具有抗hiv活性的1'－乙醯氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物的製作方法

2023-05-21 07:41:36 1

專利名稱：具有抗hiv活性的1'－乙醯氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物的製作方法
技術領域：
本發明涉及1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物作為Rev蛋白質傳送的阻斷劑，這種阻斷劑能有效地抵抗人體免疫缺陷病毒(HIV)的感染。
背景技術：
1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯是一種天然化合物，被發現在高良姜及其他姜科植物中。在中國，良姜早已作為藥用，在泰國及其他亞洲國家也已長期用作草藥及食物。1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的結構式如下 從Alpinia galanga的新鮮及乾燥根莖中發現的1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的含量約為1.5％-2.8％(De Pooter，H.L.et.al.1985)，葉子的含量較低(Jassen，A.M.and Scheffer，J.J.C.1985)。在高良姜中發現的天然1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的立體構型為S型。
1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯被發現抑制各種真菌的生長(Jassen，A.M.andScheffer，J.J.C.1985)，包括許多dermatophytic真菌如Trichophytonmentagrophytes，Trichophyton rubrum，Trichophyton concentricum和Epidermophyton floccosum，最小阻止濃度範圍為50-250μg/ml。
1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯被發現具有抗結核病活性。它抑制M.tuberculosis和其他mycobacterium(Palittapongarnpim，P.et.al.2002)的生長。
1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯能抑制許多體內腫瘤及癌的發展，例如皮膚癌(Murakami，A.et.al.，1996)，口腔癌(Ohnishi，M.et.al.1996)，大腸癌(Tanaka，T.et.al.1997 and Tanaka，T.et.al.1997)，肝癌(Kobayashi，Y.et.al.1998)，膽囊癌(Miyauchi，M.et.al.2000)和食道癌(Kawabata，K.et.al.2000)。
在RAW264細胞中，通過抑制誘導一氧化氮合成酶的基因表達，1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯能夠阻止脂多糖和幹擾素-gamma誘導的一氧化氮的產生(Ohata，T.et.al.1998)。1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯能夠阻斷一氧化氮合成酶活性是通過抑制I.kappa.B-.alpha.蛋白質的破壞。I.kappa.B-.alpha.蛋白是NF-.kappa.B轉錄因子的阻斷劑，因此阻止NF-.kappa.B的活化。1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯也阻止其它的轉錄因子如AP-1和Stat-1的活化。有認為1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯阻止一氧化氮的產生與調節幾種轉錄因子的活化有關。這可能導致1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的抗癌作用。
1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯能夠阻止腫瘤啟動子誘導的Epstein-Barr病毒激活(Marukami，A.et.al.2000 and Kondo，A.et.al.1993)，能夠阻止NADPH氧化酶及黃嘌呤氧化酶的活性(Murakami，A.et.al.2000 and Tanaka，T.et.al.1997)。這些酶和過氧化物的產生有關(Nakamura，Y.et.al.1998 andMurakami，A.et.al.1996)。
高良姜的許多成分已經被報導，例如α-pinene，β-pinene，limonene，1，8-cineole(Scheffer，J.J.C.et.al.1981)，1′-hydroxychavicol acetate，1′-acetoxyeugenol acetate(Jassen，A.M.and Scheffer，J.J.C.1985)，p-hydroxycinnamaldehyde，[di-(p-hydroxy-cis-styryl)]methane(Barik，B.R.et.al.1987)，galanal A，galanal B，galanolactone，(E)-8(17)，12-labddiene-15，16-dial and(E)-8，17-epoxylabd-12-ene-15，16-dial(Morita，H.and Itokawa，H.1988)。
人體免疫缺陷病毒(HIV)感染引起獲得性免疫缺陷綜合症(一般稱愛滋病)。過去15年裡有關治療方法的大量研究集中在有限的藥物靶點上，即HIV的逆轉錄酶，HIV蛋白酶，HIV整合酶。
許多已知的抗HIV化合物都有其它嚴重的副反應。例如，逆轉錄酶阻止劑如AZT和ddI有相當的毒性，用這些化合物治療患者具有嚴重的副反應。
據此，雖然用上面的抗HIV化合物控制HIV感染和治療愛滋病已取得一定的成功，但克服目前用藥的缺點開發其它的治療方法是必要的。
HIV-1病毒的增殖需要其基因的有效表達，HIV-1病毒基因的有效表達有賴於病毒的一種調節蛋白質，Rev蛋白質。因為Rev蛋白質是HIV-1病毒增殖的一關鍵因素，所以阻止Rev蛋白質的功能近年已成為具有吸引力的一種治療戰略方法。

發明內容
獲得性免疫缺陷綜合症(愛滋病)是一種由HIV-1病毒引起的威脅生命的疾病。HIV-1病毒的增殖需要其基因的有效表達，HIV-1病毒基因的有效表達有賴於病毒的一種調節蛋白質，Rev蛋白質。Rev蛋白質增加病毒mRNAs在細胞漿內的積聚，後者經從細胞核到細胞漿的傳送而編碼病毒的結構蛋白質。由於Rev蛋白質對於病毒增殖至關重要，阻止Rev蛋白質的功能是一種具有吸引力的治療戰略。
因為Rev蛋白質是病毒的一種蛋白質沒有細胞的對應體，所以阻止Rev蛋白質作用的幾種不同的戰略被用於阻止HIV-1增殖。在慢性感染細胞中反義寡核苷酸對抗Rev蛋白質的作用已被用於抑制HIV-1(Matsukura，M.et.al.1989)。HIV-1 Rev的顯性轉移變異(Bevec，D.et.al.1992)，細胞的Rev協同子eIF-5A的顯性陰轉變異(Bevec，D.et.al.1996)，一種抗Rev蛋白質單鏈抗體結構的細胞內表達(Duan，L.et.al.1994)，以及RRE-誘媒(Lee，L.et.al.1992)都顯示阻止HIV-1的細胞內感染。在用低分子物質這一更為經典的方法中，新黴素被發現阻斷Rev-RRE的結合而對抗Rev蛋白質的作用(Zapp，M.L.et.al.1993)。
Rev蛋白質從細胞核外傳到細胞質對該蛋白質的作用是很重要的，這一輸出依賴Rev蛋白質的活化結構域，該結構域起細胞核輸出信號作用。Rev蛋白質的傳送通過受體蛋白質，即染色體區域維持物(CRM1)直接和Rev蛋白質的核外輸出信號相結合。小櫱黴素B被證明阻止Rev蛋白質的核外輸出信號和受體蛋白質CRM1相結合而對HIV-1病毒的增殖顯示出強大的抑制效果(Wolff，B.et.al.1997)。儘管小櫱黴素B在體外具有顯著的生物學活性，但因為毒性特別大不適合發展為藥物。
從東京大學獲得一種分裂酵母Schizosaccharomyces pombe，這種酵母表達一由穀胱甘肽S-轉移酶(GST)，SV40 T抗原的核定位信號(NLS)，綠色螢光蛋白質(GFP)及Rev蛋白質的核外輸出信號(NES)融合成的蛋白質。這種酵母模型被用來篩選新的Rev蛋白質細胞核外輸送的抑制劑。
1.從良姜中製備1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的提取和純化方法為把高良姜的根莖切碎，碎片乾燥後用甲醇提取。提取物乾燥後通過矽膠層析柱用正己烷∶醋酸乙酯(5∶1)作為溶媒進行分離得到純1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯。其收穫率為1公斤高良姜可提取150mg 1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯。
2.用於檢測1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯對Rev蛋白質輸送抑制作用的分裂酵母Schizosaccharomyces pombe的製備Schizosaccharomyces pombe(JY266)酵母株被用於本研究。含有野生型nmt1啟動子(該啟動子在沒有維生素B1的培養液中能夠有力地引導轉錄)的pREP1質粒被用於S.pombe酵母的轉化。為了能在S.pombe酵母中看見細胞核質間的傳送，編碼穀胱甘肽S-轉移酶(GST)，SV40 T抗原的核定位信號(NLS)，綠色螢光蛋白質(GFP)及Rev蛋白質的核外輸出信號(NES)的融合蛋白質的基因被導入到JY266酵母株中。
3.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯對阻止Rev蛋白質傳送作用的測定在引入融合蛋白質後，S.pombe酵母菌在不添加維生素B1的培養液中30℃培養24小時，然後酵母細胞及含1％二甲亞碸的培養液的1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯被種在96孔的平板中繼續在30℃下培養3小時。通過螢光顯微鏡對GST-NLS-GFP-RevNES融合蛋白的分布進行檢測，在1μg/ml的濃度下1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯完全阻止了S.pombe酵母的融合蛋白從細胞核向細胞質進行傳送。
4.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯抗病毒作用的測定MT-4細胞以5×105cells/mL的密度懸浮在含有10％小牛血清的RPMI1640培養液中，加入HIV-1 NL43株後在37℃下培養2小時，洗2次。這樣製備的HIV-1感染的MT-4細胞的懸浮液(4×105cells/mL)100μL被添加到培養盤的各孔中，同時加入含適當濃度1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的稀釋液各100μL。
在37℃下培養3天，然後，用商品HIV-抗原試劑盒(ZeptoMetrix)對培養上清液中HIV-p24抗原的產生量進行定量測定。結果在2μM的濃度下1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯對p24產生量的抑制率為81％。
5.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的毒性實驗MT-4細胞懸浮在含有10％小牛血清及抗生素的RPMI1640培養液中，在37℃，5％二氧化碳，2個大氣壓下進行培養。取MT-4細胞加至96孔的培養盤中使其濃度為40000cells/0.1mL/孔。1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯被溶於二甲亞碸，用MT-4細胞的培養液稀釋，然後加入每孔中。經過3天的培養後，MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetraz-olium bromide)溶液被加至各孔，繼續培養3小時。然後除去各孔的溶液，加二甲亞碸溶解沉澱物。在570nm的波長處測吸收值且和空白比較。結果在2μM的濃度時1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯不顯示任何細胞毒性。
權利要求
1.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯作為HIV處理劑的應用。
2.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物作為HIV處理劑的應用。
3.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯如要求1中所指單獨作為HIV處理劑，或結合其它的藥物作為HIV處理劑的應用。
4.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物如要求2中所指單獨作為HIV處理劑，或結合其它的藥物作為HIV處理劑的應用。
5.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯按要求3中所指作為HIV處理劑在人體中的應用。
6.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯按要求3中所指作為HIV處理劑在動物中的應用。
7.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求4中所指作為HIV處理劑在人體中的應用。
8.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求4中所指作為HIV處理劑在動物中的應用。
9.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯作為HIV感染疾病的發展阻止劑在人體中的應用。
10.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯作為HIV感染疾病的發展阻止劑在動物中的應用。
11.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物作為HIV感染疾病的發展阻止劑在人體中的應用。
12.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物作為HIV感染疾病的發展阻止劑在動物中的應用。
13.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯按要求9中所指單獨或結合其它的藥物作為HIV感染疾病的發展阻止劑在人體中的應用。
14.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求11中所指單獨或結合其它的藥物作為HIV感染疾病的發展阻止劑在人體中的應用。
15.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯按要求10中所指單獨或結合其它的藥物作為HIV感染疾病的發展阻止劑在動物中的應用。
16.1′-乙醯氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物按要求12中所指單獨或結合其它的藥物作為HIV感染疾病的發展阻止劑在動物中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有抗人體免疫缺陷病毒HIV活性的1'－乙醯氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物。本發明指出了1'－乙醯氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物在一定濃度下對HIV－1感染的MT－4細胞具有高的抑制率，而對宿主MT－4細胞不顯示細胞毒性。因此表明1'－乙醯氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物對處理HIV具有潛在的應用前景。
文檔編號A61K31/05GK1457771SQ0313087
公開日2003年11月26日 申請日期2003年5月21日 優先權日2003年5月21日
發明者葉英 申請人:南昌弘益科技有限公司