陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體、製備方法及應用的製作方法

2023-05-19 19:05:51 1

專利名稱：陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體、製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及改性大分子聚合物及蛋白構建的藥物和基因載體、製備方法及應用，進一步的說是一種轉鐵蛋白修飾的陽離子高分子脂質基因載體、製備方法及應用，屬於功能化脂質體的製備及應用技術。
背景技術：
近年來，基因組學、蛋白質組學等領域取得了大量的進展，獲得了很多有望用於腫瘤基因治療的抑瘤基因、micr0RNA、siRNA等。但是由於缺乏安全、高效的基因治療載體，這些基因還難以用於腫瘤的臨床基因治療。因此，基因載體是腫瘤基因治療成功的關鍵；而構建一個高效、安全的基因治療載體仍然是目前亟需解決的問題。理想的腫瘤基因載體應具備以下特徵(I)腫瘤靶向性，且不易被免疫系統識別；
(2)聞度穩定，容易製備；(3)無毒；(4)基因轉染效率聞；(5)基因表達穩定並具有腫瘤選擇性。非病毒性載體具有毒性低、免疫原性低、易靶向改造和製備等優點，因此有望成為腫瘤臨床基因治療載體的選擇。但是，非病毒載體也存在轉染效率低、生物相容性差、體內腫瘤靶向性差等問題，因此仍需進一步改進。目前所研究的非病毒載體主要包括陽離子聚合物(PEI、殼聚糖、PLL等)、脂質材料、聚合物嵌段共聚物和膠束等；常用的陽離子聚合物作為轉基因的載體有其優越性，然而存在轉染效率低、穩定性差、部分材料毒性大及製備工藝複雜等問題。脂質材料中的陽離子脂質體(CL)因具有優良的特性(無免疫原性、製備簡單、使用方便、轉染效率高等)在科研及臨床實驗中被廣泛應用，其通常由一個陽離子、兩個親化合物和一個中性脂質組成；但陽離子脂質體也存在製備不穩定性、細胞毒性大、體內轉染效率差等突出問題。為解決這些問題，可將陽離子脂質體技術與陽離子聚合物技術相結合，將二者的優勢互補，開發新型的陽離子高分子脂質體(CPL)系統；CPL技術主要採用陽離子聚合物來製備具有雙層膜結構的脂質體納米粒；與CL和陽離子聚合物相比，CPL具有更高的理化穩定性，易於靶向組裝改造，設計靈活，且適合體內基因遞送。本發明為CPL系統的進一步延伸和發展。常津，梁曉飛等人報導的殼聚糖長鏈烷基季銨鹽及陽離子高分子脂質體為本發明提供了相關研究基礎(一類雙親性殼聚糖長鏈烷基季銨鹽及其製備方法，申請號200710056993. 4 ;一種高分子脂質體及其應用，專利申請號200810052465)。

發明內容
本發明目的是提供一種陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體，主要為構建一種製備簡單、成本低廉、安全性好、轉染效率高、腫瘤靶向性強的非病毒基因載體系統。本發明的目的還是提供一種上述陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體製備方法。本發明另一目的是提供一種上述陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的應用。本發明採用具有雙親性特性的轉鐵蛋白陽性大分子物質來代替普通陽離子脂質體中的陽性成分，再與普通陽離子脂質體的脂質成分組合來製備轉鐵蛋白大分子陽離子脂質基因載體，該轉鐵蛋白大分子陽離子脂質基因載體具有與普通脂質體相類似的雙層膜結、構，可包載藥物、結合基因，並介導DNA/siRNA的轉染，可轉染的細胞種類多，轉染效率高，腫瘤靶向性強，可在含血清的培養液中使用，製備和操作簡單。本發明所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體，其關鍵特徵在於使用轉鐵蛋白陽性大分子物質來代替普通陽離子脂質體中所含有的陽性成分，因此可以稱之為陽離子大分子蛋白脂質體。陽離子大分子蛋白脂質體是將陽離子脂質體技術、蛋白大分子技術和納米膠束技術相結合所開發的一種與陽離子脂質體結構相同的納米基因載體系統，其具有更優良的特性，並有脂質體和高分子膠束的優點，可將二者的優勢互補。本發明的陽離子大分子蛋白脂質體不僅具備小分子脂質體的優點，且製備方法簡單，穩定性好，藥物滲漏少，同時含有氨基和羧基等官能團，易進行多功能化組裝。本發明中的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體由轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分組成，其中，轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽與脂質成分的質量比為O. 05^20:1,轉鐵蛋白和長鏈烷基季銨鹽的質量比O. Ofl :1、優先選擇的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽 與脂質成分的質量比為廣8 :1。轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽作為主膜材構成陽離子大分子蛋白脂質體的主體，所述的基因載體為具有類似脂質體雙層膜結構的納米粒，粒徑在I lOOOOOnm，優選 l(T500nm。本發明中所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽是可溶於極性有機溶劑(氯仿、二氯甲烷、乙醇等)和水，轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽在極性有機溶劑或水溶液中的溶解度均大於0. lmg/mL，轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的蛋白分子量在100(Tl000000之間，優選為200(Γ200000，轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的分子結構中可以含有氨基、羧基、羥基等官能團，具體為轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽；其中的轉鐵蛋白可用牛血清白蛋白、Protein A、Protein G、甲胎蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)的抗體、英夫利西單抗、人纖維蛋白單鏈抗體、癌胚抗原、組織多肽抗原、澱粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質激素、抗利尿激素、生長激素、轉化生長因子、雌激素、孕激素代替。本發明中所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體中，其中構成轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的長鏈烷基季銨鹽為十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨、I，2- 二油醯-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥丙基溴化銨、I，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥丁基溴化銨、I，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥戊基溴化銨、I，2- 二掠櫚酸氧丙基-3- 二甲基_輕乙基溴化銨、I，2- 二硬脂酸氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、1，2_ 二肉豆蘧醯氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨及其上述季銨鹽相應的氯化物；或者是含環氧基團的長鏈烷基季銨鹽二甲基十八烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十四烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十二烷基環氧丙基氯化銨及其上述季銨鹽相應的溴化物。本發明中所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的製備方法為脂質體的通用製備方法包括薄膜分散法、逆向蒸發法、復乳法、離心法、PH梯度法、注入法和混溶法等，其中可優選為薄膜分散法和逆向蒸發法；薄膜分散法的基本步驟為將轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分共溶於極性有機溶劑中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分的質量比為0. 05^20 :1，所述的極性有機溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮；混勻作為有機相，除去有機溶劑使成薄膜，然後加入水相使脂質膜水化，水相為O. 9%的生理鹽水或pH=5、的緩衝溶液；逆向蒸發法的基本步驟為將轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分共溶於極性有機溶劑中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分的質量比為O. 05^20 :1，所述的極性有機溶劑指二氯甲烷、 氯仿、丙酮；混勻作為有機相；水相為O. 9%的生理鹽水或pH=6 9的緩衝溶液；將水相與有機相混合，水相和有機相的體積比為I :6飛1，超聲乳化後，旋轉蒸發除去有機溶劑；透析法的基本步驟為將轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分共溶於極性有機溶劑中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分的質量比為O. 05^20 :1，所述的極性有機溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮；，混勻作為極性有機相；將極性有機相放入透析袋中在水相溶液中透析1飛00小時，水相溶液為O. 9%的生理鹽水或pH=6、的緩衝溶液；本發明中所述的脂質成分為構成普通脂質體和陽離子脂質體的基本成分，具體為膽固醇、二油醯脂醯乙醇胺(DOPE)、3i3- [N-(N』，N』_ 二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、卵磷脂、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺或棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺中的一種或多種，如2-3種的脂質成分，優選為膽固醇、DOPE和DC-Chol。本發明所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體可以用於製備基因藥物。所述的基因藥物可為有機藥物、水溶性藥物、水不溶性藥物、基因DNA/siRNA、探針和診斷試劑，如抑癌基因(如乙醯膽鹼酯酶基因)、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗葉酸類(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤類(如巰嘌呤)、抗嘧啶類(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸還原酶抑制藥(如羥基脲)、脫氧核糖核苷酸多聚酶抑制藥(如環胞苷)、直接影響和破壞DNA結構及其功能的藥物(如氮芥、環磷醯胺、氮甲、順鉬、絲裂黴素、喜樹鹼)、抑制蛋白質合成的藥(如阿黴素、柔紅黴素、光輝黴素)、影響微管蛋白質組裝和紡錘絲形成的藥物(長春鹼、依託泊苷)。本發明所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體可通過對轉鐵蛋白陽離子脂質基因載體進行修飾或組裝而增加納米粒的使用功能，所用的修飾製劑包括抗體配體(腫瘤相關抗原標誌物)、蛋白和酶(酶類標誌物)、轉鐵蛋白、激素、肽類、聚乙二醇(PEG)、基因和小分子製劑等；優選為甲胎蛋白、癌胚抗原、組織多肽抗原、澱粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質激素、抗利尿激素、生長激素、轉化生長因子、雌激素、孕激素、兒茶酚胺類及其衍生物、ras基因家族及其表達產物、myc基因家族及其表達產物、表皮生長因子受體、葉酸、三苯氧胺、磁性顆粒。使用以上物質對基因載體進行改性時所使用的方法包括直接對基因載體納米粒的表面修飾或先製備含活性成分的前體物質再進行組裝等方法。其中PEG修飾的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體具有體內長循環功能和被動靶向功能，其製備方法優選為a:製備前體物質PEG修飾的大分子季銨鹽即轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的製備方法將轉鐵蛋白溶解到去離子水和醇的混合溶液中；再將長鏈烷基季銨鹽緩慢的加入到體系中，其中去離子水和醇的質量比為I :(Γ3 ;體系中轉鐵蛋白和長鏈烷基季銨鹽的質量比為I :0. OflOO ;所述的醇為甲醇、乙醇、或異丙醇；在室溫下攪拌24小時後將反應液透析1飛00小時，最後凍幹，得轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的白色粉末；b:將大分子季銨鹽(質量濃度1°/Tl00%)和脂質成分(質量濃度0. 1%"60%)溶於氯仿中，將PEG修飾的大分子季銨鹽(質量濃度0. 19^39%)溶於水相，然後使用薄膜分散法或逆向蒸發法製備PEG修飾的大分子蛋白季銨鹽陽離子脂質納米粒。其中EGFR抗體修飾的陽離子大分子蛋白脂質納米粒對EGFR受體高表達的腫瘤細胞具有靶向性，如腫瘤細胞SMMC-7721和MCF-7等；EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質納米粒的製備方法優選為可先製備在水相當中濃度為0. r5mg/mL的高分子季銨鹽陽離子脂質基因載體納米粒，然後使用偶聯劑將EGFR抗體偶聯到高分子季銨鹽陽離子脂質基因載體的表面既得EGFR抗體修飾的高分子季銨鹽陽離子脂質基因載體，其中高分子季銨鹽、脂質成分和EGFR抗體的質量組成依次為1% 100%，0. 1% 60%，0. 1% 39%。
本發明所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的用途，包括對藥物和基因的遞送、緩控釋、逆轉腫瘤細胞的耐藥特性及對疾病的診斷和治療；陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體作為基因轉染的非病毒載體時，與商用陽離子脂質體Lipofectamine 2000相t匕，具有更低的細胞毒性和更高的基因轉染效率。本發明所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體納米粒，採用與陽離子脂質體具有更大相似性的陽離子蛋白脂質基因載體來構建功能化的、安全性好、效率高的納米基因載體系統，並充分利用大分子脂質體所具有的優點以克服陽離子脂質體的缺點。本發明所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體系統具有以下特點(I)將功能強大的陽離子大分子蛋白脂質用做基因載體。(2)陽離子大分子蛋白脂質體具有靈活多樣、基因轉染效率高、毒性低、製備方法簡便等優點。(3)將陽離子大分子蛋白脂質體進行靶向性設計可得到專一性好的基因載體系統。為提高載體系統針對特定腫瘤的基因遞送效率，即專一性，則可充分利用陽離子大分子蛋白脂質體相對陽離子脂質體所具有的功能化修飾容易的優點。利用腫瘤細胞表面的特異性受體配體結合原理，可選擇對肝癌具有較好靶向功能的葉酸或EGFR抗體對陽離子大分子蛋白脂質體進行修飾來增強其針對肝癌的基因轉染效果，同時也採用多靶點聯用的方法來提高載體的專一性。


圖I為轉鐵蛋白-十六烷基季銨鹽的核磁(1H-NMR)圖譜；由圖可見轉鐵蛋白和十六烷基季銨鹽的特徵吸收峰均存在，說明轉鐵蛋白-十六烷基季銨鹽的成功製備。圖2為使用逆向蒸發法所製備的陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體的原子力顯微鏡照片；由圖可見陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體的粒徑較小，且分布均勻。圖3是轉鐵蛋白-十六烷基季銨鹽和陽離子大分子蛋白脂質體的SDS-PAGE電泳；其中從右到左依次為I =Marker ；2 :陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體(薄膜法)；3 :陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體(反向法)；4 :陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體(反向法，Tf-HQ量為3的2倍)；5 :轉鐵蛋白-十六烷基季銨鹽；6 :轉鐵蛋白；由圖可見陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體表面所存在的轉鐵蛋白和十六烷基季銨鹽改性後的轉鐵蛋白均可用SDS-PAGE電泳跑出，說明轉鐵蛋白存在於大分子蛋白脂質體的表面。圖4是使用螢光素酶報告基因檢測陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體的體內(荷瘤裸鼠，肝癌SMMC-7721細胞)基因遞送能力。
由圖可見，陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體(Tf-CPL)對荷肝癌裸鼠的體內基因遞送能力高於陽離子高分子脂質體(CPL)，且腫瘤內的基因表達水平明顯高於CPL。圖4中Tf_CPL :陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體；CPL :陽離子高分子脂質體；RLU 相關光數 Relative light unit ;DNA:脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic acid ;Heart:心臟，Liver:肝臟，Spleen:脾臟，Lung:肺，kidney:腎臟，Tumor:腫瘤。
具體實施例方式下面的實施例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限於此。實施例中，DOPE :二油醯脂醯乙醇胺；DC_Chol :3 P - [N_(N』，N』 - 二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇；TQCMC :十四烷基羧甲基殼聚糖季銨鹽。實施例I :本實施例探討轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的製備方法將轉鐵蛋白(Tf) IOmg溶解到去離子水和異丙醇的混合溶液IOml (水和異丙醇的體積比為1:1)中；再將二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨IOOmg緩慢的加入到該體系中；室溫下攪拌24小時後將反應液用去離子水透析3天，凍幹，得轉鐵蛋白-十六烷基季銨鹽(Tf-HQ)的白色粉末12. Omg。其中二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨可用其他長鏈烷基季銨鹽代替，其它的長鏈烷基季銨鹽成分包括二甲基十八烷基環氧丙基氯化銨、二甲基二十二烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十四烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十二烷基環氧丙基氯化銨。實施例2 本實施例探討採用逆向蒸發法時轉鐵蛋白-十六烷基季銨鹽(Tf-HQ)、十四烷基羧甲基殼聚糖季銨鹽(TQCMC)和膽固醇的不同配比對陽離子大分子轉鐵蛋白脂質體粒徑產生的影響。將不同配比的Tf-HQ (蛋白分子量為79，000)、TQCMC和膽固醇共溶於二氯甲烷中，混勻得溶液I ;準備去離子水溶液II，其中溶液I和溶液II的比例為I :2 ;將兩種溶液混合後，充分超聲乳化，在旋轉蒸發儀上減壓蒸餾除盡二氯甲烷得轉鐵蛋白脂質體溶液。由表2可見，調整Tf-HQ和膽固醇的質量配比可以得到不同粒徑大小的轉鐵蛋白脂質體，所得的陽離子轉鐵蛋白脂質體在水溶液中的粒徑大小分布也都比較均勻。其中圖2為Tf-HQ/膽固醇陽離子轉鐵蛋白脂質體的原子力顯微鏡照片。表 權利要求
1.一種陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體，其特徵在於所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體由轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分組成，其中，轉鐵蛋白和長鏈烷基季銨鹽的質量比為O. Ofl 1 ;轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽與脂質成分的質量比為O. 05 20 1 ;粒徑在 I IOOOOOnm ； 所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽是在極性有機溶劑或水中的溶解度大於O. lmg/mL,蛋白分子量在100(Γ1000000之間，其中的季銨鹽為氯化物和溴化物； 所述的脂質成分為膽固醇、二油醯脂醯乙醇胺、3 β- [Ν-(Ν』，Ν』_ 二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇、卵磷脂、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺或棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺中的一種或2-3種，優選為膽固醇、二油醯脂醯乙醇胺或3β- [Ν-(Ν』，N』 - 二甲基胺乙基)胺基甲醯基]膽固醇； 所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽中的長鏈烷基季銨鹽為十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、二甲基雙十八烷基溴化銨、I，2- 二油醯-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、1，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、1，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥丙基溴化銨、I，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥丁基溴化銨、I，2- 二油醯氧丙基-3- 二甲基-羥戊基溴化銨、I，2- 二棕櫚醯氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I，2- 二硬脂醯氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨、I，2- 二肉豆蘧醯氧丙基-3- 二甲基-羥乙基溴化銨及其上述季銨鹽相應的氯化物；或者是含環氧基團的長鏈烷基季銨鹽二甲基十八烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十六烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十四烷基環氧丙基氯化銨、二甲基十二烷基環氧丙基氯化銨及其上述季銨鹽相應的溴化物。
2.如權利要求I所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體，其特徵在於所述的轉鐵蛋白-長鏈燒基季銨鹽中的轉鐵蛋白可由牛血清白蛋白、ProteinA、Protein G、甲胎蛋白、表皮生長因子受體EGFR的抗體、英夫利西單抗、人纖維蛋白單鏈抗體、癌胚抗原、組織多肽抗原、澱粉酶、乳酸脫氫酶、核糖核酸酶、5-核苷酸酶、促腎上腺皮質激素、抗利尿激素、生長激素、轉化生長因子、雌激素或孕激素代替。
3.—種如權利要求書I所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的製備方法，其特徵在於通過步驟I)及2)獲得 1)轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的製備方法 將轉鐵蛋白溶解到去離子水和醇的混合溶液中；再將長鏈烷基季銨鹽緩慢的加入到體系中，其中去離子水和醇的質量比為I :(Γ3 ;體系中轉鐵蛋白和長鏈烷基季銨鹽的質量比為I :0. OflOO ;所述的醇為甲醇、乙醇、或異丙醇；在室溫下攪拌24小時後將反應液透析Γ500小時，最後凍幹，得轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽的白色粉末； 2)轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽與脂質成分進行組裝；組裝的方法為薄膜分散法、逆向蒸發法或透析法 薄膜分散法的基本步驟為 將步驟I)獲得的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分共溶於極性有機溶劑中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分的質量比為O. 05^20 :1，所述的極性有機溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮；混勻作為有機相，除去有機溶劑使成薄膜，然後加入水相使脂質膜水化，水相為O. 9%的生理鹽水或pH=5、的磷酸鹽緩衝溶液；逆向蒸發法的基本步驟為 將步驟I)獲得的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分共溶於極性有機溶劑中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分的質量比為O. 05^20 :1，所述的極性有機溶劑指二氯甲烷、氯仿、丙酮；混勻作為有機相；水相為O. 9%的生理鹽水或pH=6、的磷酸鹽緩衝溶液；將水相與有機相混合，水相和有機相的體積比為I :6飛1，超聲乳化後，旋轉蒸發除去有機溶劑； 透析法的基本步驟為 將步驟I)獲得的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分共溶於可與水互溶的極性有機溶劑中，所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分的質量比為O. 05^20 :1，所述的極性有機溶劑指丙酮、異丙醇、乙醇、二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺；混勻作為極性有機相；將極性有機相放入透析袋中在水相溶液中透析1飛00小時，水相溶液為O. 9%的生理鹽水或pH=6、的磷酸鹽緩衝溶液；所述的轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽、脂質成分和長鏈烷基季銨鹽同權利要求I或2所述。
4.如權利要求書3所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的製備方法，其特徵在於步驟I)中所述的長鏈烷基季銨鹽為二甲基十八烷基環氧丙基氯化銨。
5.一種如權利要求I或2所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的用途，其特徵是用於製備基因藥物。
6.如權利要求5所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體的用途，其特徵是所述的基因藥物為乙醯膽鹼酯酶抑癌基因、RB基因和p53基因、siRNA、mRNA、紫杉醇、消炎痛、甲氨蝶呤、巰嘌呤、氟尿嘧啶、氮芥、環磷醯胺、順鉬、絲裂黴素、喜樹鹼、阿黴素、柔紅黴素、光輝黴素、長春鹼、依託泊苷中的一種或幾種。
全文摘要
本發明公開了陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體、製備方法及應用。其中陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體為由轉鐵蛋白-長鏈烷基季銨鹽和脂質成分按質量比為0.05~201製備的大分子轉鐵蛋白脂質體。基因轉染實驗的結果表明大分子轉鐵蛋白脂質體在293T、NIH-3T3、肝癌Huh-7、SMMC-7721、肺癌A549細胞中的基因轉染效率與陽性對照陽離子脂質體LipofectamineTM2000相當。所述的陽離子大分子蛋白脂質基因藥物載體系統具有較好的生物相容性，細胞毒性低，可作為優良的非病毒基因給藥載體。
文檔編號A61P35/00GK102716500SQ20121021960
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者李宗海, 梁曉飛, 石必枝 申請人:上海市腫瘤研究所