一種高靈敏度檢測氨苯喋啶類化合物的方法

2023-05-19 18:39:21 2

專利名稱：一種高靈敏度檢測氨苯喋啶類化合物的方法
技術領域：
本發明涉及一種氨苯喋啶類化合物的高靈敏度分析測定技術。具體地說涉及一種對氨苯喋啶進行高靈敏度分析檢測的液相色譜一螢光檢測方法。
氨苯喋啶為常用的排鈉保鉀類利尿劑，多年來臨床將其用於治療各種類型的水腫。但由於有人利用氨苯喋啶的利尿作用可加速體內藥物及人體體液的排洩，以此來掩飾其所服用的興奮劑或減輕運動員體重提高運動成績，故有關部門已將氨苯喋啶列為體育運動的違禁藥物。
氨苯喋啶類化合物的儀器分析主要有紫外分光光度法、氣相色譜法和液相色譜法，其中紫外分光光度法的操作最為簡便，但其靈敏度和專一性差，僅適用於進行一般藥物及製劑的質量控制常規的色譜法的大多具有較好的專一性，但其檢測靈敏度尚欠佳。目前在體育違禁藥物檢查中主要採用價格昂貴氣相色譜-質譜儀(GC-MS法)進行檢測，現行的GC-MS法系將藥物分子衍生化後和進一步裂介為碎片後進行檢測，需要對樣品進行一系列繁瑣複雜的預處理過程，故在氨苯喋啶類化合物的體內藥代研究中很少應用。
與氣相色譜法相比液相色譜法具有分離能力較強，樣品無需進行衍生化等優點，它在分析化學領域中得到廣泛的應用，但因液相色譜的檢測能力與其分離能力相比存在著較大差距，故尋找提高液相色譜檢測靈敏度的新方法是目前色譜分析方法研究的主要目的之一。
現行的GC-MS法系將藥物分子衍生化後進一步裂解為碎片後進行檢測，其檢測限約為5-10ng/ml尿樣。GC-MS法可提供有關該藥物的元素組成，分子量和斷裂碎片結構組成等大量信息，但對於與該藥物分子量一致，碎片結構相似的幹擾物質的鑑別尚有一定的局限。
本發明的目的是尋找出一種氨苯喋啶類化合物的高靈敏度檢測方法。
本發明利用氨苯喋啶分子為同時具有多個助色團的剛性大π結構，在酸性、中性和弱鹼性條件下均具有強烈的螢光的特點。液相色譜-螢光檢測法(HPLC-FLU法)，達到了高靈敏度檢測的效果。在本發明所檢測是未經衍生化的原形藥物並具有更高的檢測靈敏度。在HPLC-FLU法中其專一性主要有下列三種因素共同構成特定的HPLC色譜行為；特定的螢光激發、發射波長；特定的螢光效率(強度)。
分離步驟為(1)採用氰基鍵合矽膠作固定性。
(2)將乙腈∶水∶甲醇∶冰醋酸＝(5-15)∶(85-95)∶1∶(0.5∶1.5)作為流動相加壓流經進樣裝置、色譜柱、檢測器流出。
(3)配製氨苯喋啶類化合物的標準液。
(4)被測樣品先在酸性條件下用有機溶劑洗滌，水相在弱鹼和鹽析條件下用有機溶劑提取，除去有機溶劑。
(5)預處理後的樣品經流動相淋洗分離的各組分流經檢測器檢測。
本發明與現有技術相比具有如下優點1.採用液相色譜-螢光測定法檢測尿樣中氨苯喋啶的檢測限優於50Pg/ml。
2.樣品預處理過程簡單，不需經衍生化即可對生物樣品中痕量的氨苯喋啶類化合物進行檢測。
3.由於氨苯喋啶類化合物具有較強的螢光作用故檢測的專一性較強，可利於克服在檢測過程中其他成分的幹擾。
4.儀器設備簡單，尿樣取樣量少。
附圖簡要說明

圖1是氨苯喋啶最低檢測限色譜圖。
圖2是空白尿樣色譜圖。
圖3是含氨苯喋啶25pg/ml-2尿樣色譜圖。
圖4是含氨苯喋啶6.4ng/ml-2尿樣色譜圖。
圖5是不同含量的氨苯喋啶標準曲線圖。
圖6是健康志願者A一次口服300毫克氨苯喋啶後16天的尿樣色譜圖。
圖7是健康志願者B一次口服300毫克氨苯喋啶後17天的尿樣色譜圖。
本發明採用氨苯喋啶類化合物的液相色譜-螢光測定法(HPLC-FLU法)測定，通過以下步驟進行1.採用氰基鍵合矽膠作為固定相，螢光檢測波長激發波長(EX)＝360nm，發射波長(Em)＝436nm；2.氨苯喋啶類化合物標準液的配製，精密稱取氨苯喋啶40毫克，置100毫升棕色量瓶中，加入甲醇溶解並稀釋至刻度，即得濃度為0.4毫克、毫升-1的標準溶液，置4℃冰箱中；3.按氨苯喋啶的理化性質，採用先在酸環境中用混合有機溶劑洗滌，淨化尿樣後再在鹼性環境中進一步提取樣品預處理方法；4.將流動相加壓，使流動相乙腈∶冰∶甲醇∶冰醋酸(5∶15)∶(85-95)∶1∶(0.5-1.5)流經進樣裝置、色譜柱、檢測器後流出；5.將含有氨苯喋啶類化合物的試樣經由進樣裝置輸入色譜柱，分離後的組份隨著流動相逐一流過檢測器進一檢測，流速為1.0ml/分鐘。
6.定量計算實施例1氨苯喋啶(Triamterene)，化學名為2，4，7一三氨基-6-苯基-喋啶，結構式為
C12H11N7253.27
利用氨苯喋啶的理化特性，建立了尿樣中氨苯喋啶的高效液相色譜法-螢光檢測法(HPLC-FLU法)測定。
色譜分析條件為Alltima Cyano 100A(5μ)250mm×4.6mm；流動相為乙腈-水-甲醇-冰醋酸；流速為1.0ml·min-1；螢光檢測波長為Ex＝360nm，Em＝436nm。氨苯喋啶的保留時間為9.4分種。氨苯喋啶最低檢測限為2pg(S/N≥3∶1)，尿樣中氨苯喋啶的最低量檢測濃度為25pg·min-1。尿樣的提取方法我們參考了有關文獻資料，實驗結果如下尿樣中氨苯喋啶在0.0250～0.8000ng·ml-1(γ＝0.9999，n＝12)與0.8000～25.60ng·ml-1(γ＝0.9999，n＝12)範圍內呈良好的線性關係。平均天內精密度為2.24％(0.0250～0.8000ng·ml-1)和1.65％(0.8000～25.60ng·ml-1)；平均天內精密度為6.80％(0.0250～0.8000ng·ml-1)和3.41％(0.8000～25.60ng·ml-1)。平均絕對回收率為99.27％。(0.0250-0.8000ng·ml-1)和99.49％(0.8000～25.60ng·ml-1)平均絕對回收率為89.27％。
實驗方法一、儀器與試劑1.儀器(1) 高效液相色譜儀LC-10AT日本島津(Shimadzu)公司(2) 六通進樣閥7725 美國Rheodyne公司(3) 螢光檢測器RF-551 日本島津(Shimadzu)公司(4) 色譜數據處理機CDP-4S 上海五豐電液成套工程有限公司(5) 旋渦混合器XW-80A 上海醫科大學儀器廠(6) 超聲波清洗器CQ50 上海超聲波儀器廠(7) 離心沉澱器80-2型 上海手術器械廠(8) 臺式離速離心機TGL-16G上海醫用分析儀器廠
2.試劑(1) 氨苯喋啶 上海集成藥廠(2) 氨苯喋啶片上海集成藥廠(3) 乙醚(分析純) 上海馬陸製藥廠(使用前需經重蒸餾)(4) 正丁醇(分析純)瓶窯醫藥化工試劑廠(5) 鹽酸(分析純) 太倉教育試劑廠(6) 無水硫酸鈉(分析純)上海金山化工廠(7) 碳酸氫鈉(分析純) 上海虹光化工廠(8) 碳酸鉀(分析純)常熟化工廠(9) 乙腈(HPLC純) 中科院上海腦研究所上海腦海生物科技公司(10) 冰醋酸(分析純)上海市東懿實業公司化學試劑分公司(11) 甲醇(HPLC純) 上海化學試劑研究所(12) 實驗中所用水為超純水 上海測試技術研究所(13) 過飽和碳酸氫鈉-碳酸鉀緩衝液(pH＝9.5)的配製將碳酸氫鈉、碳酸鉀按質量比2∶1加入200ml水中，至過量析出，即得。
3.氨苯喋啶貯備溶液的配製精密稱取氨苯喋啶對照品40mg，置100ml棕色量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度。即得濃度為0.4mg·ml-1的貯備溶液，置4℃冰箱中保存。二、色譜條件1.色譜柱Alltima Cyano 100A(5μ)250mm×4.6mm，美國Alltech公司。
2.流動相乙腈∶水∶甲醇∶冰醋酸(8∶90∶1∶1)。
3.螢光檢測波長激發波長(EX)＝360nm，發射波長(Em)＝436nm。
4.流速1.0ml·min-1。三、尿樣預處理方法取尿樣1.0ml置10ml尖底玻璃離心管中，加2mol·L-1HCL液100μl，旋渦振蕩，混勻，用乙醚∶正丁醇(10∶1)混合液3ml洗滌2次。洗滌方法為旋渦振蕩1分鐘，置超聲波清洗器中水浴超聲處理1分鐘，反覆3次，離心(2000g×5分鐘)，使兩相分層，棄去上層有機相。在水相中加過飽和碳酸氫鈉-碳酸鉀緩衝液(pH＝9.5)500μl，加無水硫酸鈉0.75g，旋渦振蕩，混勻，用乙醚∶正丁醇(10∶1)混合液4ml提取2次。提取方法為旋渦振蕩1分鐘，水浴超聲處理1分鐘，反覆3次，離心(2000g×5分鐘)，使兩相分層，合併上層有機相，置10ml尖底玻璃離心管中，在80℃水浴下用氮氣吹乾。加流動相100μl溶解殘渣後，移取溶解液置1.5ml塑料具塞離心管中，高速離心(19000g×2分鐘)。取20μl注入高效液相色譜儀。四、定量計算根據樣品峰與標準峰的峰高比值計算樣品濃度。Ci=CsHiHs]]>Cs標準樣品濃度；Hi被測樣品峰高；Hs標準樣品峰高。五、檢測限取每1ml中含氨苯喋啶100pg的甲醇溶液20μl注入高效液相色譜儀，所得色譜圖見圖1，其信噪比優於3，故可認為測定氨苯喋啶的最低檢測限為2pg。分別取空白尿樣和每1ml中含氨苯喋啶25pg的尿樣各1ml，按尿樣預處理方法提取後，進樣20μl，所得色譜圖見圖2、3、4，故氨苯喋啶最低定量檢測濃度為25pg·ml-1。六、標準曲線在空白尿樣中加入不同量的氨苯喋啶標準液，配成濃度為每1ml中含氨苯喋啶0.0250、0.0500、0.1000、0.2000、.04000、0.8000、1.600、3.200、6.400、12.80、25.60ng的尿樣，按尿樣預處理方法處理後進樣。求出氨苯喋啶的峰高值(H)與氨苯喋啶的濃度(C)的回歸方程，結果如下表1、圖5。
表1線性範圍試驗0 0250～0.8000ng·ml-1C＝0.0003+1.403×10-4H，γ＝0.9999，(n＝12)C(ng·ml-1) 0.0250 0.0500 0.1000 0.20000.40000.8000H±SD173.0±8.718 350.3±13.97 717.0±10.21 1432±44.33 2842±43.895705±224.60.8000～25.60ng·ml-1C＝-0.0289+1.424×10-4H，γ＝0.9999，(n＝12)C(ng·ml-1) 0.8000 1.6003.2006.400 12.80 25.60H±SD 5705±224.6 11536±641.1 22286±994.7 44421±1069 92061±2461 179297±5352氨苯喋啶在0.0250～0.8000ng·ml-1和0.8000～25.60ng·ml-1範圍內線性關係良好。七、精密度與回收率1.天內精密度在空白尿樣中加入不同量的氨苯喋啶標準液，配成濃度為每1ml中含氨苯喋啶0.0250、0.0500、0.1000、0.2000、0.4000、0.8000、1.600、3.200、6.400、12.80、25.60ng的尿樣各六份，在同一天內按尿樣處理預處理方法處理後進樣。結果如表2。
表2 天內精密度試驗0.0250～0.8000ng/ml加入量測定量(ng·ml-1)(ng·ml-1) I II IIIIV V VIX±SDRSD(％)0.0250 0.02280.02300.02340.02380.02380.02410.0235±0.0005 2.160.0500 0.04670.04690.04720.04790.04860.05140.0481±0.0017 3.650.1000 0.09940.09970.10020.10080.10160.10250.1007±0.0012 1.170.2000 0.19300.19640.20350.20580.20780.21000.2027±0.0067 3.300.4000 0.38970.39820.40080.40470.40590.40870.4013±0.0068 1.700.8000 0.78730.78990.79270.80070.80490.81850.7990±0.0116 1.46
0.8000～25.60ng/ml加入量 測定量(ng·ml-1)(ng·ml-1)III III IVV VI X±SD RSD(％)0.8000 0.7673 0.7698 0.7726 0.7805 0.7847 0.7981 0.7788±0.01151.481.600 1.5831.6331.6431.6451.6511.6571.635±0.027 1.643.200 3.0593.1513.1963.2113.2343.2473.183±0.069 2.186.400 6.2336.2356.2916.3076.3496.3746.298±0.058 0.9212.80 12.5812.7613.0213.1213.1513.2313.19±0.28 1.9525.60 24.9325.2525.4525.6125.9226.1525.55±0.44 1.742.天間精密度在空白尿樣中加入不同量的氨苯喋啶標準液，配成濃度為每1ml中含氨苯喋啶0.0250、0.0500、0.1000、0.2000、0.4000、0.8000、1.600、3.200、6.400、12.80、25.60ng的尿樣各六份，分別在六天內按尿樣預處理方法處理後進樣。結果如表3。
表3 天間精密度試驗0.0250～0.8000ng/ml加入量 測定量(ng·ml-1)(ng·ml-1) I IIIII IV V VI X±SDRSD(％)0.0250 0.0204 0.02510.03190.02770.01810.03020.0256±0.005521.340.0500 0.0476 0.05030.05590.05160.04430.05470.0507±0.00438.570.1000 0.0963 0.10180.10420.10120.09900.10380.1011±0.00302.960.2000 0.2039 0.20220.19670.19810.20720.19140.1999±0.00562.830.4000 0.4154 0.39340.37530.39340.41700.38850.3972±0.01624.070.8000 0.7922 0.80310.81120.80400.79030.80680.8013±0.00831.03
0.8000～25.60ng/ml-1加入量測定量(ng·ml-1)(ng·ml-1) I II III IV VVI X±SDRSD(％)0.8000 0.7816 0.7713 0.6471 0.8599 0.8387 0.8422 0.7901±0.07859.941.600 1.5331.6151.5701.6051.5561.6771.593±0.051 3.223.200 3.0943.1253.0632.9873.1173.2473.105±0.085 2.756.400 6.3406.3126.3926.1346.4366.1726.298±0.121 1.9112.80 13.2613.1213.4613.5212.9112.8413.19±0.28 2.1225.60 25.3925.4825.2825.3225.5625.6325.44±0.14 0.543.相對回收率在空白尿樣中加入不同量的氨苯喋啶標準液，配成濃度為每1ml中含氨苯喋啶0.0250、0.0500、0.1000、0.2000、0.4000、0.8000、1.600、3.200、6.400、12.80、25.60ng的尿樣，按尿樣預處理方法處理後進樣。計算出測定量與加入量的比值，即為相對回收率。結果如表4。
表4 相對回收率度試驗0.0250～0.8000ng·ml-1加入量(ng·ml-1) 0.02500.05000.10000.20000.40000.8000I 91.30 93.48 99.38 96.52 97.43 94.82相II91.86 93.78 99.66 98.22 99.56 98.74III 93.56 94.33 100.23101.76100.1999.09對IV95.26 95.74 100.79102.89101.18100.08V 95.26 97.15 101.64103.88101.47100.61VI96.39 102.81102.49105.01102.17102.31回VII 81.70 95.27 96.26 101.96103.8499.02VIII 100.58100.59101.85101.0998.36 100.38收IX127.71111.88104.2298.33 93.83 101.40X 110.79103.15101.2299.04 98.35 100.51率XI72.29 88.51 98.98 103.62104.3598.79XII 120.70109.41103.7695.70 97.11 100.85(％)平均相對回收率(％) 98.12 98.84 100.87100.6799.81 100.02X±SD ±15.42±6.91±2.19±3.04±3.00±1.21RSD(％) 15.71 6.99 2.17 3.02 3.01 1.21
0.8000～25.60ng/ml加入量(ng·ml-1) 0.8000 1.6003.200 6.400 12.80 25.60I 95.91 98.9495.58 97.39 98.27 96.64相 II 96.22 102.08 98.46 97.42 99.66 98.64III96.57 102.69 99.86 98.30 101.75 98.65對 IV 97.56 102.80 100.35 98.55 102.52 99.27V 98.08 103.18 101.06 99.21 102.75 100.47VI 99.77 103.59 101.48 99.60 103.39 101.35VII97.69 95.8096.69 99.07 103.60 99.20VIII 96.41 100.91 97.67 98.62 102.49 99.55IX 80.89 98.1295.72 99.87 105.64 98.77X 107.49 100.34 93.33 95.84 105.64 98.15XI 104.83 97.2597.39 100.56 100.87 99.06XII105.28 104.82 101.45 96.43 100.35 100.10(％)平均相對回收率(％) 98.06 100.88 98.25 98.41 102.21 99.15X±SD ±6.73 ±2.81 ±2.64 ±1.41±2.17 ±1.19RSD(％) 6.862.79 2.691.43 2.121.204.絕對回收率(1)標準樣品的配製分別取0.0250、0.0500、0.1000、0.2000、0.4000、0.8000、1.600、3.200、6.400、12.80、25.60ng·ml-1的氨苯喋啶標準溶液20μl，不經提取直接進樣，得標準樣品峰高(H1)。
(2)提取樣品的配製在空白尿樣中加入不同量的氨苯喋啶標準液，配成濃度為每1ml中含氨苯喋啶0.0250、0.0500、0.1000、0.2000、0.4000、0.8000、1.600、3.200、6.400、12.80、25.60ng的尿樣，按尿樣預處理方法處理後進樣，得提取樣品峰高(H2)。
按下列公式計算絕對回收率，結果見表5。
表5絕對回收率試驗加入(ng·ml-1) 0.02500.0500 0.1000 0.2000 0.4000 0.8000 1.6003.2006.400 12.8025.60H1 198 392 812 1638 32266012116722335226952 95808190772H2 176 254 726 1462 28885426101892055242592 85592169555絕對回收率(％) 88.89 90.3189.4189.26 89.52 90.25 87.2988.0190.56 89.4489.03採用本法在健康志意者一次口服300mg氨苯喋啶後16～17天的尿樣中尚可檢測到氨苯喋啶，見圖6、圖7。
權利要求
1.一種氨苯喋啶類化合物的液相色譜-螢光檢測方法包括(1)採用氰基鍵合矽膠作固定相；(2)將流動相加壓，使流經進樣裝置、色譜柱、檢測器流出；(3)配製氨苯喋啶類化合物的標準液；(4)被測樣品進行預處理；(5)預處理尿樣樣品經進樣裝置進入色譜柱；(6)預處理後的樣品經流動相淋洗分離的各組分流經檢測器檢測。
2.根據權利要求1所述液相色譜-螢光檢測方法，其特徵在於尿樣品先在酸性條件下用有機溶劑洗滌，水相在弱鹼和鹽析條件下用有機溶劑提取。
3.根據權利要求1所述液相色譜-螢光檢測方法，其特徵在於流動相為乙腈∶水∶甲醇∶冰醋酸＝(5-15)∶(85-95)∶1∶(0.5-1.5)。
全文摘要
本發明採用氰基鍵合矽膠為固定相,乙腈∶水∶甲醇∶冰醋酸作為流動相,對經預處理後的氨苯喋啶類化合物進行檢測。建立了氨苯喋啶的高效液相色譜一螢光檢測法。
文檔編號G01N30/00GK1260487SQ9812289
公開日2000年7月19日 申請日期1998年12月30日 優先權日1998年12月30日
發明者餘琛, 張慧, 朱大元, 楊一鳴, 羅文安, 曾繁輝 申請人:上海市徐匯區中心醫院, 中國科學院上海藥物研究所, 上海體育運動技術學院