.45mol/L的氯化鈉，1. 5mol/L甜菜鹼， 0. 005wt %十二烷基磺酸鈉組成的點樣緩衝液分別配製濃度為20 μ mol/L、5 μ mol/L、 500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L 的探針 P1 溶液，P1 的序列如 SEQ ID No. 1 所示。取 15 μ L 樣 品於樣品板中，用Smartarrayer48點樣系統，在普通的2D晶片基底上和修飾有PAMAM的3D 基底上點樣。將點好樣的晶片放入恆溫恆溫箱中反應12小時，反應條件為T = 25°C，相對 溼度90%，再在100°C下反應15min ；接下來，用30mL洗液3次，每次3min，再用Milli-Q超 純水3次，每次3min。最後，將晶片放入封閉溶液中，在30°C下反應1小時得到基因晶片。
將靶標溶於雜交緩衝液中得到靶標溶液，取20 μ L的靶標溶液與在所述封閉溶液中封閉好的基因晶片在30°C下反應20min。所述雜交緩衝液包括60mmol/L檸檬酸三鈉， 0. 6mol/L的氯化鈉，0. 十二烷基磺酸鈉。洗滌反應後的晶片，所述洗滌包括用上述雜 交緩衝液在30°C下洗滌3次，每次3min，再用15mmol/L檸檬酸三鈉，0. 15mol/L的氯化鈉， 0. 0Iwt %十二烷基磺酸鈉組成的洗液在室溫下洗滌3次，每次3min，最後用Mi 11 i_Q超純水 洗滌3次，每次3min，洗滌結束後，再離心乾燥lmin，讓晶片與之前製備好的檢測探針耦合 的金納米粒子在30°C下反應30min，再對晶片進行以上洗滌和乾燥過程過程。按照本發明在晶片與檢測探針耦合的金納米粒子反應完之後，用體積比為1 1 的濃度為0. 08mol/L的硝酸銀溶液和濃度為0. 04mol/L的對苯二酚溶液組成的銀增強溶 液在室溫下與檢測探針耦合的金納米粒子標記的基因晶片反應8min，用水洗滌所述銀增 強處理後的基因晶片3次，每次3min，離心乾燥lmin。所述銀增強溶液為體積比為1 1 的硝酸銀溶液和對苯二酚溶液。最後，用微陣列掃描儀(ArrayltSpotWare Colorimetric Microarray Scanner)掃描所述銀增強後的基因晶片，提取共振光散射信號(RLS)。本發明 中討論所用的RLS信號值都是扣除背景以後的信號值。晶片上的具體反應過程參看圖2。按照以上實驗步驟，我們得到的結果如圖3所示。圖3是在2D和3D基底上，共振光散射信號隨著探針P1 (與靶標完全匹配)濃度的 變化而變化的圖像以及相應的數據提取圖其中，白色對應於2D基底，黑色對應於3D基底。 實驗中用到的探針 P1 的濃度分別為 20ymol/L、5ymol/L、500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L ； 靶標T的濃度為lOOnmol/L，檢測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。當P1濃度大 於50nmol/L時得到最佳的信噪比值(3倍的標準偏差)，且當P1濃度在50nmol/L-5 μ mol/ L之間時，共振光散射信號隨著濃度的增加而增強並在5 μ mol/L時基本達到飽和值。而在 同樣的實驗條件下，2D基底製備的基因晶片上的信號則相對較弱。這個結果表明樹枝狀 分子修飾的3D基底製備的基因晶片相對於普通的2D基底製備的基因晶片具有較高的反應 效率。實施例4PAMAM修飾的3D基底製備的基因晶片的性能首先，按照的實施例1和實施例2方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；用實施例3的方法進行點樣、雜交反應和檢測標靶並做了大於50組的實驗作為對 比，其中靶標探針P1的濃度為5 μ mol/L。晶片上的具體反應過程參看圖2。按照以上實驗步驟，我們得到的結果參看圖4我們通過對2D(圓點)和3D (正方 形)兩種基底製備的基因晶片上的50個點的共振光散射信號，以及背景提取噪音信號的考 察即共振光散射在0 10000之間的正方形點和圓形點，分別計算了兩種基底的信噪比S/ N和質量因子V。實驗中用到的探針P1的濃度為5 μ mol/L，靶標T的濃度為lOOnmol/L，檢 測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。圖中我們考察了 50個點的共振光散射信號以 及背景，分別計算了兩種基底的S/N值和Z』質量因子，S/N值根據通過RSL檢測的共振光散射信號強度與背景噪音信號的比值，而ζ』是通過公式Z = 1-3σs+3σc/us－uc︳︳計算，其中μ。背景信號的平均值；σ。背景的信號標準偏差；μ s金納米粒子共振光散射信號的平均值；ο s金納米粒子共振光散射信號的標準偏差。通過計算得到3D基底製備的基因晶片的S/N為9.0，V為0. 87，而2D基底製備 的基因晶片S/N為5.72，Z』為0.57。S/N值越大，Z』值越趨向於1，晶片的質量越好。所以通過以上的結果證明本發明提供的3D基底製備基因晶片的性能優於2D基底 製備的基因晶片。實施例5本發明提供的基因晶片的檢測限和線性範圍首先，按照實施例1和實施例2的方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；按照實施例4的方法進行點樣、雜交反應和檢測靶標，其中靶標溶液的濃度分別 為 1 μ mol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、500pmol/L、100pmol/Lo晶片上的具體反應過程參看圖2。按照以上實驗步驟，我們得到的結果參看圖5。圖5為是在2D基底製備的基因晶片和3D基底製備的基因晶片上，共振光散射信 號隨著靶標T濃度的變化而變化的圖像以及相應的數據提取圖，其中，正方形對應於2D基 底製備的基因晶片上的信號曲線，圓點對應於3D基底上製備的基因晶片的信號曲線。圖 中橫坐標為靶標濃度取對數值，縱坐標為共振光散射信號。實驗中用到的探針P1的濃度為 5μΜ ；靴標 T 的濃度分別為 1 ymol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、lnmol/L、 500pmol/LU00pmol/L ；檢測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。在3D基底製備的基因晶片上，此方法對靶標的檢測限為lOOpmol/L，且當濃度在 Inmol/L-lOOnmol/L之間時，共振光散射信號隨著濃度的增加而增強，在濃度為lOOnmol/L 時達到飽和。而對於2D基底製備的基因晶片，信號值明顯較低，且檢測限為lOnmol/L，即靈 敏度降低了兩個數量級。實施例6本發明提供的檢測方法的選擇性。首先，按照實施例1和實施例2的方法得到檢測探針耦合的金納米粒子和PAMAM 修飾的3D基底；按照實施例4的方法進行點樣、雜交反應和檢測靶標，其中使用了 10中不同的靶 標探針溶液P1-Picit5晶片上的具體反應過程參看圖2。實驗中用到的10種靶標探針P1 Pltl的序列如SEQ ID No. 1、No. 2Νο· 3、No. 4、 No. 5、No. 6、No. 7、No. 8、No. 9、No. 10 所示。靶標 T 的序列如 SEQ ID No. 11 所示。其中，只 有P1與靶標完全匹配，P2 P7在不同位點各有一個錯配鹼基，P8 Pltl各有兩個錯配鹼基。按照以上實驗步驟，我們得到的結果如圖6，圖7所示。圖中y軸代表共振光散射 的相對強度，即以完全匹配的探針P1的信號為基準，其他探針的信號與P1信號的比值；X軸 代表相應的靶標探針種類。是對單核苷酸多態性考察。圖6是在2D基底上10種靶標探針(P1-Pio)的共振光散射信號圖及相應的數據提取圖，圖7是在3D基底上10種探針的共振光散射信號圖及相應的數據提取圖。實驗中用到的探針(P1-Pltl)的濃度均為5ymol/L，靶標 T的濃度為lOOnmol/L，檢測探針耦合的金納米粒子的濃度為5nmol/L。通過以上實驗結果可以證明(1)只有與靶標相匹配的探針P1有強的共振光散射 信號；(2)具有一個錯配鹼基的寡聚物P2-P7有很弱的信號，且其信號值與鹼基對的種類和 錯配位點有關錯配位點越靠近探針的固定端即3』端信號值越弱，且在同一錯配位點處， 含有T:G鹼基對的靶標探針比含有T:C鹼基對的信號要高；(3)具有兩個錯配鹼基的寡聚 物P8-Pltl沒有可檢測的共振光散射信號；(4)通過圖中柱狀數據的比較計算得出結論含有 一個錯配鹼基的靶標探針與完全匹配的靶標探針的散射光信號比值，2D基底製備的基因芯 片的比值在0-24. 3%之間，3D的基底製備的基因晶片比值在0-4. 2%之間，說明3D基底制 備的基因晶片的選擇性明顯優於2D基底製備的基因晶片。以上對本發明提供的一種靶標的檢測方法及其檢測用基因晶片進行了詳細的介 紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只 是用於幫助理解本發明的方法及其核心思想，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修 飾也落入本發明權利要求的保護範圍內。
權利要求
一種用於生物晶片的基底，其特徵在於，由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子通過共價鍵結合在固體支持物上形成，所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214～14220；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子經醛基活化。
2.根據權利要求1所述的基底，其特徵在於，所述固體支持物為玻片。
3.根據權利要求1所述的基底，其特徵在於，所述生物晶片為基因晶片、蛋白質晶片、 糖晶片或組織晶片。
4.一種基因晶片，包括表面通過共價鍵結合了聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的固體支 持物，以及通過共價鍵固定在所述聚醯胺_胺型樹枝狀大分子上的靶標探針；所述靶標探 針含有能與靶標雜交的序列；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64 個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214 14220 ；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子經醛基活化。
5.根據權利要求4所述的基因晶片，其特徵在於，所述固體支持物為玻片。
6.根據權利要求5所述的基因晶片，其特徵在於，所述玻片為二氧化矽玻片或有機矽 玻片。
7.根據權利要求4所述的基因晶片，其特徵在於，所述靶標探針為3'-NH2修飾的DNA 探針或RNA探針。
8.權利要求4-7任一項所述基因晶片的製備方法，包括以下步驟步驟1 將表面醛基化的固體支持物浸泡於聚醯胺_胺型樹枝狀大分子溶液中IOh 14h，得到與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子共價結合的固體支持物；步驟2 用pH值為7 7. 4的戊二醛溶液將所述與聚醯胺-胺型樹枝狀大分子共價結 合的固體支持物活化；步驟3 取靶標探針在步驟2所得固體支持物上點樣，得到基因晶片。
9.一種靶標的檢測方法，包括以下步驟步驟1 使半徑為IOnm 13nm金納米粒子與二硫鍵修飾檢測探針反應，製備與檢測探 針耦合的金納米粒子，所述檢測探針與靶標雜交；步驟2 使固定於權利要求4所述基因晶片上的靶標探針與可能含靶標的待測樣品反 應，洗滌後使所述基因晶片與步驟1所製備的與檢測探針耦合的金納米粒子反應，所述靶 標探針不與檢測探針雜交；步驟3 取0. 05 0. 09mol/L的硝酸銀溶液與0. 02 0. 05mol/L的對苯二酚溶液按 體積比1 1.5 1混合後，與經步驟2處理後的基因晶片在室溫下反應，洗滌後檢測共振 光散射信號。
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特徵在於，所述靶標為DNA序列或RNA序列。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，提供了一種用於生物晶片的基底，由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子通過共價鍵結合在固體支持物上形成，所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為以乙二胺為中心放射出64個氨基末端的樹枝狀大分子，分子量為14214～14220；所述聚醯胺-胺型樹枝狀大分子經醛基活化。本發明提供的用於生物晶片的基底利用樹枝狀大分子的多氨基末端增加了反應點，使生物晶片靈敏度提高。本發明還提供用所述基底製備的基因晶片、所述基因晶片的製備方法以及利用該基因晶片檢測靶標的方法。
文檔編號C12M1/34GK101824477SQ20101015773
公開日2010年9月8日 申請日期2010年4月28日 優先權日2010年4月28日
發明者劉殿俊, 李小梅, 王振新 申請人:中國科學院長春應用化學研究所