一種基於群感效應機制增加微生物洛伐他汀產量的方法

2023-05-21 08:38:46 4

專利名稱：一種基於群感效應機制增加微生物洛伐他汀產量的方法
技術領域：
本發明屬醫藥原料發酵工業領域，具體涉及一種增加微生物洛伐他汀產量的方法。
背景技術：
洛伐他汀是一種能抑制細胞內膽固醇合成的化合物，具有降低膽固醇和甘油三酯的作用，是一種常用的降脂藥物，也是其他他汀類藥物的前體。洛伐他汀作為藥物或藥物原料，主要由土麴黴液體深層發酵生產，而作為保健食品功能成分是將紅麴黴接種在蒸煮後的大米中，經固態發酵而獲得。現有提高洛伐他汀產量的方法主要有菌株選育、培養基組分優化、發酵工藝參數優化調整等，經過長期廣泛的實驗研究及生產實踐探索，以上方法近年來在提高洛伐他汀產量方面已沒有明顯成效。

發明內容
為了克服現有技術中微生物發酵過程中洛伐他汀產量增加不顯著的問題，本發明所要解決的首要技術問題在於提供一種在微生物發酵過程中提高洛伐他汀產量的方法。本發明所要解決的上述技術問題通過以下技術方案予以實現
一種增加微生物洛伐他汀產量的方法，其方法為在用於發酵的培養基中添加不飽和脂肪酸；其中所述的微生物為土麴黴(Aspergi Ilus terreus)或紅麴黴iMonascuspurpureus, Monascus rubber， Monascus fuliginoscus)。作為一種優選方案，在用於發酵的培養基中添加植物油或植物油脂肪酶酶解產物或二者的混合。作為一種優選方案，所述的植物油脂肪酶酶解產物是通過如下方法製備得到在植物油中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液(Tris-HCl緩衝液)和適量的脂肪酶，280C 35°C攪拌反應O. 5 2. O小時。作為一種優選方案，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液的用量是植物油體積的4倍，所述三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液的PH為7. 5^8. O。作為一種優選方案，所述的植物油為花生油、菜籽油、大豆油、葵瓜子油、玉米胚芽油、橄欖油、棉籽油和棕櫚油中的一種或二種以上的混合。作為一種優選方案，所述的微生物發酵其發酵方式為液體深層發酵或固態發酵。作為一種優選方案，所述的不飽和脂肪酸的添加量為培養基總重量的O. 3^5. 0%。作為一種最優選方案，所述的不飽和脂肪酸的添加量為培養基總重量的
O.4^4. 0%。作為一種優選方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產物的添加量為培養基體積或重量的O. 5% 5· 0%。
作為一種優選方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產物添加的時間為發酵開始至發酵結束前2天的任何時間。作為一種優選方案，所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產物為一次性添加或分多次添加。植物油及其脂肪酶酶解產物中的不飽和脂肪酸經微生物代謝產生氧脂素，氧脂素作為真菌(如土麴黴、紅麴黴)群感效應的信號分子，調控洛伐他汀生物合成。與現有技術相比本發明的有益效果為利用本發明所述的方法，可以使微生物在發酵過程中的洛伐他汀產量顯著提高；其中土麴黴液體深層發酵洛伐他汀產量可增加15°/Γ20%，紅麴黴固態發酵洛伐他汀產量可增加18 25%。
具體實施例方式以下結合具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例對發明不做任何形式的限定。以下對比例及實施例中使用的基礎培養基與培養條件為
(1)土麴黴斜面培養基(8/1):蔗糖 30g，NaNO3 3g，K2HP04 lg，MgSO4 · 7H20 O. 5g, KCl
0.5g，FeSO4 · 7H20 0. Olg，瓊脂 15g。(2) 土麴黴種子培養基(g/L):葡萄糖50g,酵母膏IOg,蛋白腖20g, NaCl lg, pH7.2-7. 5。28°C培養 50 小時。(3) 土麴黴液體發酵培養基(g/L):葡萄糖80g,大豆粉25g,蛋白腖15g,NaCl lg,pH自然。土麴黴液態發酵培養使用500mL三角瓶，接種量10%，裝液量10%，搖床轉速 180rpm，28°C培養 12 天。(4)紅麴黴斜面培養基(g/L) :20%馬鈴薯濾液，葡萄糖20g，瓊脂粉15g。(5)紅麴黴種子培養基(g/L) :20%馬鈴薯濾液，葡萄糖50g。28°C培養50小時
(6)紅麴黴米飯培養基大米50g，水50ml，滅菌，冷卻。紅麴黴固態發酵紅麴黴接種
到米飯培養基中，28°C恆溫培養12天。培養基變幹時適量補水。對比例I
(1)菌種活化將土麴黴(CICC2453)接種到土麴黴斜面培養基，28°C培養3天，活化菌
種；
(2)種子液製備將活化好的菌種接種到土麴黴種子培養基28°C、180rpm培養50小時，獲得種子液；
(3)液體深層發酵500mL三角瓶裝土麴黴液體發酵培養基50ml，接種5mL，28°C、180rpm培養12天；
(4)高效液相色譜法測定發酵液中洛伐他汀含量Waters2695 /2996液相色譜儀，Dikma Diamonsil C18 色譜柱(4. 6 mmX 250mm, 5 μ m),柱溫 30°C,檢測波長 238 nm,進樣體積20yL，甲醇-18 mmol/L磷酸水溶液(體積比80 20)為流動相，流速為1.0 mL/min。取發酵液5mL,加入5mL甲醇,25°C、150rpm振蕩3h, IOOOOrpm離心IOmin,上清液用高效液相色譜法(外標法)測定洛伐他汀含量；
(5)本對比例發酵液中洛伐他汀含量為685mg/L。實施例I(O菌種活化同對比例I中的步驟(I);種子液製備同對比例I中的步驟(2)；
(2)液體深層發酵500mL三角瓶裝土麴黴液體發酵培養基50ml，添加花生油I.5 mL,接種 5mL, 28 °C、180rpm 培養 12 天；
(3)高效液相色譜法測定發酵液中洛伐他汀含量同對比例I中的步驟(4)；
(4)本實施例發酵液中洛伐他汀含量為795mg/L。實施例2
Cl)菌種活化同對比例I中的步驟(I);種子液製備同對比例I中的步驟(2)；
(2)液體深層發酵500mL三角瓶裝土麴黴液體發酵培養基50ml，接種5mL，28V、ISOrpm培養12天；並於發酵的第3天、第6天和第9天，在培養液中添加玉米胚芽油各O. 8mL ；
(3)高效液相色譜法測定發酵液中洛伐他汀含量同對比例I中的步驟(4)；
(4)本實施例發酵液中洛伐他汀含量為820mg/L。對比例2
(1)菌種活化將紅麴黴(CICC5031)接種到紅麴黴斜面培養基，28°C培養3天，活化菌
種；
(2)種子液製備將活化好的菌種接種到紅麴黴種子培養基28°C、180rpm培養50小時，獲得種子液；
(3)紅麴黴固態發酵紅麴黴種子液IOmL接種到100克米飯培養基中，28°C恆溫培養12天，發酵結束，60°C真空乾燥得紅曲米；
(4)高效液相色譜法測定洛伐他汀含量Waters2695 /2996液相色譜儀，DikmaDiamonsil C18 色譜柱(4. 6 _X 250mm, 5 μ m),柱溫 3CTC,檢測波長 238 nm,進樣體積20 μ L，甲醇-18 mmol/L磷酸水溶液(體積比80 20)為流動相，流速為I. O mL/min。紅曲米研磨粉碎，取O. 5g,加甲醇5. OmL,浸泡3h,然後於IOOOOrpm離心IOmin,上清液用高效液相色譜法(外標法)測定洛伐他汀含量；
(5)本對比例紅曲米洛伐他汀含量為9.lmg/g。實施例3
(1)菌種活化同對比例2中的步驟(I);種子液製備同對比例2中的步驟(2)；
(2)大豆油酶解10mL大豆油加入 40mL Tris-HCl (60mmol/L CaCl2,ρΗ7· 5_8· O)緩衝液和1000U脂肪酶，35°C攪拌反應I小時，獲得大豆油酶解液；
(3)紅麴黴固態發酵100克米飯培養基接種紅麴黴種子液IOmL，在發酵第8天加5mL大豆油酶解液，28°C恆溫培養12天；發酵結束，60°C真空乾燥得紅曲米；
(4)高效液相色譜法測定紅曲米洛伐他汀含量同對比例2中的步驟(4)；
(5)本實施例紅曲米洛伐他汀含量為11.4mg/g。實施例4
Cl)菌種活化同對比例2中的步驟(I);種子液製備同對比例2中的步驟(2)；
(2)菜籽油酶解10mL大豆油加入 40mL Tris-HCl (60mmol/L CaCl2, ρΗ7· 5_8· O)緩衝液和1000U脂肪酶，35°C攪拌反應I小時，獲得菜籽油酶解液；
(3)紅麴黴固態發酵100克米飯培養基接種紅麴黴種子液10mL，28°C恆溫培養12天，在發酵第4天、第7天和第10天各加ImL菜籽油酶解液；發酵結束，60°C真空乾燥得紅曲米；
(4)高效液相色譜法測定紅曲米洛伐他汀含量同對比例2中的步驟(4)；本實施例紅曲米洛伐他汀含量為10. 9mg/g。
權利要求
1.一種增加微生物洛伐他汀產量的方法，其特徵在於，在用於發酵的培養基中添加不飽和脂肪酸；其中所述的微生物為土麴黴或紅麴黴。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，在用於發酵的培養基中添加植物油或植物油脂肪酶酶解產物或二者的混合。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的植物油脂肪酶酶解產物是通過如下方法製備得到在植物油中加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液和脂肪酶，28°C 35°C攪拌反應O. 5 2. O小時。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液的用量是植物油體積的4倍，所述三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液的PH為7. 5^8. O。
5.根據權利要求2 4任一項所述的方法，其特徵在於，所述的植物油為花生油、菜籽油、大豆油、葵瓜子油、玉米胚芽油、橄欖油、棉籽油和棕櫚油中的一種或二種以上的混合。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的微生物發酵其發酵方式為液體深層發酵或固態發酵。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述的不飽和脂肪酸的添加量為培養基總重量的O. 3 5. 0%。
8.根據權利要求2 4或6所述的方法，其特徵在於所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產物的添加量為培養基體積或重量的O. 59Γ5. 0%。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產物添加的時間為發酵開始至發酵結束前2天的任何時間。
10.根據權利要求2或9所述的方法，其特徵在於所述的植物油或植物油脂肪酶酶解產物為一次性添加或分多次添加。
全文摘要
本發明公開了一種基於群感效應機制增加微生物洛伐他汀產量的方法。其方法為在用於發酵的培養基中添加不飽和脂肪酸；其中所述的微生物為土麴黴或紅麴黴。利用本發明所述的方法，可以使微生物在發酵過程中的洛伐他汀產量顯著提高；其中土麴黴液體深層發酵洛伐他汀產量可增加15%~20%，紅麴黴固態發酵洛伐他汀產量可增加18~25%。
文檔編號C12R1/66GK102925509SQ20121045620
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者李浩明 申請人:廣東藥學院