D-氨甲醯水解酶的突變體及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-20 15:34:11

專利名稱：D-氨甲醯水解酶的突變體及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，具體內容涉及D-氨甲醯水解酶的突變體及其製備方法和應用。
背景技術：
^ -內醯胺類抗生素具有抗菌活力強，廣譜低毒等優點，是臨床控制細菌感染的首選藥物之一。D-對羥基苯甘氨酸(DHPG)是合成該類藥物的一種重要中間體，用於製備羥氨苄青黴素和羥氨苄頭孢菌素的側鏈。D-對羥基苯甘氨酸的製備在工業上有化學合成法和酶法兩種方法，其中化學合成法成本高，汙染大；而酶法具有成本較低、無汙染的特點，因此日益受到重視。酶法的技術原理是D-乙內醯脲酶(也稱為D-海因酶)將DL-對羥基苯海因不對稱水解為N-氨甲醯基-D-對羥基苯甘氨酸，然後在N-氨甲醯-D-胺基酸水解酶(也稱為D-氨甲醯水解酶，簡稱DCase)的作用下，將N-氨甲醯基-D-對羥基苯甘氨酸 不可逆水解轉變成DHPG。工業生產中發現在兩步酶法生產D-對羥基苯甘氨酸的過程中，由於DCase催化效率低、穩定性差的缺點，導致中間物N-氨甲醯基-D-對羥基苯甘氨酸大量積累，終產物D-對羥基苯甘氨酸產率低。因此DCase成為兩步酶法反應系統中的一個關鍵酶、限速酶。隨著基因工程技術的發展，大腸桿菌表達系統的日臻成熟，將DCase基因在大腸桿菌表達系統中進行過量表達，從而獲得高表達、高活力的基因工程菌株成為可能。例如，許禎等從一株能將DL-對羥基苯海因轉化為D-對羥基苯甘氨酸的菌株中，成功克隆出DCase基因，Genbank索取號為AF320814 (許禎等，生物工程學報，2002，18 (2) 149-54)。本發明人的實驗室在將DCase基因構建入pET表達系統，轉化E. coli過量表達後，對目的蛋白的活性和表達情況進行分析，結果顯示E. coli可以大量表達出重組蛋白，但是70-80%左右的重組蛋白是以包涵體的形式存在，嚴重影響了該酶的功能發揮。如何使更多的目的蛋白表達後能夠正確摺疊成為有活力的蛋白成為研究和努力的方向。前期對DCase的研究表明，其18位和30位殘基的疏水性對目的蛋白的可溶性有較大影響，分別將這兩個位點突變為疏水性不同的胺基酸(A18Y、A18N、A18D、A18E ;Y30E、Y30D)，可溶性有進一步提高。雖然天然酶分子在自然條件下已經進化了千百萬年，但是因為天然酶分子存在的環境與實際應用的環境不同，酶分子仍然蘊藏著巨大的進化潛力。運用定點突變技術等對微生物來源的酶進行分子改造和人工進化在近些年中取得了令人矚目的進展(參見王正祥等，生物工程學報，16 (3)，2000)，已經成為酶的人工工程改造的常用手段。這種分子水平上的改造技術是通過體外定點突變來改造靶基因，從而創造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白質的進化進程。因此，本領域有必要進一步改進天然的酶分子，以期更大限度地提高酶的表達以及酶活力
發明內容
本發明的目的在於提供一種D-氨甲醯水解酶的突變體及其製備方法和應用。在本發明的第一方面，提供一種突變型D-氨甲醯水解酶，其對應於SEQ ID NO 2胺基酸序列的第18位由丙氨酸(A)突變為穀氨酸(E)，第30位酪氨酸(Y)突變為天冬氨酸(D)，第34位賴氨酸(K)突變為穀氨酸(E)。在另一優選例中，所述的突變型D-氨甲醯水解酶是(a)具有SEQ ID NO 3所示的胺基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個(如1-20個 』較 佳地1-10個；更佳地1-5個；更佳地1-3個)胺基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且該蛋白的胺基酸序列中對應於SEQ ID NO 3第18位上的胺基酸為穀氨酸，對應於SEQ ID NO 3第30位上的胺基酸為天冬氨酸，對應於SEQ ID NO 3第34位上的胺基酸為
穀氨酸。在本發明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組⑴編碼所述的突變型D-氨甲醯水解酶的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :3所示胺基酸序列的突變型D-氨甲醯水解酶。在本發明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體，或基因組中整合有所述的多核苷酸。在另一優選例中，所述的宿主細胞是原核細胞；在另一優選例中，所述的宿主細胞是大腸桿菌。在本發明的另一方面，提供一種生產突變型D-氨甲醯水解酶的方法，包括步驟(I)培養所述的宿主細胞，獲得培養物；和(2)從培養物中分離突變型D-氨甲醯水解酶。在本發明的另一方面，提供所述的突變型D-氨甲醯水解酶的用途，用於生產D-對
輕基苯甘氨酸。在本發明的另一方面，提供一種生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，所述的方法包括利用所述的突變型D-氨甲醯水解酶水解N-氨甲醯-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對羥基苯甘氨酸。在另一優選例中，所述的方法包括培養所述的宿主細胞產生突變型D-氨甲醯水解酶，該突變型D-氨甲醯水解酶水解N-氨甲醯-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對羥基苯甘氨酸。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式本發明人經過長期的研究，獲得了一種突變型D-氨甲醯水解酶，所述的突變型D-氨甲醯水解酶在保持催化產物不變的情況下，單位發酵菌體酶活性大幅度提高，可溶性表達能力也顯著提高。
本發明的多肽(突變型D-氨甲醯水解酶)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括突變型D-氨甲醯水解酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的突變型D-氨甲醯水解酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文 的定義這些片段、衍生物和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。在本發明中，術語「突變型D-氨甲醯水解酶」或「突變型D-氨甲醯水解酶蛋白」指具有突變型D-氨甲醯水解酶活性的SEQ ID NO :3序列的多肽。該術語還包括具有與突變型D-氨甲醯水解酶相同功能的、SEQ ID NO :3序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個、1-3個、或1-2個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括突變型D-氨甲醯水解酶的活性片段和活性衍生物。但是，這些變異形式中，對應於SEQ IDNO 2胺基酸序列的第18位為穀氨酸(E)，第30位為天冬氨酸(D)，第34位為穀氨酸(E)。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與所述的突變型D-氨甲醯水解酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗突變型D-氨甲醯水解酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含突變型D-氨甲醯水解酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了突變型D-氨甲醯水解酶蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有突變型D-氨甲醯水解酶序列的至少約20個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。發明還提供突變型D-氨甲醯水解酶或多肽的類似物。這些類似物與所述的突變型D-氨甲醯水解酶的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如P、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。但是，這些多肽類似物中，對應於SEQ IDNO 2胺基酸序列的第18位為穀氨酸(E)，第30位為天冬氨酸(D)，第34位為穀氨酸(E)。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，「突變型D-氨甲醯水解酶的保守性變異多肽」指與SEQ ID NO 3的胺基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個(如I個、2個或3個)胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行胺基酸替換而產生。這些保守性變異多肽中，對應於SEQ ID NO: 2胺基酸序列的第18位為穀氨酸(E)，第30位為天冬氨酸(D)，第34位為穀氨酸(E)。表I
權利要求
1.一種突變型D-氨甲醯水解酶，其對應於SEQ ID NO :2胺基酸序列的第18位由丙氨酸突變為穀氨酸，第30位酪氨酸突變為天冬氨酸，第34位賴氨酸突變為穀氨酸。
2.如權利要求I所述的突變型D-氨甲醯水解酶，其特徵在於，其是 (a)具有SEQID NO :3所不的氣基酸序列的蛋白；或 (b)由(a)所示的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且該蛋白的胺基酸序列中對應於SEQ ID NO :3第18位上的胺基酸為穀氨酸，對應於SEQ ID NO :3第30位上的胺基酸為天冬氨 酸，對應於SEQ ID NO :3第34位上的胺基酸為穀氨酸。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸選自下組 (i)編碼權利要求I或2所述的突變型D-氨甲醯水解酶的多核苷酸；或 (ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸編碼具有SEQID NO:3所示胺基酸序列的突變型D-氨甲醯水解酶。
5.—種載體，其特徵在於，它含有權利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求5所述的載體，或基因組中整合有權利要求3或4所述的多核苷酸。
7.—種生產突變型D-氨甲醯水解酶的方法，其特徵在於，包括步驟 (1)培養權利要求6所述的宿主細胞，獲得培養物；和 (2)從培養物中分離突變型D-氨甲醯水解酶。
8.權利要求I所述的突變型D-氨甲醯水解酶的用途，用於生產D-對羥基苯甘氨酸。
9.一種生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特徵在於，所述的方法包括利用權利要求I所述的突變型D-氨甲醯水解酶水解N-氨甲醯-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對羥基苯甘氨酸。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，培養權利要求6所述的宿主細胞產生突變型D-氨甲醯水解酶，該突變型D-氨甲醯水解酶水解N-氨甲醯-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對輕基苯甘氨酸。
全文摘要
本發明涉及D-氨甲醯水解酶的突變體及其製備方法和應用。首次獲得了一種突變型D-氨甲醯水解酶，所述的突變型D-氨甲醯水解酶在保持催化產物不變的情況下，單位菌體酶活性大幅度提高，可溶性表達能力也顯著提高。
文檔編號C12N15/63GK102747060SQ20111010327
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月22日 優先權日2011年4月22日
發明者姜世民, 姜衛紅, 楊晟, 楊蘊劉, 蔡淵恆, 顧陽 申請人:中國科學院上海生命科學研究院