一種氯黴素人工抗原的製備方法
2023-05-20 00:35:36 1
專利名稱：一種氯黴素人工抗原的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種含有氯黴素的複合物，特別涉及一種氯黴素人工抗原的製備方法。
背景技術：
氯黴素是人體及動物治病防病的一種重要的抗生素，在動物治病中應用廣泛，由於價格低廉等因素該抗菌素被廣泛應用到動物的飼料中，是常用的動物飼料添加劑之一。但是抗生素的不合理的濫用導致許多病菌能夠耐受抗生素，產生抗藥性，對抗生素的有效治療疾病帶來負面影響。隨著人們生活水平以及對濫用抗生素的防範意識的提高，逐漸認識到濫用抗生素的危害性，開始關注氯黴素的毒副作用，尤其肉食品中的抗生素的殘留量，肉食品及水產品的進出口貿易中對添加劑的成分及其含量，均有嚴格的限定。
肉製品及水產品中的氯黴素的殘留量是否超標通常採用色譜檢測法，但操作較煩，且需要專人測定，給生產企業了解抗生素的殘留量帶來困難；後來人們開展放射免疫測定及酶聯免疫測定，但設備要從國外進口，價格昂貴；由於氯黴素是半抗原，需要與載體蛋白交聯才能製備相應的抗氯黴素的抗體，在此基礎上才能建立相關的免疫檢測方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種氯黴素人工抗原的製備方法，將該人工抗原用於動物體氯黴素殘留量及免疫檢測上，具有檢測快速、操作簡便、成本低的優點。
一種氯黴素人工抗原的製備方法，其特徵在於採用以下步驟A)按重量比為1∶0.3～0.5分別稱取氯黴素和琥珀酸酐，先後加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯黴素加5-20毫升比例添加，在封閉容器中水浴6-24h，生成含有羧基的氯黴素衍生物；
B)將上述氯黴素衍生物置於離心管中，加入氯黴素原反應體積的5-10倍的冰冷1-5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉的轉速轉動10分鐘，析出含有羧基的氯黴素紅色產物，再用2-10倍體積的1-5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉澱2次，得到紫紅色沉澱物；C)向沉澱物中加入濃度為40～75％的乙醇溶液，沉澱物溶解後加入氯黴素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應5-10分鐘後，加入氯黴素重量30～50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈手臂的氯黴素衍生物；D)在帶有碳鏈手臂的氯黴素衍生物中加入氯黴素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺，反應5-10分鐘後，再加入氯黴素重量50-200倍重量的待偶聯的蛋白質進行偶聯反應，經過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯黴素-碳鏈-載體蛋白複合物，該複合物為一種氯黴素人工抗原；其中的載體蛋白是指常規的可作免疫載體使用的可溶性蛋白質。
同現有技術比較，本發明的優點是將本氯黴素-碳鏈-載體蛋白複合物作為氯黴素人工抗原用於動物體氯黴素殘留量檢測及免疫檢測領域，使相關免疫檢測具有檢測快速、操作簡便、成本低的優點。
具體實施例方式
實施例1一種氯黴素人工抗原的製備方法，其特徵在於採用以下步驟A)按重量比為1∶0.3分別稱取氯黴素和琥珀酸酐，先後加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯黴素加5毫升比例添加，小量製備可在封閉容器中水浴60℃、24h(大量製備則需要在在回流裝置中進行水浴60℃、24h)，生成含有羧基的氯黴素衍生物；B)將上述氯黴素衍生物置於離心管中，加入氯黴素原反應體積的5倍的冰冷5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉的轉速轉動10分鐘，析出含有羧基的氯黴素紅色產物，再用2倍體積的5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉澱2次，得到紫紅色沉澱物；C)向沉澱物中加入濃度為40％的乙醇溶液，沉澱物溶解後加入氯黴素重量50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應5分鐘後，加入氯黴素重量50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈手臂的氯黴素；D)在帶有碳鏈手臂的氯黴素中加入氯黴素重量20％的水溶性碳化二亞胺，反應10分鐘後，再加入氯黴素重量50倍重量的待偶聯的蛋白質進行偶聯反應，經過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯黴素-碳鏈-載體蛋白複合物，該複合物為一種氯黴素人工抗原。
實施例2一種氯黴素人工抗原的製備方法，其特徵在於採用以下步驟A)按重量比為1∶0.5分別稱取氯黴素和琥珀酸酐，先後加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯黴素加20毫升比例添加，小量製備可在封閉容器中水浴60℃、6h(大量製備則需要在在回流裝置中進行水浴60℃、6h)，生成含有羧基的氯黴素衍生物；B)將上述氯黴素衍生物置於離心管中，加入氯黴素原反應體積的10倍的冰冷1N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉的轉速轉動10分鐘，析出含有羧基的氯黴素紅色產物，再用10倍體積的1N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉澱3次，得到紫紅色沉澱物；C)向沉澱物中加入濃度為75％的乙醇溶液，沉澱物溶解後加入氯黴素重量20％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應10分鐘後，加入氯黴素重量30％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈手臂的氯黴素；D)在帶有碳鏈手臂的氯黴素中加入氯黴素重量50％的水溶性碳化二亞胺，反應5分鐘後，再加入氯黴素重量200倍重量的待偶聯的蛋白質進行偶聯反應，經過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯黴素-碳鏈-載體蛋白複合物，該複合物為一種氯黴素人工抗原。
實施例3一種氯黴素人工抗原的製備方法，其特徵在於採用以下步驟A)按重量比為1∶0.4分別稱取氯黴素和琥珀酸酐，先後加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯黴素加12毫升比例添加，小量製備可在封閉容器中水浴60℃、15h(大量製備則需要在在回流裝置中進行水浴60℃、15h)，生成含有羧基的氯黴素衍生物；
B)將上述氯黴素衍生物置於離心管中，加入氯黴素原反應體積的7倍的冰冷3N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉的轉速轉動10分鐘，析出含有羧基的氯黴素紅色產物，再用7倍體積的3N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉澱3次，得到紫紅色沉澱物；C)向沉澱物中加入濃度為55％的乙醇溶液，沉澱物溶解後加入氯黴素重量35％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應8分鐘後，加入氯黴素重量40％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈手臂的氯黴素；D)在帶有碳鏈手臂的氯黴素中加入氯黴素重量35％的水溶性碳化二亞胺，反應8分鐘後，再加入氯黴素重量120倍重量的待偶聯的蛋白質進行偶聯反應，經過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯黴素-碳鏈-載體蛋白複合物，該複合物為一種氯黴素人工抗原。
權利要求
1.一種氯黴素人工抗原的製備方法，其特徵在於採用以下步驟A)按重量比為1∶0.3～0.5分別稱取氯黴素和琥珀酸酐，先後加入到無水吡啶中，無水吡啶用量按1克氯黴素加5-20毫升比例添加，在封閉容器中或在回流裝置中水浴6-24h，生成含有羧基的氯黴素衍生物；B)將上述氯黴素衍生物置於離心管中，加入氯黴素原反應體積的5-10倍的冰冷1-5N鹽酸量，離心管以每分鐘1000轉的轉速轉動10分鐘，析出含有羧基的氯黴素紅色產物，再用2-10倍體積的1-5N鹽酸冰冷的鹽酸溶液離心洗滌沉澱2-3次，得到紫紅色沉澱物；C)向沉澱物中加入濃度為40～75％的乙醇溶液，沉澱物溶解後加入氯黴素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺EDAC，在常溫下反應5-10分鐘後，加入氯黴素重量30～50％的6-氨基己酸，生成帶有碳鏈手臂的氯黴素；D)在帶有碳鏈手臂的氯黴素中加入氯黴素重量20～50％的水溶性碳化二亞胺，反應5-10分鐘後，再加入氯黴素重量50-200倍重量的待偶聯的蛋白質進行偶聯反應，經過透析，除去未能偶合的自由小分子化合物，獲得氯黴素—碳鏈—載體蛋白複合物，該複合物為一種氯黴素人工抗原。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於蛋白質是指常規的可作免疫載體使用的可溶性蛋白質。
全文摘要
一種氯黴素人工抗原的製造方法，是將氯黴素溶於無水吡啶中，並加入琥珀酸酐，使氯黴素分子導入了羧基，加交聯劑EDAC和6－氨基己酸，使氯黴素衍生物中的羧基與6－氨基己酸中的氨基縮合，增長了碳鏈，然後與載體蛋白質進行偶聯，得到氯黴素—碳鏈—載體蛋白複合物，該複合物是一種氯黴素人工抗原。同現有技術比較，本發明的優點是偶聯方法簡便易行，將本氯黴素—碳鏈—載體蛋白複合物用於動物體氯黴素殘留量檢測及免疫檢測上，有助於提高檢測水平。
文檔編號A61K39/00GK1996016SQ20061015556
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月29日 優先權日2006年12月29日
發明者陳正賢, 鄔建敏, 葉興乾, 沈立榮, 吳建祥, 馬志超, 徐正 申請人:浙江大學