一株產穀胱甘肽的酵母工程菌及其在生產穀胱甘肽中的應用的製作方法
2023-05-21 07:33:46 1
專利名稱：一株產穀胱甘肽的酵母工程菌及其在生產穀胱甘肽中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株產穀胱甘肽的酵母工程菌，其構建方法，及其在生產穀胱甘肽中的應用。
背景技術：
穀胱甘肽(glutathione，GSH)又名Y _L_穀氨醯-L-半胱氨醯-甘氨酸，是由L-穀氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的生物活性三肽化合物，廣泛存在於動物、植物和微生物細胞中。發酵法因其可以利用廉價的生產原料通過特定的微生物代謝合成穀胱甘肽，操作簡單、成本較低且生產速率快而越來越受到青睞(Meister A，Anderson M Ε. Glutathione[J]. Ann Rev Biochem,1983,52 :711-760. Li Y， Wei G Y,Chen J, Glutathione :a review on biotechnological production[J]Appl MicrobiolBiotechnol，2004，66 (3) :233-242)。GSH的生理功能主要有以下幾方面(1)抗自由基對細胞的損傷機體代謝產生的過多自由基會損傷生物膜、侵襲生命大分子、加快機體衰老、誘發腫瘤或動脈硬化的產生。GSH可以通過巰基與體內的自由基結合轉化成易代謝的酸性物質，加速自由基的排洩，對細胞起到強有力的保護作用。⑵除外源有毒物質的毒性GSH能與進入機體有毒化合物、重金屬離子等直接結合，並促其排出體外，起到中和解毒的作用。臨床上已應用GSH來解除丙烯腈、氟化物、C0、重金屬、有機溶劑的中毒現象。( 促進細胞合成蛋白質GSH可通過Y-穀氨醯基轉運酶直接進入細胞內，並通過Y2穀氨醯基循環參與眾多胺基酸的轉運，進而促進蛋白質的合成。(4)是多種酶的輔基或輔酶GSH參與三羧酸循環與糖代謝，組織中有許多酶是以GSH為輔酶，其活性需要GSH的存在才能表現出來。另外，GSH對於需要巰基的酶有保護或恢復活性的作用。(5)參與轉甲基、轉丙氨基反應，維持肝細胞正常功能(劉娟，劉春秀，王雅琴等。發酵法生產穀胱甘肽的研究進展[J].微生物學通報，2002，四(6) :71-75)。穀胱甘肽的生物合成由穀氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通過穀氨醯半胱氨醯合成酶(GSH I)和穀胱甘肽合成酶(GSH II)催化的。其中，GSH I是GSH合成中的限速酶，受GSH的反饋抑制。在合成過程中，每合成一分子的穀胱甘肽需要消耗二分子的ATP。另外，GSH也可以在NADPH存在時通過穀胱甘肽還原酶將氧化型穀胱甘肽(GSSG)還原得到。在微生物界，GSH產生菌主要集中在真核生物和革蘭氏陰性菌中。野生型釀酒酵母和產朊假絲酵母本身具有較高的GSH含量(佔細胞乾重的0. 1.0% )，並且能夠持續保持GSH的合成能力，因此它們已成為工業生產穀胱甘肽最常用的菌種。在實際發酵生產中，GSH產量的提高可以通過兩個方面來實現一是菌體本身細胞內GSH含量的提高；二是通過提高菌體生物量使GSH的總量提高。工業發酵的最終目標是以最低的生產成本獲得最大的產值和收益，而實現這一目標的手段就是針對每個特定過程建立相應的高效發酵模式。GSH的發酵過程可以分為兩個階段細胞生長階段和GSH的合成階段。所以，GSH總量的增加可以分別在這兩個階段通過增加細胞的生物量或者細胞內GSH的合成量來實現。而對發酵過程的控制可以同時從這兩個方面使GSH的總量提高。目前，通過補料分批培養實現高密度發酵是增加細胞生物量的最成熟和最完善的方法。但是，在實際發酵過程中，由於溶氧、副產物積累等因素影響了細胞的生長，從而難以實現高密度發酵。因此，解決供氧問題是獲得大量目的產物的關鍵之一。傳統的解決辦法是改善設備的供氧能力，提高攪拌速度，增大通氣量，以增加空氣在培養液中的截留率，增加氣液相接觸的比表面積；或者在培養液中加入某些助溶劑，以提高氧的溶解度。所有這些方法均受到設備和能耗的限制，現在僅用於通氣和攪拌的能耗已佔整個發酵成本的1/3，嚴重限制了發酵工業的發展。透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，簡稱為VHb)是原核生物中迄今發現的唯一的一種血紅蛋白，能夠從分子水平上提高透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)重組菌對氧氣的利用能力，因此能在限氧條件下促進細胞生長和產物合成，從而大幅度提高發酵過程中目的產物的產量和收率。VHb的應用不僅可以降低氧氣及能量的消耗，還不需要附加的設備投資，因此可大大降低發酵成本。可以說，VHb的發現及研究進展為利用分子克隆技術解決微生物發酵過程中的氧氣供求矛盾及實現高密度發酵培養提供了良好途徑，因此VHb的研究與應用必將成為發酵工業中的一項關鍵技術，具有十分光明的前景。釀酒酵母表達系統既有原核生物生長快、操作簡單的優點，又具有真核生物能夠對蛋白質進行翻譯後修飾的的優點。釀酒酵母表達系統表達外源基因的優點有很多釀酒酵母培養條件普通，生長繁殖迅速，用於表達基因工程產品時工藝簡單，能夠耐受較高的流體靜壓，可以大規模生產，有效降低生產成本，已廣泛應用於釀酒和食品工業；它不會產生毒素，安全可靠；釀酒酵母表達外源基因具有一定的翻譯後加工能力，收穫的外源蛋白具有一定程度上的摺疊加工和糖基化修飾，特別適合於表達真核生物基因，有利於保持生物產品的活性和穩定性(唐香山，張學文。釀酒酵母表達系統[J].生命科學研究，2004，8 (2)106-109)。VHb已成功的用於提高多種微生物中目的產物的產量，但至今沒有利用VHb提高釀酒酵母菌發酵生產穀胱甘肽產量的報導。將VHb應用於釀酒酵母表達系統中，有望解決釀酒酵母高密度發酵中供氧不足的問題，進而提高穀胱甘肽在釀酒酵母中的產量。
發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一株產穀胱甘肽的酵母工程菌，其構建方法，及其在生產穀胱甘肽中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的一株產穀胱甘肽的酵母工程菌，菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，已於2012年02月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5758。一種產穀胱甘肽的酵母工程菌的構建方法，是將透明顫菌血紅蛋白基因Vgb整合到產穀胱甘肽的酵母基因組中，篩選得到能夠表達透明顫菌血紅蛋白基因的重組酵母，其中，透明顫菌血紅蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示，為GenBank號為M27061的5'-端第142-582位核苷酸序列。所述用於將透明顫菌血紅蛋白基因Vgb整合到酵母基因組中使用的重組載體是pYM-vgb,該載體是將透明顫菌血紅蛋白基因vgb連接到質粒pYMIKP (本實驗室保存，圖譜參照說明書附圖1所示。劉向勇，沈煜，郭亭等。rDNA介導的多拷貝整合表達載體的構建及其在釀酒酵母工業菌株中的應用[J]。山東大學學報(理學版)，2005，40C3) :105-109)上構建而成。具體構建步驟如下(1)以載體pYES3/CT-vgb為模板擴增目的基因vgb ；(2)利用Bgl II分別酶切vgb片段和載體ρΥΜΙΚΡ，然後用T4DNA連接酶連接；(3)連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，篩選陽性克隆並通過PCR及DNA測序分析鑑定重組質粒pYM-vgb，最終獲得重組表達質粒pYM-vgb ；(4)將測序正確的重組質粒pYM-vgb用限制性內切酶Kpn I酶切線性化，利用電擊轉化法將線性化質粒pYM-vgb轉化到釀酒酵母中，在篩選平板上篩選陽性轉化子，2 3天後挑取單菌落於液體培養基中培養Mh，提培養物基因組，利用上述vgb的引物進行PCR驗證，獲得含有vgb基因的工程菌；(5)工程菌發酵及vgb表達產物檢測。所述步驟(1)中，引物為上遊引物5『 GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 『；
下遊引物5 『 GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3 『；其中引物的5'均引入Bgl II酶切位點，擴增條件為①95°C，5min ；②94°C，30s ；③ 56°C，30s ；④ 72°C，Imin ；⑤循環 30_；35 次；⑥ 72°C，IOmin0所述步驟(4)中，電擊轉化的條件是電壓1. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，電擊時間4 5ms。所述步驟中，篩選平板為含遺傳黴素G418的抗生素平板。所述步驟(5)中，工程菌發酵的條件為30°C，200 250r/min培養2 3天。所述步驟(5)中，vgb表達產物檢測的方法為C0_差示光譜法，具體步驟如下(1)取細菌培養液6ml離心，沉澱用生理鹽水洗滌一次後重懸於3ml緩衝液中，超聲破碎，所述緩衝液為含有100mmol/L Tris-HCI、50mmol/L NaCI的水溶液，pH7. 5 ；(2) 40C、10000r/min 離心 15min，留上清；(3)上清用3ml步驟(1)所述的緩衝液稀釋一倍，並加入連二亞硫酸鈉至終濃度2. 5mg/ml ；(4)將經步驟⑴ (3)處理過的樣品分成兩份，一份通CO，3min, 1個氣泡/s ；(5)用紫外可見光分光光度計在400 500nm範圍內分別對兩份樣品掃描，以未經CO處理的樣品作對照，所得的曲線即為CO-差示光譜圖，通過CO-差示光譜圖判斷透明顫菌血紅蛋白基因是否表達產物中是否含有透明顫菌血紅蛋白。本發明的產穀胱甘肽的酵母工程菌，能夠表達透明顫菌血紅蛋白，從而從分子水平上提高重組菌對氧氣的利用能力，進而在限氧條件下促進細胞生長和產物合成，從而大幅度提高發酵過程中穀胱甘肽的產量和收率。本發明的工程菌，可以用於生產穀胱甘肽，其產量和收率，遠遠高於普通的產穀胱甘肽菌。
產穀胱甘肽的酵母工程菌，菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae，已於2012年02月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5758，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。圖1為pYM-vgb重組載體的構建過程示意圖。圖2為pYM-vgb重組載體酶切驗證電泳圖，其中，泳道1為Bgl II酶切重組質粒pYM-vgb,泳道2為Bgl II酶切ρYMIKP，泳道3為pYM-vgb，泳道4為ρYMIKP，泳道5為DNAMarker(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)。圖3為目的基因整合到釀酒酵母基因組上得PCR驗證的電泳圖，其中，泳道1為原始菌基因組，泳道2為無菌水，泳道3為質粒pYM-vgb，泳道4、5分別為轉化子1和2，泳道6為 DNAMarker(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、IOOObp)。圖4為CO-差示光譜圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1 表達VHb的釀酒酵母整合載體的構建1.透明顫菌血紅蛋白基因vgb序列的獲得。以載體pYES3/CT-vgb為模板擴增目的基因vgb，引物為上遊引物5 『 GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 『下遊引物5『 GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3 『其中引物的5'均引入Bgl II酶切位點。擴增條件為①95°C，5min ；②94°C，30s ；③ 56°C，30s ；④ 72°C，Imin ；⑤循環 30_；35 次；⑥ 72°C，IOmin02.利用Bgl II分別酶切vgb片段和載體ρΥΜΙΚΡ，然後用T4DNA連接酶連接。3.連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，篩選陽性克隆並通過PCR及DNA測序分析鑑定重組質粒pYM-vgb，最終獲得重組表達質粒pYM-vgb (其構建過程見圖1，重組質粒酶切驗證見圖2)。實施例2 含VHb基因工程菌的構建將實施例1中的測序正確的重組質粒pYM-vgb用限制性內切酶Kpn I酶切線性化，用乙醇沉澱純化酶切產物，回收後用於電轉化。具體方法如下(1)將轉化用酵母菌株的單菌落接種於YPD培養基5ml中，在30°C、搖床轉速為220r/min的培養條件下過夜培養至飽和；(2)接種適量的過夜培養液於50ml YPD培養基，直到0D600約為1. 3 1. 5 ；於4°C、3000r/min離心收穫培養細胞，細胞用無菌水IOOml重懸；(3)加入適量lmol/L 二硫蘇糖醇(DTT，用來疏鬆細胞壁)溶液，並同時旋轉搖動，於30°C輕輕搖動15min ；(4)用預冷的無菌水洗2 3次，離心條件為4°C，3000r/min，5min ；(5)用預冷的lmol/L山梨醇溶液洗2次，離心條件為4°C，3000r/min, 5min ；(6)最後用lmol/L山梨醇溶液200 μ 1懸浮，分裝至1. 5ml EP管中(100 μ 1/個)放置IOmin後電轉；
(7)將電轉杯置於冰上預冷，取線性化DNA溶液10 μ 1與酵母感受態細胞懸液100 μ 1混合，冰上放置5min ；(8)轉入預冷的電轉杯中，1. 5kV電擊，電容25 μ F，電阻200 Ω，然後立即加入預冷lmol/L山梨醇溶液900 μ 1，轉入離心管中，冰上放置IOmin ；(9)再轉入15ml離心管中，30°C復甦2 3h ；(10)取50 μ 1、100 μ 1塗含有1000 μ g/ml遺傳黴素(G418)的抗性YPD平板；(11)在30°C培養箱中避光培養3 4天後挑單菌落，在含G418的YPD液體培養基中，30°C、220r/min過夜培養其中涉及的YPD培養基配方為酵母抽提物10g/L，蛋白腖20g/L，葡萄糖 20g/L。(12)提取酵母基因組，用以下引物進行PCR驗證(附圖3)，得到轉化成功的工程菌。上遊引物5『 GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 『下遊引物5'GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3『(13)VHb基因表達產物的驗證採用的是CO-差示光譜法。具體操作如下將工程菌在30°C、搖床轉速為220r/min的培養條件下過夜培養，取發酵培養液6ml離心，離心條件為4°C，3000r/min，5min ；沉澱用生理鹽水洗滌一次後重懸於緩衝液(lOOmmol/LTris-HCl，50mmol/L NaCl, pH7. 5) 3ml 中，超聲破碎(500W，工作時間 10s，間歇時間 20s，破碎時間40 60min，在冰上進行)；4°C、10000r/min離心15min，留上清；上清用緩衝液3ml稀釋一倍，並加入連二亞硫酸鈉至終濃度2. 5mg/ml ；將經上處理過的樣品分成兩份，一份通CO 3min(l個氣泡/s)；然後用紫外可見光分光光度計在400 500nm範圍內分別對兩份樣品掃描，以未經CO處理的樣品作對照，所得的曲線即為CO-差示光譜圖。從圖4中可以看到，重組菌與原始菌相比，在419nm處有明顯的吸收峰，說明重組菌已成功表達出有生物活性的透明顫菌血紅蛋白。實施例3 基因工程菌的發酵實驗將原始菌株和實施例2得到的重組菌株分別接種在250ml含有YPD液體培養基50ml的三角瓶中，30°C過夜培養，搖床轉速為220r/min。將培養好的種子培養基以2%的接種量接種於250ml含有發酵培養基100ml的三角瓶中，30°C培養^h，搖床轉速為220r/min0發酵結束後，穀胱甘肽的含量採用Alloxan法(上海醫學化驗所.臨床生化檢驗[M].上海科技出版利，1979,86-88.)進行測定。發酵結果表明100ml的裝液量對於250ml的三角瓶來說通氣量不夠，不能滿足酵母在生長過程中對氧氣的需求量。原始菌株在100ml發酵培養基中的產量為8%ig/L，而重組菌的穀胱甘肽產量達到122. 5mg/L。由此可知重組菌中穀胱甘肽的產量較原始菌高出45.8%，申請人將該菌株進行了保藏，分類命名為釀酒酵母&iccharomycescerevisiae，於2012年02月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0. 5758。此實驗說明了，在低氧條件下，原始菌的生長代謝明顯受到影響，而含有VHb基因的重組菌能夠實現在較低溶氧水平條件下生產出較高產量的穀胱甘肽，解決了在大規模發酵生產過程中要求高溶氧的問題，為穀胱甘肽的大規模工業化生產提供了可行性。需要注意的是，本發明的工程菌的構建方法是有成功率的，也就是說，利用本發明的構建方法所得到的重組工程菌，並非都能夠使穀胱甘肽的產量得到明顯提高，本發明的保藏的菌株，是發明人通過多次實驗所得到的效果最好的重組工程菌，其穀胱甘肽產量達到122. 5mg/L，遠遠高於其它通過同樣的方法構建得到的工程菌。
權利要求
1.一株產穀胱甘肽的酵母工程菌，其特徵在於菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae，已於2012年02月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 5758。
2.一種產穀胱甘肽的酵母工程菌的構建方法，其特徵在於是將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合到產穀胱甘肽的酵母基因組中，篩選得到能夠表達透明顫菌血紅蛋白基因的重組酵母，其中，透明顫菌血紅蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特徵在於所述用於將透明顫菌血紅蛋白基因 vgb整合到酵母基因組中使用的重組載體是pYM-vgb，該載體是將透明顫菌血紅蛋白基因 vgb連接到質粒pYMIKP上構建而成。
4.根據權利要求2或3所述的構建方法，其特徵在於步驟為(1)以載體pYES3/CT-vgb為模板擴增目的基因vgb；(2)利用BglII分別酶切vgb片段和載體ρΥΜΙΚΡ，然後用T4DNA連接酶連接；(3)連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，篩選陽性克隆並通過PCR及DNA測序分析鑑定重組質粒pYM-vgb，最終獲得重組表達質粒pYM-vgb ；(4)將測序正確的重組質粒pYM-vgb用限制性內切酶KpnI酶切線性化，利用電擊轉化法將線性化質粒pYM-vgb轉化到釀酒酵母中，在篩選平板上篩選陽性轉化子，2 3天後挑取單菌落於液體培養基中培養Mh，提培養物基因組，利用上述vgb的引物進行PCR驗證，獲得含有vgb基因的工程菌；(5)工程菌發酵及vgb表達產物檢測。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於所述步驟⑴中，引物為上遊引物5 『 GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3 『；下遊引物5 『 GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3 『；其中引物的5'均引入Bgl II酶切位點，擴增條件為①95°C，5min ；②94°C，30s ； ③ 56°C，30s ；④ 720C，Imin ；⑤循環 30-35 次；⑥ 72°C，IOmin0
6.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於所述步驟中，電擊轉化的條件是電壓1. 5kV,電容25 μ F,電阻200 Ω，電擊時間4 5ms。
7.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於所述步驟(4)中，篩選平板為含遺傳黴素G418的抗生素平板。
8.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於所述步驟(5)中，工程菌發酵的條件為30°C，200 250r/min 培養 2 3 天。
9.根據權利要求4所述的構建方法，其特徵在於所述步驟(5)中，vgb表達產物檢測的方法為C0-差示光譜法，具體步驟如下(1)取細菌培養液6ml離心，沉澱用生理鹽水洗滌一次後重懸於3ml緩衝液中，超聲破碎，所述緩衝液為含有100mmol/L Tris-HCI、50mmol/LNaCI的水溶液，pH7. 5 ；(2)40C、10000r/min 離心 15min,留上清；(3)上清用3ml步驟(1)所述的緩衝液稀釋一倍，並加入連二亞硫酸鈉至終濃度 2. 5mg/ml ；(4)將經步驟(1) C3)處理過的樣品分成兩份，一份通C0，3min,1個氣泡/s ；(5)用紫外可見光分光光度計在400 500nm範圍內分別對兩份樣品掃描，以未經CO處理的樣品作對照，所得的曲線即為CO-差示光譜圖，通過CO-差示光譜圖判斷表達產物中是否含有透明顫菌血紅蛋白。
10.權利要求1所述的產穀胱甘肽的酵母工程菌在生產穀胱甘肽中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株產穀胱甘肽的酵母工程菌，菌株名為101-V，分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已於2012年02月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.5758。本發明還公開了一種構建高產穀胱甘肽工程菌株的方法，是將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合到產穀胱甘肽的酵母基因組中，篩選得到能夠表達透明顫菌血紅蛋白基因的重組酵母，如此，從分子水平上提高了血紅蛋白基因重組菌對氧氣的利用能力，解決了微生物發酵過程中的氧氣供求矛盾，降低了氧氣及能量的消耗，並同時提高了穀胱甘肽的產量。
文檔編號C12R1/865GK102559529SQ20121004235
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月23日 優先權日2012年2月23日
發明者朱希強, 王鳳山, 董坤, 陳曉燕 申請人:山東大學