漢黃芩素在製備治療白血病藥物中的應用的製作方法

2023-05-20 04:53:46 1

專利名稱：漢黃芩素在製備治療白血病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於製藥領域，涉及漢黃芩素在製備治療白血病藥物中的應用。
背景技術：
白血病是起源造血系統的、以骨髓或其他造血組織中產生和積聚大量幼稚和異常白細胞為特點的惡性疾病。從形式看白血病細胞大多數是未成熟和形態異常的白細胞；在功能上，白血病細胞有著與腫瘤細胞相同的特點白血病細胞呈腫瘤性增殖，無法控制，常導致骨髓造血功能的抑制和衰竭，致病人出現貧血、中性粒細胞和血小板減少，白血病細胞可浸潤全身各種組織與臟器，使各個臟器的功能受損，如脾、肝、淋巴結、腦膜、皮膚等，產生肝、脾、淋巴結腫大、頭痛、頸強直等臨床症狀和體徵；也可表現為局部的腫瘤，例如浸潤骨膜下時，可聚集成淡綠色腫塊，俗稱綠色瘤，如乳突綠色瘤、硬腦膜綠色瘤、脊椎綠色瘤、骨盆綠色瘤等，並可早於白血病前出現於臨床。由於白血病細胞源於血液系統，又具有腫瘤細胞的上述特點，所以人們習慣上稱它是血癌。白血病的分布是世界性的，佔癌症總發病數的5％左右，發病以兒童和青年居多。我國白血病患者約為3-4人/10萬人口，男性多於女性。在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中白血病佔第6位(男性)和第8位(女性)，在兒童及35歲以下的人群中則佔第1位。白血病按白細胞發育成熟的程度區分，可分為急性、慢性兩種；按白細胞的不同類型來區分，可分為淋巴細胞型、粒細胞型、單核細胞型、漿細胞型、巨核細胞型白血病，有時也可由兩種細胞混合而成，如粒一單細胞性白血病。
目前白血病的治療主要依靠化療，治療白血病的藥物也比較多，中藥西藥均有，常見的西藥有甲氨蝶呤、環磷醯胺、長春新鹼、三尖杉酯鹼、幹擾素等，中成藥有珍香膠囊、複方斑蝥膠囊等，這些藥物通過不同的機制對白血病進行治療，其中有細胞毒性藥物、誘導分化藥物等。細胞毒性藥物雖然可以殺傷大量的白血病細胞，減少體內的白血病負荷，但副作用較多，如殺傷、抑制正常造血細胞，導致貧血、出血；抑制正常免疫功能，機體免疫力下降，容易合併感染；損傷胃腸道黏膜，導致厭食噁心、嘔吐；還會影響心肝腎功能，而且還可使第二腫瘤發生率增加。此外，這些藥物劑量再大，也不可能完全殺滅體內的白血病細胞，而殘留的白血病細胞是疾病復發的根源。誘導分化治療是指應用能夠促進白血病細胞分化成熟或能夠調節白血病細胞表型以增強其對藥物敏感性的誘導分化劑。目前應用最有效的是用全反式維甲酸(ATRA)治療急性早幼粒細胞白血病(M3)，ATRA已成為M3型白血病誘導緩解的首選藥物。
幹擾素是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子。分為α、β及γ3種。自80年代以來，許多研究顯示，幹擾素(尤其α-幹擾素及γ-幹擾素)除具有抗病毒、免疫凋節的作用外，還具有明顯的抗細胞增殖作用。目前幹擾素已被用於治療多種白血病。幹擾素的治療主要顯示對慢粒(慢性期)、毛細胞白血病，慢淋等慢性白血病是有幫助的。由於幹擾素治療費用昂貴、大劑量時副作用多(如行動能力降低、智力減退等)，目前國內應用尚不普遍。
上述藥物有的具有較強的毒性，在治療白血病的同時對正常細胞也有殺傷作用，有的效果不明顯，有的效果雖好但價格昂貴。中藥在白血病治療上已表現出一定的效果，並且由於中藥毒性低、副作用少而越來越受到關注。漢黃芩素是唇形科(Labiatase)植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)及同屬多種植物的根中所含的黃酮類化合物，具有式(1)的結構。
式(1)研究表明漢黃芩素有多種藥理作用，包括抗氧化作用，抗凝血作用，抗腫瘤作用，解痙作用，此外還有抗菌、抗病毒作用以及利尿作用等。最新研究表明漢黃芩素還可以抑制腫瘤細胞增殖。有文章報導，漢黃芩素可以通過抑制端粒酶活性，抑制過氧化物家族或促進凋亡而抑制人早幼粒白血病細胞HL-60細胞和人T-淋巴性白血病細胞CEM細胞的增殖。
但對於漢黃芩素在製備治療白血病藥物中的應用方面，特別是對於漢黃芩素在製備誘導白血病細胞定向分化藥物的研究尚未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供漢黃芩素在製備治療白血病的藥物中的應用。
本發明的理論基礎是根據成熟的白細胞由造血於細胞分化而來。粒細胞一般按照原始粒細胞——早幼粒細胞——中幼粒細胞——晚幼粒細胞——杆狀核及分葉核細胞逐漸分化成熟。一般認為白血病的發生與細胞分化受阻有關，細胞停止在原始粒或早幼粒階段而產生異常增殖的白血病細胞。但在分化誘導劑的誘導下造血幹細胞可沿粒系方向逐漸分化為趨於成熟的細胞。
本發明的技術方案是漢黃芩素在製備治療白血病的藥物中的應用，特別是在製備誘導白血病細胞向粒系定向分化的藥物中的應用。
本發明中漢黃芩素可以和藥學上允許的任意一種輔料製成藥物組合物，也可以和其他與漢黃芩素不發生拮抗作用的治療白血病藥物組成複方製劑。這些製劑可以是藥學上允許的任意一種劑型，包括但不限於片劑、顆粒劑、丸劑、口服液、注射劑、膜劑、膠囊劑、脂質體等。漢黃芩素的用量可根據用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療的疾病類型和嚴重程度等變化，其日劑量可以是80-3600mg，可以一次或多次施用。
本發明的優點本發明提供了漢黃芩素在製備治療白血病的藥物中的應用，特別是在製備誘導白血病細胞定向分化的藥物中的應用，根據本發明製備的抗白血病藥物在誘導白血病細胞向粒系分化方面具有較好的效果，為白血病藥物治療提供了更多選擇，並且為特定類型白血病的治療提供了有針對性的藥物。同時漢黃芩素對細胞的毒性作用較小，有利於臨床應用。


圖1為NB4細胞對照組Giemsa(姬氏染液)染色照片。
圖2為NB4細胞漢黃芩素高劑量(50μM)組Giemsa染色照片。
圖3為NB4細胞漢黃芩素中劑量(12.5μM)組Giemsa染色照片。
圖4為NB4細胞漢黃芩素低劑量(3.13μM)組Giemsa染色照片。
圖5為NB4細胞NBT(硝基四氮唑藍)實驗結果。
圖6為U937細胞對照組Giemsa染色照片。
圖7為U937細胞漢黃芩素高劑量(50μM)組Giemsa染色照片。
圖8為U937細胞漢黃芩素中劑量(12.5μM)組Giemsa染色照片。
圖9為U937細胞漢黃芩素低劑量(3.13μM)組Giemsa染色照片。
圖10為U937細胞NBT實驗結果。
圖11為HL60細胞對照組Giemsa染色照片。
圖12為HL60細胞漢黃芩素高劑量(50μM)組Giemsa染色照片。
圖13為HL60細胞漢黃芩素中劑量(12.5μM)組Giemsa染色照片。
圖14為HL60細胞漢黃芩素低劑量(3.13μM)組Giemsa染色照片。
圖15為HL60細胞NBT實驗結果。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
效果實施例1漢黃芩素對人原幼粒白血病細胞株NB4細胞的體外分化誘導作用1)細胞形態學檢測方法分別用50μM，12.5μM和3.13μM濃度的漢黃芩素與NB4細胞共培養5天，之後，將各組NB4細胞懸液離心，棄上清，加入PBS或Hanks液洗滌1～2次，取細胞沉澱塗片，迅速風乾；用Giemsa染液染色10～20分鐘，蒸餾水漂洗，風乾；於油鏡下每片觀察200個細胞，按其分化成熟程度分類細胞分類各類細胞的形態特點如下①早幼粒細胞胞漿少，呈淡藍色或灰藍色，有非特異性嗜天青顆粒。核圓形或橢圓形，染色質細，核仁大而明顯，1～3個不等。
②中幼粒細胞胞漿較多，出現細小的粉紅色特異顆粒。核呈圓形或橢圓形，有時偏向一側，核染色質粗糙，核仁減少或消失。
③晚幼粒細胞胞體較小，胞漿淡紅色，特異顆粒增多，核呈腎形、豆形或黃瓜形。
④杆狀核細胞胞漿量多，呈淡紅色，布滿細小嗜中性顆粒。核彎曲，呈帶狀、S形、U形或W形。
⑤分葉核細胞胞漿量多，胞核分2-5葉。
結果見圖1-圖4與空白對照組相比，分別採用50μM，12.5μM和3.13μM濃度的漢黃芩素共培養5天後的NB4細胞，其分化率分別達到了86％，63％，38％(中幼粒以上都算分化)。
結果表明，漢黃芩素對人白血病細胞NB4細胞株具有良好的分化誘導作用，可誘導NB4細胞可沿粒系方向逐漸分化為趨於成熟的細胞。由圖1至圖4的照片中可觀察到隨漢黃芩素劑量的增加，NB4細胞的分化程度也在增加，漢黃芩素所誘導的NB4細胞的分化與漢黃芩素的劑量成正相關。
2)功能學檢測NBT還原能力測定方法無菌條件下，收集對數增殖期NB4細胞，接種於96孔板(同時做兩塊平行板)，於5％CO2，37℃條件下培養5天。將兩塊板離心，棄上清，一塊板加入100μl的1640培養基(含有2mg/ml的NBT和500μg/ml的PMA(佛波脂))，置於37℃，5％CO2條件下孵育2小時，加DMSO溶解沉澱，於570nm處測定吸光度值。同時另一塊平行板加入20μl MTT(四氮唑藍)(5mg/ml)溶液，相同條件下孵育4小時後，加DMSO溶解甲臢沉澱，於570nm處測定吸光度值。最後以NBT/MTT的比值表示分化率。
結果NBT/MTT比值表示在剩餘活細胞中分化細胞所佔的比率。細胞對照組(未加藥)的NBT陽性率為5.05％。以漢黃芩素50μM，12.5μM和3.13μM處理細胞5天後，NB4細胞株的NBT反應陽性率(即分化率——NBT/MTT比值)分別為60％，25％，15％。
結果表明漢黃芩素可以誘導NB4細胞向終末(粒系)分化，且成劑量正相關(見圖5)。
效果實施例2漢黃芩素對人淋巴細胞白血病細胞株U937的體外分化誘導作用除細胞株改為人淋巴細胞白血病細胞株U937外，所做實驗及實驗方法均同1。
結果見圖6-10。
結果表明，漢黃芩素對U937細胞有良好的分化誘導作用，且可誘導U937細胞向粒系方向分化。
效果實施例3漢黃芩素對人早幼粒白血病細胞株HL60的體外分化誘導作用除細胞株改為人白血病細胞株HL60外，所做實驗及實驗方法均同1。
結果見圖11-15。
結果表明，漢黃芩素對HL60細胞有良好的分化誘導作用，且可誘導HL60細胞向粒系方向分化。
效果實施例4漢黃芩素對白血病細胞體內誘導分化作用方法採用SCID鼠作體內試驗。
取SCID小鼠隨機分為四組，每組8隻，空白對照組給予生理鹽水(NS)20ml/kg。漢黃芩素高劑量組濃度是28mg/kg，中劑量組濃度是14mg/kg，陽性對照組給予維甲酸15mg/kg。分別將NB4細胞(1×106)100μl腹腔注射接種於SCID小鼠，第二天開始給藥，各組分別給藥兩周，觀察小鼠存活天數，結果見表1。
表1漢黃芩素對SCID小鼠生命延長的影響

(*p＜0.05，**p＜0.01，vs.對照組)實驗結果表明，與空白對照組相比，漢黃芩素高、中劑量可以顯著延長SCID小鼠存活時間。
製劑實施例1取漢黃芩素10g，加入注射劑(包括凍乾粉針劑和無菌分裝乾粉針劑)適當輔料，按注射劑(包括凍乾粉針劑和無菌分裝乾粉針劑)工藝製備成抗白血病藥注射劑。
製劑實施例2取漢黃芩素10g，加入片劑(包括緩控釋片，骨架片，包衣片，分散片等)適當輔料，按片劑(包括緩控釋片，骨架片，包衣片，分散片等)工藝製備成抗白血病藥片劑。
製劑實施例3取漢黃芩素10g，加入膠囊劑適當輔料，按膠囊劑工藝製備成抗白血病藥膠囊劑。
製劑實施例4取漢黃芩素10g，加入乳劑(包括微乳，納米乳等)適當輔料，按乳劑(包括微乳，納米乳等)工藝製備成抗白血病藥乳劑。
製劑實施例5取漢黃芩素10g，加入顆粒劑適當輔料，按顆粒劑工藝製備成抗白血病藥顆粒劑。
製劑實施例6取漢黃芩素10g，加入緩釋控釋劑適當輔料，按緩釋控釋劑工藝製備成抗白血病藥緩釋控釋劑。
製劑實施例7取漢黃芩素10g，加入口服液適當輔料，按口服液工藝製備成抗白血病藥口服液。
製劑實施例8取漢黃芩素10g，加入脂質體劑型適當輔料，按脂質體工藝製備成抗白血病藥脂質體劑型。
權利要求
1.漢黃芩素在製備治療白血病藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的治療白血病藥物是誘導白血病細胞分化的藥物。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述的誘導白血病細胞分化的藥物是指誘導白血病細胞向粒系分化的藥物。
全文摘要
本發明屬於製藥領域，涉及漢黃芩素在製備治療白血病藥物中的應用。本發明提供了漢黃芩素在製備治療白血病的藥物中的應用，特別是在製備誘導白血病細胞向粒系定向分化的藥物中的應用。按本發明製備的藥物對白血病細胞具有良好的分化誘導作用，為治療特定類型白血病提供了更好的選擇。
文檔編號A61P35/00GK1785175SQ20051009534
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月9日 優先權日2005年11月9日
發明者郭青龍, 張坤, 俞軍, 尤啟冬, 王偉, 張海偉, 顧紅燕, 趙麗, 胡揚 申請人:中國藥科大學