一種一步還原沉積石墨烯/苯硼酸複合物用於葡萄糖檢測的方法與流程
2023-05-19 18:41:52 7
本發明涉及一種一步還原沉積石墨烯的技術，尤其涉及一種一步還原沉積石墨烯/苯硼酸複合物用於葡萄糖檢測的方法。
背景技術：
氧化石墨烯具有大量的羧基可用於共價固定敏感物質，從而實現生化檢測，但因較差電學性能限制了其在電化學傳感中的應用。石墨烯具有大的比表面積、高的導電性和室溫電子遷移率，電化學穩定性好，電荷傳遞電阻小等優點。氧化石墨烯可以通過化學、電化學、熱還原等技術轉化成還原氧化石墨烯(兼具石墨烯的性能)，提高其導電性與傳感性。此外電化學生物傳感的另一重要部分是修飾電極，電化學沉積通過循環電位電化學氧化還原方法，在電極表面可以形成穩定性好功能膜，具有重複性高、魯棒性好等優點。電化學分析領域常用的傳統電極有玻碳電極、金電極、鉑電極等，這些電極的主要缺點在於生產成本高，通常需要複雜的前處理過程。而絲網印刷電極作為電化學分析的基礎電極，具有能批量生產，可一次性使用，成本較低等優勢，更利於可攜式電化學生物傳感器的開發。本發明通過一步法同步實現還原與沉積石墨烯在印刷電極表面，通過不同的特異性修飾，可實現穩定性好、靈敏度高的生化檢測。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種一步法還原沉積石墨烯的技術，尤其涉及一種一步法還原沉積石墨烯/苯硼酸複合物用於葡萄糖檢測的方法。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種一步還原沉積石墨烯/苯硼酸複合物用於葡萄糖檢測的方法，該方法在阻抗檢測系統上實現，所述阻抗檢測系統包括：絲網印刷電極測試系統(1)、電化學阻抗測試工作站(13)以及顯示器(18)；絲網印刷電極測試系統(1)包含樣品池(2)、密封圈(3)、碳工作電極(4)、碳對電極(5)、銀/氯化銀參比電極(6)、絕緣防水層(7)、導電銀層(8)、電極轉換插口(9)、對電極接口(10)、工作電極接口(11)、參比電極接口(12)；樣品池(2)中空結構，放置於碳工作電極(4)上方，通過密封圈(3)與碳工作電極(4)密封連接；其中對電極接口(10)、工作電極接口(11)、參比電極接口(12)分別與電化學阻抗測試工作站(13)的測試對電極接口(14)、測試工作電極接口(15)、測試參比電極接口(16)通過導線相連。電化學測試工作站(13)則通過電源連接線(17)與顯示器(18)相連，實現數據的實時監測；該方法包括以下步驟：
(1)製備絲網印刷電極測試系統(1)，製備碳-碳-銀/氯化銀三電極，以及外設裝置，具體包括以下步驟：
(1.1)選材：聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)作為軟性材料基底，電極油墨分別為碳油墨、銀油墨、銀/氯化銀油墨；
(1.2)在PET基底上印刷導電銀油墨，形成寬1mm的電極條，作為導電銀層(8)，並在120℃烘箱內熱固化30min；
(1.3)印刷絕緣油墨覆蓋中間導電部分，形成絕緣防水層(7)，並在80℃烘箱內熱固化10min；
(1.4)印刷導電碳油墨，分別形成直徑5mm的碳工作電極(4)和圓弧狀碳對電極(5)，寬度為1mm，並在80℃烘箱內熱固化20min；
(1.5)印刷銀/氯化銀油墨，形成圓弧狀銀/氯化銀參比電極(6)，寬度為1mm，並在80℃烘箱內熱固化10min。最後得到的絲網印刷電極面積為18mm*6mm(長*寬)，其中碳工作電極(4)的直徑為5mm。
(1.6)在導電銀層(8)的末端設置電極轉換插口(9)，使得印刷電極的三電極方便的與電化學工作站連接；碳工作電極(4)上方通過密封圈(3)固定中空結構的樣品池(2)，保證溶液在固定的電極範圍內反應，密封圈(3)一方面用來保證反應液體集中在工作電極中心，一方面防止液體外流，影響檢測結果。
(2)氧化石墨烯/苯硼酸複合物合成，具體包括以下子步驟：
(2.1)前置液的配製：配置濃度為1mg/mL的氧化石墨烯3mL，濃度為2mg/mL的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)1.5mL，濃度為3mg/mL的NHS(N-羥基琥珀亞胺)1.5mL，濃度為1mg/mL的苯硼酸4mL，上述溶劑均為去離子水；
(2.2)氧化石墨烯/苯硼酸複合物合成；取上述配好的氧化石墨烯3mL於一容積為15mL的離心管中，加入1.5mL的EDC，振蕩器振蕩2min，冰水浴超聲1h，使氧化石墨烯中的羧基充分被EDC活化，利於後續複合物合成；取上述配好的苯硼酸4mL加入超聲後的溶液中，振蕩器振蕩2min，加1.5mL的NHS作為脫水縮合的保護劑，再次振蕩2min，放入冰箱靜至4h，完成複合物製備，最終該複合物總量為10mL。
(3)一步法還原沉積石墨烯/苯硼酸於印刷電極，具體包括以下子步驟：
(3.1)電極活化：取10uL飽和硫酸鈉溶液作為電極活化電解液於絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，利用電化學循環伏安法對印刷電極進行活化，電壓範圍為-1.2V至+1.2V，掃描步徑為50mV/s，掃描圈數為10圈，得到經過活化的印刷電極；
(3.2)取5uL步驟(2.2)製備的氧化石墨烯/苯硼酸複合物於絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，再加入5uL飽和硫酸鈉溶液作為電解液，利用電化學循環伏安法對活化後的印刷電極進行特異性修飾，電壓範圍為-1.2V至+1.2V，掃描步徑為50mV/s，掃描圈數為40圈，得到修飾了還原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷電極；
(4)葡萄糖特異性檢測，具體包括以下子步驟：
(4.1)標準溶液制配：配製濃度分別為0.1mM,0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM的葡萄糖標準溶液，溶劑為去離子水；
(4.2)葡萄糖電化學阻抗檢測：使用步驟(3.2)得到的修飾了還原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷電極，將5uL的0.1mM的葡萄糖標準溶液滴加在絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，利用電化學阻抗檢測方法對該濃度下對應的阻抗圖譜進行檢測；0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM濃度的葡萄糖阻抗檢測同上；
(4.3)數據處理：按照等效電路，提取電極表面的轉移電阻Rct的值，對阻值數據進行歸一化處理，得到歸一化處理結果NIC與葡萄糖濃度的標準曲線；歸一化的具體計算公式：NIC＝(Za-Zb)/Zb，其中Za代表葡萄糖溶液測試結果，Zb代表將去離子水作為待測溶液的空白對照結果；
(4.4)將待測濃度的葡萄糖溶液根據步驟(4.2)得到阻抗圖譜，根據步驟(4.3)得到阻值數據的歸一化處理，帶入步驟(4.3)建立的標準曲線中，得到待測葡萄糖溶液的濃度。
本發明的有益效果是：
1、本發明首次通過一步法同步實現還原與沉積石墨烯在印刷電極表面，利用電化學沉積的方法，具體是通過循環電位電化學氧化還原方法，在電極表面形成穩定性好的功能膜，具有重複性高、魯棒性好等優點，大大提升了電極修飾的穩定性和靈敏性，簡化修飾過程，實現了無毒、綠色、以及高效的修飾過程。
2、氧化石墨烯具有大量的羧基可用於共價固定敏感物質，從而廣泛應用於生化檢測，但氧化石墨烯因較差電學性能限制了其在電化學傳感中的應用；石墨烯具有大的比表面積、高的導電性和室溫電子遷移率，電化學穩定性好，電荷傳遞電阻小等優點，但生物敏感性差。本發明通過綠色環保的電化學還原的方法，實現了還原氧化石墨烯的製備，該製備好的還原氧化石墨烯兼具氧化石墨烯與石墨烯的特性，即有良好的生物敏感性又有高效的電子轉移效率，擴展了在電化學測試中的應用。
4、利用一步還原沉積的電化學循環伏安法，製備了重複性好、穩定性高、靈敏度高以及修飾了還原氧化石墨烯/苯硼酸複合物的印刷電極，在不同濃度下的葡萄糖電化學阻抗測試中展現出良好的線性。
5、構建了基於絲網印刷電極的電化學分析，絲網印刷電極具有能批量生產，可一次性使用，成本較低等優勢，更利於可攜式電化學生物傳感器的開發。
6、利用苯硼酸特異性與葡萄糖結合的特性，使用經上述方法製備的還原氧化石墨烯/苯硼酸特異性修飾的印刷電極用於葡萄糖檢測，展現良好的穩定性和靈敏性。
7、該方法操作簡便、檢測穩定性好、通用性強、易於推廣使用。
附圖說明
圖1是本發明所使用的檢測系統的結構圖；
圖2是氧化石墨烯/苯硼酸複合物製備的示意圖；
圖3是苯硼酸檢測葡萄糖的原理示意圖；
圖4是硫酸鈉電解液激活印刷電極的結果圖；
圖5是氧化石墨烯/苯硼酸複合物在電極表面沉積還原的過程圖；
圖6是氧化石墨烯/苯硼酸的掃描電鏡結果圖；
圖7是還原氧化石墨烯/苯硼酸的掃描電鏡結果圖；
圖8是還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾電極前後的結果對比圖；
圖9是常用電化學阻抗測試等效電路圖；
圖10是還原氧化石墨烯/苯硼酸等效電路圖；
圖11是系統阻抗測試等效電路圖；
圖12是還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾電極後的葡萄糖阻抗檢測結果；
圖13是還原氧化石墨烯/苯硼酸對應不同濃度下等效阻抗結果圖；
圖14是還原氧化石墨烯/苯硼酸對應歸一化阻抗結果圖；
圖15是氧化石墨烯/苯硼酸修飾電極後的葡萄糖阻抗檢測結果；
圖16是氧化石墨烯/苯硼酸對應不同濃度下等效阻抗結果圖；
圖17是氧化石墨烯/苯硼酸對應歸一化阻抗結果圖；
圖18是還原氧化石墨烯/苯硼酸與氧化石墨烯/苯硼酸修飾電極的對比阻抗譜圖；
圖19是還原氧化石墨烯/苯硼酸與氧化石墨烯/苯硼酸修飾電極的對比的具體阻抗值統計結果柱狀圖；
圖20是單獨還原氧化石墨烯修飾電極測試葡萄糖的結果圖；
圖21是單獨氧化石墨烯修飾電極測糖的歸一化阻抗結果；
圖22是還原氧化石墨烯/苯硼酸與還原氧化石墨烯修飾電極的對比阻抗值統計結果柱狀圖；
圖23是還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾電極用於不同物質的測試的阻抗結果統計柱狀圖。
圖中，絲網印刷電極測試系統1、樣品池2、密封圈3、碳工作電極4、碳對電極5、銀/氯化銀參比電極6、絕緣防水層7、導電銀層8、電極轉換插口9、對電極接口10、工作電極接口11、參比電極接口12、電化學阻抗測試工作站13、測試對電極接口14、測試工作電極接口15、測試參比電極接口16、電源連接線17、顯示器18。
具體實施方式
以下結合附圖及具體實施例對本發明作詳細描述，但並不是限制本發明。
本發明提供的一種一步還原沉積石墨烯/苯硼酸複合物用於葡萄糖檢測的方法，該方法在阻抗檢測系統上實現，所述阻抗檢測系統包括：絲網印刷電極測試系統(1)、電化學阻抗測試工作站(13)以及顯示器(18)；絲網印刷電極測試系統(1)包含樣品池(2)、密封圈(3)、碳工作電極(4)、碳對電極(5)、銀/氯化銀參比電極(6)、絕緣防水層(7)、導電銀層(8)、電極轉換插口(9)、對電極接口(10)、工作電極接口(11)、參比電極接口(12)；樣品池(2)中空結構，放置於碳工作電極(4)上方，通過密封圈(3)與碳工作電極(4)密封連接；其中對電極接口(10)、工作電極接口(11)、參比電極接口(12)分別與電化學阻抗測試工作站(13)的測試對電極接口(14)、測試工作電極接口(15)、測試參比電極接口(16)通過導線相連。電化學測試工作站(13)則通過電源連接線(17)與顯示器(18)相連，實現數據的實時監測；該方法包括以下步驟：
(1)製備絲網印刷電極測試系統(1)，製備碳-碳-銀/氯化銀三電極，以及外設裝置，具體包括以下步驟：
(1.1)選材：聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)作為軟性材料基底，電極油墨分別為碳油墨、銀油墨、銀/氯化銀油墨；
(1.2)在PET基底上印刷導電銀油墨，形成寬1mm的電極條，作為導電銀層(8)，並在120℃烘箱內熱固化30min；
(1.3)印刷絕緣油墨覆蓋中間導電部分，如圖1，形成絕緣防水層(7)，並在80℃烘箱內熱固化10min；
(1.4)印刷導電碳油墨，如圖1，分別形成直徑5mm的碳工作電極(4)，和圓弧狀碳對電極(5)，寬度為1mm，並在80℃烘箱內熱固化20min；
(1.5)印刷銀/氯化銀油墨，如圖1，形成圓弧狀銀/氯化銀參比電極(6)，寬度為1mm，並在80℃烘箱內熱固化10min。最後得到的絲網印刷電極面積為18mm*6mm(長*寬)，其中碳工作電極(4)的直徑為5mm；
(1.6)在導電銀層(8)的末端設置電極轉換插口(9)，使得印刷電極的三電極方便的與電化學工作站連接；碳工作電極(4)上方通過密封圈(3)固定中空結構的樣品池(2)，保證溶液在固定的電極範圍內反應，密封圈(3)一方面用來保證反應液體集中在工作電極中心，一方面防止液體外流，影響檢測結果。
(2)氧化石墨烯/苯硼酸複合物合成，具體包括以下子步驟：
(2.1)前置液的配製：配置濃度為1mg/mL的氧化石墨烯3mL,濃度為2mg/mL的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)1.5mL，濃度為3mg/mL的NHS(N-羥基琥珀亞胺)1.5mL，濃度為1mg/mL的苯硼酸4mL，上述溶劑均為去離子水；濃度配比原則：氧化石墨烯與苯硼酸質量濃度一致，苯硼酸與氧化石墨烯的體積比為4:3，以保證苯硼酸可以與氧化石墨烯的充分結合；EDC與NHS的質量濃度比為2:3，體積比為1:1，以保證氨基、羧基脫水縮合充分反應；EDC的質量濃度與氧化石墨烯的質量濃度之比為2:1，保證羧基活化的充分反應；
(2.2)氧化石墨烯/苯硼酸複合物合成：原理如圖2，取上述配好的氧化石墨烯3mL於一容積為15mL的離心管中，加入1.5mL的EDC，振蕩器振蕩2min，冰水浴超聲1h，使氧化石墨烯中的羧基充分被EDC活化，利於後續複合物合成；取上述配好的苯硼酸4mL加入超聲後的溶液中，振蕩器振蕩2min，加1.5mL的NHS作為脫水縮合的保護劑，再次振蕩2min，放入冰箱靜至4h，完成複合物製備，最終該複合物總量為10mL，苯硼酸測糖的原理如圖3。
(3)一步法還原沉積石墨烯/苯硼酸於印刷電極，具體包括以下子步驟：
(3.1)電極活化：取10uL飽和硫酸鈉溶液作為電極活化電解液於絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，利用電化學循環伏安法對印刷電極進行活化，電壓範圍為-1.2V至+1.2V，掃描步徑為50mV/s，掃描圈數為10圈，得到經過活化的印刷電極，用於後續電極修飾和測試，結果如圖4所示；
(3.2)取5uL步驟(2.2)製備的氧化石墨烯/苯硼酸的複合物於絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，再加入5uL飽和硫酸鈉溶液作為電解液，利用電化學循環伏安法對印刷電極進行特異性修飾，電壓範圍為-1.2V至+1.2V，掃描步徑為50mV/s，掃描圈數為40圈，至此得到修飾了還原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷電極，結果如圖5，相較於圖4隻有硫酸鈉存在的條件可知，0.7V附近出現的電流峰是由於氧化石墨烯的存在而產生的，與此同時可以觀察到在0.7V附近處有一明顯的還原峰出現，且隨著反應的進行，峰電流逐漸減小，說明氧化石墨烯在逐漸被還原成石墨烯；
(3.3)其中印刷電極的對電極接口(10)、工作電極接口(11)、參比電極接口(12)分別接到電化學阻抗測試工作站(13)的測試對電極接口(14)、測試工作電極接口(15)、測試參比電極接口(16)，在顯示器(18)中可以實時觀察檢測結果；
(3.4)為探究一步法電化學還原沉積於物理沉積的效果對比以及還原氧化石墨烯與氧化石墨烯在電子傳遞中效果對比，5uL的氧化石墨烯/苯硼酸複合物直接滴塗在碳工作電極(4)的表面上，在室溫乾燥24h，得到氧化石墨烯/苯硼酸修飾了的印刷電極，圖6可以看出，還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾的電極表面粗糙，更有利於檢測物質吸附，相比之下，圖7氧化石墨烯/苯硼酸修飾的電極表面比較平整，穩定性差，易產生大塊脫落現象，修飾不穩固；如圖8所示，修飾後的電極，電阻相較於修飾前大大減小，降低了基礎阻抗值，提升了電極檢測的靈敏性。
(4)葡萄糖特異性檢測，具體包括以下子步驟：
(4.1)標準溶液制配：配製濃度分別為0.1mM,0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM的葡萄糖標準溶液，溶劑為去離子水；
(4.2)葡萄糖電化學阻抗檢測：使用步驟(3.2)得到的修飾了還原氧化石墨烯/苯硼酸的印刷電極，將5uL的0.1mM的葡萄糖標準溶液滴加在絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，利用電化學阻抗檢測方法對該濃度下對應的阻抗圖譜進行檢測；0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM濃度的葡萄糖阻抗檢測同上；
(4.3)為探究苯硼酸對葡萄糖特異性檢測的影響，利用(3.1)中提及的一步法還原沉積修飾電極的方法，單純取5uL氧化石墨烯溶液，滴加在絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，再加入5uL飽和硫酸鈉溶液作為電解液，利用電化學循環伏安法對印刷電極進行特異性修飾，電壓範圍為-1.2V至+1.2V，掃描步徑為50mV/s，掃描圈數為40圈，至此得到單純修飾了還原氧化石墨烯的印刷電極，並利用該電極，參照(4.2)的檢測方法對0.1mM,0.2mM,0.5mM,1.0mM,2.0mM,5.0mM,10.0mM,20.0mM和50mM的葡萄糖標準溶液分別進行測試；阻抗圖譜結果如圖20所示，數據提取結果如圖21所示，可以看出單純還原氧化石墨烯修飾的電極對葡萄糖的檢測並不具有特異性，因此可以排除還原氧化石墨烯對實驗結果的影響。
(4.4)葡萄糖特異性檢測：配製濃度均為10mM的氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)、穀氨酸(Glutamic acid)、半胱氨酸(Cysteine)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、抗壞血酸(Ascorbic acid)、多巴胺(Dopamine)以及尿素(Urea)；使用(3.1)還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾好的印刷電極，分別取上述溶液5uL加入加在絲網印刷電極測試系統(1)的樣品池(2)中，利用電化學阻抗檢測方法對該物質對應的阻抗圖譜進行檢測；圖23的統計結果可以展示出該還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾的電極在對葡萄糖的檢測具有良好的特異性。
(4.5)數據處理：按照等效電路，提取電極表面的轉移電阻Rct的值，對阻值數據進行歸一化處理，得到歸一化處理結果NIC與葡萄糖濃度的標準曲線；歸一化的具體計算公式：NIC＝(Za-Zb)/Zb，其中Za代表葡萄糖溶液測試結果，Zb代表將去離子水作為待測溶液的空白對照結果；圖9、10、11展示了系統的等效電阻模型；圖12為還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾好的印刷電極對不同濃度葡萄糖檢測的阻抗圖譜；圖13是提取提取電極表面的「Rct(轉移電阻)」的值在不同濃度下的值；
(4.6)將待測濃度的葡萄糖溶液根據步驟(4.2)得到阻抗圖譜，根據步驟(4.3)得到阻值數據的歸一化處理，帶入步驟(4.3)建立的標準曲線中，得到待測葡萄糖溶液的濃度。圖14是阻抗歸一化結果，可以看出該還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾的電極在0.1—50mM濃度範圍的葡萄糖檢測具有良好的線性，濃度與歸一化阻抗處理結果NIC之間的關係式為y＝0.7448x+0.7320，R2＝0.9577，檢測下限為0.03mM；圖15是氧化石墨烯/苯硼酸未經過一步法還原沉積，而是通過滴塗法修飾印刷電極用於葡萄糖阻抗檢測的結果，從圖16、和圖17可以看出，滴塗法不穩定，在高濃度葡萄糖檢測的過程中極易出現大片脫落現象，濃度與歸一化阻抗處理結果NIC之間的關係式為y＝0.0586x+0.1225，R2＝0.8737，與圖14的結果相比，檢測靈敏度低，通過圖18的對比可以明顯看出，還原氧化石墨烯/苯硼酸修飾的電極相比於氧化石墨烯/苯硼修飾的電極，具有基礎阻抗低，檢測靈敏度高等優點，具體阻值對比可參看圖19的統計結果；待測葡萄糖溶液的歸一化處理結果NIC為14.57，帶入圖14的關係式y＝0.7448x+0.7320中，計算出葡糖糖溶液的濃度為11.58mM，與實際濃度12mM相比誤差率為3.5％，小於5％，說明該測試系統具有良好的準確性。