蛋白質生產被改變的基因失活突變體的製作方法

2023-05-21 04:34:56 1

專利名稱：：蛋白質生產被改變的基因失活突變體的製作方法
技術領域：
：本發明提供了細胞，所述細胞已進行過遺傳學操作，從而具有改變的生產表達蛋白的能力。具體而言，本發明涉及絲狀真菌微生物，例如麴黴屬種(Aspergillusspecies)，其中一種或多種染色體基因已被失活，優選地，其中一種或多種染色體基因從麴黴屬染色體缺失。
背景技術：
：遺傳工程已可以改進用作工業生物反應器、細胞工廠和在食品發酵中使用的微生物。特別地，絲狀真菌(如麴黴屬(Aspergillus)種和木黴屬(Trichoderma)種)和某些細菌(如桿菌(Bacillus)種)產生和分泌大量有用的蛋白質和代謝產物(Bio/Technol.5369-376，713-719和1301-1304[1987]，和Zukowski，″Productionofcommerciallyvaluableproducts，″InDoiandMcGlouglin(eds.)BiologyofBacilliApplicationstoIndustry，Butterworth-Heinemann，Stoneham.Masspp311-337[1992])。重要的生產酶包括包括葡糖澱粉酶、α-澱粉酶、纖維素酶、中性蛋白酶和鹼性(或絲氨酸)蛋白酶，和包括激素和抗體在內的重要生產蛋白。然而，在有些宿主細胞中蛋白質降解和修飾的發生，提供了蛋白質生產的主要障礙，儘管對在絲狀真菌宿主細胞中蛋白質生產的理解有所進展，但是仍舊需要提高重要蛋白質的表達的方法。因而，本發明的目標是提供具有蛋白質降解基因和蛋白質修飾基因缺陷的麴黴屬菌株，其可被用於異源或同源目標蛋白的更有效的生產。發明概述本發明涉及在蛋白質降解和修飾中可能涉及的基因的失活(例如，蛋白酶基因、內質網(ER)降解途徑(degradationpathway)基因和糖基化基因)。在一些實施方式中，基因失活是不可回復的失活，結果導致被稱為失活突變體的遺傳工程微生物細胞。在一些實施方式中，失活突變體具有改變的產生感興趣的表達蛋白的能力。一方面，本發明涉及包括一種或多種不可回復的失活染色體基因的麴黴屬失活突變體，所述失活染色體基因選自derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd和pepF，其組合以及其同源序列。在一些實施方式中，失活突變體將進一步包括不可回復的失活染色體基因，其選自pepB、pepC、pepD、其組合和其同源序列。在其它的實施方式中，麴黴屬失活突變體是黑麴黴(A.niger)失活突變體。在進一步的實施方式中，失活突變體進一步包括編碼異源目標蛋白質的多核苷酸。在另外的實施方式中，目標蛋白質為酶、蛋白酶抑制劑或抗體或其片段。在其它的實施方式中，當麴黴屬失活突變體和親代菌株在基本相同的生長條件下培養時，與相應的親代麴黴屬菌株相比，麴黴屬失活突變體具有增強的目標蛋白質表達水平。在進一步的實施方式中，所述一種或多種失活染色體基因已被剔除或者所述一種或多種失活染色體基因已在蛋白編碼區被破壞。在第二方面，本發明涉及在麴黴屬失活突變體中產生目標蛋白質的方法，其包括a)獲得能夠產生目標蛋白質的麴黴屬失活突變體，其中所述的麴黴屬失活突變體具有至少一種不可回復的失活染色體基因，所述基因選自derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd和pepF，其基因片段以及其同源序列；b)在所述的目標蛋白質被表達的條件下，生長所述的麴黴屬失活突變體；和c)回收目標蛋白質。在一些實施方式中，與所述的目標蛋白質在相應的親代麴黴屬中的表達相比，所述的目標蛋白質在失活突變體中的表達被增強。在一些實施方式中，兩種染色體基因被失活。在另外的實施方式中，麴黴屬失活突變體進一步包括失活染色體基因，所述基因選自pepB、pepC、pepD和其組合以及其同源序列。在另外的實施方式中，目標蛋白質為酶、蛋白酶抑制劑或抗體或其片段。在一些優選的實施方式中，目標蛋白質是異源蛋白質，在其它的實施方式中，目標蛋白質是同源蛋白質。在第三方面，本發明涉及編碼下述蛋白質序列的DNA序列，所述蛋白質序列為DERA、DERB、HTMA、MNN9、MNN10、OCHA、DPP4、Dpp5、PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd以及其功能上的同源序列。在第四方面，本發明涉及包含基因derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc和pepAd的DNA序列。在第五方面，本發明涉及製造重組絲狀真菌細胞的方法，包括將DNA構建物引入絲狀真菌細胞，該DNA構建物與選自derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF或其功能性同源序列的染色體基因進行重組，其中所述染色體基因被失活。在一個實施方式中，失活基因被剔除，在另一個實施方式中，失活基因被破壞。圖1A-B列出了基因組麴黴屬derADNA序列(SEQIDNO1)。圖2列出了推定的DERA蛋白質序列(SEQIDNO2)圖3A-B列出了基因組麴黴屬derBDNA序列(SEQIDNO3)。圖4列出了推定的DERB蛋白質序列(SEQIDNO4)圖5A-E列出了基因組麴黴屬htmADNA序列(SEQIDNO5)。圖6列出了推定的HTMA蛋白質序列(SEQIDNO6)圖7A-D列出了基因組麴黴屬mnn9DNA序列(SEQIDNO7)。圖8列出了推定的MNN9蛋白質序列(SEQIDNO8)圖9A-C列出了基因組麴黴屬mnn10DNA序列(SEQIDNO9)。圖10列出了推定的MNN10蛋白質序列(SEQIDNO10)圖11A-E列出了基因組麴黴屬ochADNA序列(SEQIDNO11)。圖12列出了推定的OCHA蛋白質序列(SEQIDNO12)圖13A-C列出了基因組麴黴屬dpp4DNA序列(SEQIDNO13)。圖14列出了推定的DPP4蛋白質序列(SEQIDNO14)圖15A-B列出基因組麴黴屬dpp5DNA序列(SEQIDNO15)。圖16列出了推定的DPP5蛋白質序列(SEQIDNO16)圖17A-B列出基因組麴黴屬pepAaDNA序列(SEQIDNO17)。圖18列出了推定的PEPAa蛋白質序列(SEQIDNO18)圖19A-C列出了基因組麴黴屬pepAbDNA序列(SEQIDNO19)。圖20列出了推定的PEPAb蛋白質序列(SEQIDNO20)圖21A-B列出了基因組麴黴屬pepAdDNA序列(SEQIDNO21)。圖22列出了推定的PEPAd蛋白質序列(SEQIDNO22)圖23A-C列出了基因組麴黴屬pepFDNA序列(SEQIDNO23)。圖24列出了推定的PEPF蛋白質序列(SEQIDNO24)。圖25A-B列出了基因組麴黴屬pepBDNA序列(SEQIDNO25)。圖26列出了推定的PEPB蛋白質序列(SEQIDNO26)。圖27A-D列出了基因組麴黴屬pepCDNA序列(SEQIDNO27)。圖28列出了推定的PEPC蛋白質序列(SEQIDNO28)。圖29A-B列出了基因組麴黴屬pepDDNA序列(SEQIDNO29)。圖30列出了推定的PEPD蛋白質序列(SEQIDNO30)。圖31A-C列出了基因組麴黴屬pepAcDNA序列(SEQIDNO31)。圖32列出了推定的PEPAc蛋白質序列(SEQIDNO32)。圖33闡述了用於製備根據本發明的失活突變體的一般性克隆策略。圖33A闡述了製造基因缺失的策略，在該策略中使用載體pMW1-ΔderA造成derA基因缺失。進一步的細節在實施例1a中闡述。圖33B闡述了使用載體pBS-破壞(ochA)在基因的蛋白質編碼區造成破壞的策略，如在實施例1f中針對ochA所詳述的。圖34描繪了通過在瓊脂糖凝膠上的分離而對PCR片段進行的分析，所述PCR片段產生自由黑麴黴的失活突變體提取的全細胞DNA。基因mnn9代表了通過剔除(缺失)進行的失活(圖34A)，其中泳道1代表了DNA分子量標記，泳道3代表了包括mnn9基因的親本對照，泳道7代表了mnn9基因缺失的失活菌株。基因ochA代表了通過破壞(disruption)進行的失活(圖34B)，其中泳道1代表了DNA分子量標記，泳道3代表了包括ochA基因的親本對照，泳道7代表了ochA基因缺失的失活菌株。基因組DNA從基因被缺失或基因被破壞的菌株中提取。對於基因缺失或基因破壞，設計了兩種引物；一種引物位於潮黴素基因的編碼區(Phph，SEQIDNO37)，使用的另一種是每一種基因的特異性引物(見SEQIDNOs38、43、48、53、58、61、67、70、73、76、79、84、89、92和95)。如果基因被缺失或破壞，則檢驗到特定的PCR產物。當來自親本對照菌株的DNA作為PCR模板時，則不檢測到條帶。發明詳述本發明提供了具有一種或多種失活基因的重組真菌細胞。在一些實施方式中，真菌細胞已被進行遺傳學操作以便具有改變的生產表達蛋白的能力。具體而言，本發明涉及絲狀真菌細胞，例如具有增強的目標蛋白質表達的麴黴屬細胞，其中一種或多種染色體基因已被失活。在一些優選的實施方式中，所述一種或多種染色體基因已從麴黴屬染色體剔除，在另外的實施方式中，所述一種或多種染色體基因已在蛋白質編碼區被破壞。定義本文引用的所有的專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的所有序列，被清楚地引入作為參考。除非在本文另有限定，本文使用的所用技術和科學術語，具有與本發明所屬的領域中的普通技術人員普遍理解的含義相同的含義(見，例如Singletonetal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork[1994]和HaleandMarham.THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY[1991]，它們都為技術人員提供了本文使用的許多術語的一般釋義)。儘管任何相似或等同於本文描述的方法和材料的那些方法和材料，也可在實踐中使用或用於測試本發明，但優選的方法和材料被描述。數字範圍包括了界定該範圍的數字。如本文中使用的，單數「一」、「一個」和「該」(「a」、「an」和「the」)包括複數含義，除非上下文清楚地另有指明。因此，例如，談及一個(a)「宿主細胞」時，包括多個這樣的宿主細胞。除非另有說明，分別地，核酸被從左到右以5』到3』的方向書寫；胺基酸序列從左到右以氨基到羧基的方向書寫。本文提供的標題不是對本發明的多個方面或實施方式的限制，這些方面或實施方式通過參考整個說明書，可以被理解。因而，下面緊接著定義的術語通過參考整個說明書而被更充分地定義。「相應的親代菌株」(correspondingparentstrain)指衍生出失活突變體的宿主菌株(例如，起源的和/或野生型的菌株)。術語「失活」(inactivation)包括任意方法，其可阻止derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF、pepB、pepC、pepD基因、其片段或其同源物中的一種或多種的功能表達，其中所述基因或基因產物不能實施其已知的功能。基因失活的手段包括缺失、蛋白編碼序列的破壞、插入、添加、突變、基因沉默(例如RNAi基因反義)和類似情況。如本文使用，「蛋白編碼區」(protein-codingregion)指編碼蛋白質胺基酸序列的基因區。如本文使用，「胺基酸」指肽或蛋白質序列或其部分。術語「蛋白質」、「肽」和「多肽」可以互相交換使用。如本文使用，術語「異源蛋白質」指不會自然出現在宿主細胞中的蛋白質或多肽。如本文使用，「同源蛋白質」或「內源性蛋白質」指自然出現在細胞中或在細胞中天然的蛋白質或多肽。如本文使用，「宿主細胞」或「宿主菌株」指這樣的細胞，其有能力作為新引入的DNA序列的宿主或表達載體。在本發明的優選的實施方式中，宿主細胞為麴黴屬某種。如本文使用，術語「麴黴屬」(thegenusAspergillus)包括在屬「麴黴屬」中的所有種，如本領域技術人員已知的，包括但不限定於黑麴黴(A.niger)、米麴黴(A.oryzae)、泡盛麴黴(A.awamori)、河內麴黴(A.kawachi)和構巢麴黴(A.nidulans)。如本文使用，「核酸」指核苷酸或多核苷酸序列，及其片段或部分，以及基因組起源或合成起源的DNA、cDNA和RNA，其可以是雙鏈的或單鏈的，無論其表現為有義鏈還是反義鏈。可以理解，作為遺傳密碼的簡併性的結果，多種核苷酸序列可編碼一個給定的蛋白質。如本文使用，術語「基因」指在產生多肽鏈中所涉及的DNA的染色體片段，其可以包括或者可以不包括在編碼區之前和之後的區域(例如，啟動子、終止子、5』非翻譯序列(5』UTR)或前導(leader)序列和3』非翻譯序列(3』UTR)或尾隨(trailer)序列，以及在各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內含子))。如本文使用，術語「載體」指可在細胞內複製並且可以將新的基因或DNA片段帶入細胞的任意核酸。因此，該術語指被設計用來在不同宿主細胞之間進行轉移的核酸構建物。「表達載體」指能夠將異源DNA片段引入外來細胞並且將其表達的載體。許多原核表達載體和真核表達載體是商業上可獲得的。恰當的表達載體的選擇在本領域技術人員的知識範圍內。如本文使用，術語「DNA構建物」、「表達盒」和「表達載體」指重組或合成產生的核酸構建物，其帶有一連串特定的核酸成分，這些特定的核酸成分允許特定的核酸在靶細胞中轉錄(即，這些是載體或載體元件，如上所述)。重組體表達盒可被引入質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段。典型地，表達載體的重組表達盒部分包括將被轉錄的核酸序列、啟動子和終止子，以及其它序列。在一些實施方式中，DNA構建物也包括一連串特定的核酸成分，其允許特定的核酸在靶細胞中轉錄。在一些實施方式中，本發明的DNA構建物包括選擇標記。如本文使用的，「轉化DNA」、「轉化序列」和「DNA構建物」指被用來將序列引入宿主細胞或生物體的DNA。該DNA可在體外用PCR或其它合適的技術產生。在一些實施方式中，轉化DNA包括引入的(incoming)序列，而在其它實施方式中，轉化DNA進一步包括兩側為同源盒的引入序列。在進一步的實施方式中，轉化DNA包括被加在末端的其它非同源序列(即填充(stuffer)序列或側翼)。末端可以閉合，這樣，轉化DNA形成閉合環，例如，插入到載體內。如本文使用，術語「質粒」指被用作克隆載體的環狀雙鏈(ds)DNA構建物，並且其在許多細菌和一些真核細胞中形成染色體外自複製遺傳元件。在一些實施方式中，質粒被整合到宿主細胞的基因組中。如本文使用，術語「分離的」和「純化的」指核酸或胺基酸(或其它成分)，其被從至少一種與其天然相聯繫的成分中除去。如本文使用，術語「增強的表達」被廣泛理解為包括感興趣蛋白質的增強的產生。增強的表達是指該表達高於在相應的親代菌株中的正常表達水平，所述親代菌株沒有根據本文的教導進行改變，但是其在基本相同的生長條件下生長。如本文使用，術語「表達」指這樣的過程，通過該過程，基於基因的核酸序列，多肽被生產。所述過程包括轉錄和翻譯。在優選的實施方式中，所述過程也包括分泌。如本文使用，在將核酸序列引入細胞的上下文中，術語「引入」指適合將核酸序列轉入細胞的任意方法。如本文使用，術語「轉化的」和「穩定轉化的」指這樣的細胞，該細胞具有整合入其基因組或作為附加體質粒(episomalplasmid)的非天然(異源)多核苷酸序列，所述附加體質粒至少保持兩代。如本文使用，「引入序列(incomingsequence)」指被引入到宿主細胞染色體的DNA序列。在一些實施方式中，引入序列是DNA構建物的一部分。在一些實施方式中，引入序列編碼一種或多種目標蛋白。在另外的實施方式中，引入序列包括可以已經存在於或還沒有存在於將被轉化的細胞的基因組中的序列(即，其可以是同源或異源的序列)。在一些實施方式中，引入序列包括功能性或非功能性基因和/或突變或修飾的基因。在優選的實施方式中，引入序列包括選自derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF、pepB、pepC、pepD、其片段和其同源序列的基因。在另一個實施方式中，引入序列包括選擇標記。在進一步的實施方式中，引入序列包括兩個同源盒。在一些實施方式中，引入序列編碼至少一種感興趣的異源蛋白質。如本文使用，「同源盒」指核酸序列，其與麴黴屬染色體中的序列同源。更具體而言，同源盒為上遊或下遊區域，其與根據本發明待失活的基因或部分基因緊鄰的兩側編碼區域，具有大約80％至100％之間的序列同一性，大約90％至100％之間的序列同一性，或者大約95％至100％之間的序列同一性。這些序列指導DNA構建物或引入序列被整合入染色體中的何處，並且指導哪一部分染色體被DNA構建物或引入序列所取代。不是意圖限制本發明，同源盒可包括大約1個鹼基對(bp)至200千鹼基(kb)。優選地，同源盒包括大約1bp至10.0kb；1bp至5.0kb；1bp至2.5kb；1bp至1.0kb；和0.25kb至2.5kb。同源盒也可包括大約10.0kb、5.0kb、2.5kb、2.0kb、1.5kb、1.0kb、0.5kb、0.25kb和0.1kb。在一些實施方式中，同源盒位於選擇標記的5』端和3』端的兩側，其中所述同源盒包括緊靠基因編碼區的兩側的核酸序列。如本文使用，術語「可選擇標記」和「選擇標記」指能在宿主細胞中表達的核酸(例如基因)，其使得可以容易地選擇那些包含所述標記的宿主。因此，術語「可選擇標記」指提供指示的基因，其指示宿主細胞已經吸收了感興趣的引入DNA或者指示一些其它的反應已經發生。典型地，可選擇標記是基因，其賦予宿主細胞抗微生物劑抗性或代謝優勢，以允許包含外源DNA的細胞與在轉化期間沒有接受任何外源序列的細胞分辨出來。「駐留可選擇標記」(residingselectablemarker)是位於將被轉化的微生物的染色體上的標記。駐留可選擇標記編碼與在轉化DNA構建物上的可選擇標記不同的基因。選擇標記對本領域的技術人員是眾所周知的。如前面指出的，優選地，所述標記為抗微生物劑抗性標記(例如ampR；phleoR；specR；kanR；eryR；tetR；cmpR；hygroR和neoR；見，例如Guerot-Fleury，Gene，167335-337[1995]；Palmerosetal.，Gene247255-264[2000]和Trieu-Cuotetal.，Gene，23331-341[1983])。可與本發明一起使用的其它標記包括但不限於，營養缺陷型標記，例如色氨酸、pyrG和amdS；和檢測標記，例如β-半乳糖苷酶。如本文使用，術語「啟動子」指核酸序列，其行使指導下遊基因轉錄的功能。在優選的實施方式中，所述啟動子適合於表達預期基因的宿主細胞。啟動子，與其它轉錄和翻譯調控核酸序列(也稱為「控制序列」)一起，是表達特定基因所必需的。通常而言，轉錄和翻譯調控序列包括但不限於，啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活子序列。當核酸被置於與其它核酸序列的功能關係中時，該核酸是「可操作連接的」。例如，如果編碼促分泌引導序列(即，信號肽)的DNA被表達為參與多肽分泌的前蛋白(preprotein)，那麼該DNA便被可操作連接到編碼所述多肽的DNA；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，那麼其被可操作連接到編碼序列；或者如果核糖體結合位點被設置以有助於翻譯，那麼該核糖體結合位點被可操作連接到編碼序列。一般來說，「可操作連接的」指，被連接的DNA序列是鄰近的，並且，在促分泌引導序列的情況下，被連接的DNA序列是鄰近的且處於相同的閱讀框(readingphase)。然而，增強子不必是鄰近的。通過在方便的限制性位點的連接作用(ligation)來完成連接。如果這樣的位點不存在，合成的寡核苷酸適體或連接子依照傳統實踐被使用。如本文使用，「同源基因」指來自不同但通常相關的種類的一對基因，其彼此相對應，並且彼此相同或非常相似。該術語包括由於物種形成(即新物種的發生)而分離的基因(例如直向同源基因)，以及由於基因複製而分離的基因(例如共生同源基因)。在優選的實施方式中，同源基因是功能相關的。如本文使用，「直向同源物」和「直向同源基因」指在不同物種的基因，它們是通過物種形成從共同的祖先基因(即同源基因)進化來的。典型地，直向同源物在進化的過程中保留了相同的功能。直向同源物的鑑別在新測序的基因組中基因功能的可靠預測中是有用的。如本文使用，「共生同源物」和「共生同源基因」指在基因組中由於複製而關聯的基因。直向同源物在進化的過程中保持了相同的功能時，而共生同源物進化出新的功能，儘管一些功能通常是與原來的功能相關的。共生同源基因的實例包括但不限於編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，所述酶都是絲氨酸蛋白酶並且在相同的物種裡一起出現。如本文使用，「同源性」指序列相似或相同，優選相同。使用在本領域已知的標準技術(見，例如SmithandWaterman，Adv.Appl.Math.，2482[1981]；NeedlemanandWunsch，J.Mol.Biol.，48443[1970]；PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444[1988]；在WisconsinGeneticsSoftwarePackage(GeneticsComputerGroup，Madison，WI)中的程序例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereuxetal.，Nucl.AcidRes.，12387-395[1984])，確定這種同源性。如本文使用，「同源序列」指核酸或多肽序列，當其與目標核酸或多肽序列進行最佳的比對以便比較時，具有下列程度的序列同一性至少100％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少88％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％或至少60％。在一些實施方式中，同源序列具有80％到100％之間的序列同一性，在另外的實施方式中，具有90％到100％之間的序列同一性，在更優選的實施方式中，具有95％到100％之間的序列同一性。功能性同源序列指相應的基因或蛋白質以與目標基因或蛋白質相同的方式發揮功能。有用的算法的一個實例是PILEUP。PILEUP使用漸進(progressive)、成對的比對從一組相關序列中產生多序列聯配。它也可以作出樹圖，其顯示了用來產生聯配的群集(clustering)關係。PILEUP使用簡化了的Feng和Doolittle(FengandDoolittle，J.Mol.Evol.，35351-360[1987])漸進對比方法。該方法與Higgins和Sharp(HigginsandSharp，CABIOS5151-153[1989])描述的方法相似。有用的PILEUP參數包括預設的空位(gap)加權3.00，預設的空位長度加權0.10和加權的末端空位。有用的算法的另一個實例是Altschul等(Altschuletal.，J.Mol.Biol.，215403-410，[1990]和Karlinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5787[1993])描述的BLAST算法。特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(見，Altschuletal.，Meth.Enzymol.，266460-480[1996])。WU-BLAST-2使用幾個研究參數，其中大多數被設定為默認值。可調整的參數按照下列數值設定重疊範圍(overlapspan)＝1、重疊分數(overlapfraction)＝0.125、字串閾值(wordthreshold)(T)＝11。HSPS和HSPS2參數是動態數值，其可以根據具體序列的組成和檢索目標序列的具體資料庫的組成，由程序自身確定。然而，數值可被調整以增加靈敏度。匹配的相同殘基的數目除以被比對的區域中「較長」序列的總殘基數，便確定了胺基酸序列同一性的百分比數值。所述「較長」序列是在比對區具有最多實際殘基的序列(WU-BLAST-2為了最大化比對分值而引入的空位是不計的)。如本文使用，術語「雜交」指這樣的過程，通過該過程核酸的鏈通過鹼基配對結合到互補鏈上，如本領域已知的。如果核酸序列和參照核酸序列，在中度到高度嚴格的雜交和洗滌條件下，特異性地彼此雜交，該核酸序列被認為「選擇性地雜交」到參照核酸序列上。雜交條件基於核酸結合複合體或探針的解鏈溫度(Tm)。例如，「最大嚴格性」典型的發生在大約Tm-5℃(探針Tm以下5℃)；「高度嚴格性」在Tm以下大約5-10℃；「中度嚴格性」在探針Tm以下大約10-20℃；「低度嚴格性」在Tm以下大約20-25℃。功能上，最大嚴格條件可被用來鑑別與雜交探針具有嚴格同一性或接近嚴格同一性的序列；而中度或低度嚴格雜交可被用來鑑別或檢測多核苷酸序列同源物。中度和高度嚴格雜交條件在本領域是眾所周知的。高度嚴格條件的實例包括在大約42℃、在50％甲醯胺、5XSSC、5XDenhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml變性載體DNA中雜交，然後在2XSSC和0.5％SDS中在室溫下洗滌兩次，在0.1XSSC和0.5％SDS中在42℃再洗滌兩次。中度嚴格條件的實例包括在37℃、在包含20％甲醯胺、5XSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA的溶液中溫育過夜，然後在1XSSC中在大約37-50℃洗滌濾膜。本領域技術人員知道如何調整溫度、離子強度等，這對於適應例如探針長度等因素是必需的。如本文使用，「重組的」包括表示這樣的細胞或載體，其已經通過引入異源核酸序列而被修飾，或者表示細胞是衍生自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達沒有在細胞的天然(非重組)形式中以相同形式找到的基因，或者由於人類有意的幹預，重組細胞表達以另外的方式異常表達、不足表達、過度表達或根本不表達的天然基因。「重組」(recombination)、「重組」(recombining)或產生「重組的」核酸通常是將兩個或多個核酸片段裝配，其中所述裝配產生嵌合基因。在一個可選擇的實施方式中，轉化DNA序列包括同源盒，沒有引入序列的存在。在該實施方式中，預期缺失在兩個同源盒之間的內源DNA序列。而且，在一些實施方式中，轉化序列是野生型的，而在另外的實施方式中，轉化序列是突變或修飾的序列。另外，在一些實施方式中，轉化序列是同源的，而在另外的實施方式中，轉化序列是異源的。如本文使用，術語「靶序列」指在宿主細胞中編碼這樣的序列的DNA序列，預期引入序列將在這樣的序列處插入到宿主細胞基因組。在一些實施方式中，靶序列編碼功能性野生型基因或操縱子，而在其它的實施方式中，靶序列編碼功能突變基因或操縱子，或者編碼非功能性的基因或操縱子。如本文使用，「側翼序列」指在被討論序列的上遊或下遊的任意序列(例如，對於基因A-B-C，A和C基因序列位於基因B的兩側)。在優選的實施方式中，同源盒位於引入序列兩側的每一側。在另外的實施方式中，引入序列和同源盒構成一個單元，填充序列位於所述單元兩側的每一側。在一些實施方式中，側翼序列僅僅存在於一側(3』或5』)，而在優選的實施方式中，其存在於序列兩側的每一側上。每一個同源盒的序列與麴黴屬染色體的序列同源。這些序列指導新的構建物整合到麴黴屬染色體中的哪裡，並且指導麴黴屬染色體的哪一部分被引入序列所取代。在一些實施方式中，這些序列指導新的構建物整合到麴黴屬染色體中的哪裡，而沒有任何一部分染色體被引入序列所取代。在優選的實施方式中，包含一部分失活染色體片段的多核苷酸序列位於選擇標記的5』端和3』端的兩側。在一些實施方式中，側翼序列僅存在於一側(3』或5』)，而在優選的實施方式中，其存在於序列兩側的每一側上。如本文使用，術語「引物」指寡核苷酸，無論是作為純化的限制性消化產物天然出現的，或者是合成產生的，當被置於與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成被誘導的條件下(即，在存在核苷酸和誘導劑例如DNA聚合酶時，以及在適當的溫度和pH下)時，該寡核苷酸可作為引發合成的起點。引物優選單鏈以獲得最大效率的擴增。優選地，引物為寡脫氧核糖核苷酸。如本文使用，術語「聚合酶鏈反應」(「PCR」)指美國專利第4,683,195、4,683,202和4,965,188號的方法，其在這裡引入作為參考。如本文使用，術語「限制性內切核酸酶」和「限制性酶」指細菌酶，其每一個在特異性核苷酸序列上或在其附近切割雙鏈DNA。「限制性位點」指被特定限制性內切核酸酶識別和切割的核苷酸序列，並且限制性位點通常是用於插入DNA片段的位點。在本發明某些實施方式中，限制性位點被設計到選擇標記中，以及被設計到DNA構建物的5』和3』端。如本文使用，「菌株存活力」指增殖活力。在優選的實施方式中，在實驗室條件下，染色體基因的失活不會嚴重影響失活突變體的分裂和存活。如本文使用，術語「染色體整合」指引入序列被引入宿主細胞(例如麴黴屬)染色體的過程。引入(轉化)DNA的同源區與染色體的同源區聯配。隨後，同源盒之間的序列通過雙交換，被引入序列所取代(即同源重組)。「同源重組」指在兩個DNA分子之間或成對染色體之間在相同或接近相同的核苷酸序列位點上，交換DNA片段。在優選的實施方式中，染色體整合是通過同源重組進行的。優選的實施方式本發明提供能生產感興趣的蛋白的失活突變體(例如缺失突變體和破壞突變體)。具體而言，本發明涉及重組絲狀真菌微生物，例如具有改變的目標蛋白表達的麴黴菌種，其中一種或多種染色體基因已被失活，優選地，其中一種或多種染色體基因已從麴黴屬染色體上剔除，或者其中一種或多種染色體基因的蛋白編碼區已被破壞。實際上，本發明提供了用於剔除單一或多種基因的方法。在優選的實施方式中，這樣的剔除提供了好處，例如提高了目標蛋白質的生產。失活基因如上面指出的，本發明包括涉及單一或多種基因失活的實施方式。在一些實施方式中，基因失活是基因缺失或基因破壞。在一些實施方式中，失活是不可回復的。根據本發明將被失活的基因包括但不限於涉及蛋白質降解或蛋白質修飾的那些基因，例如ER降解途徑中的蛋白質、蛋白酶基因，例如分泌的絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶基因、糖基化基因和糖蛋白降解基因。在一些實施方式中，將被失活的染色體基因包括一種或多種下列的基因derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc和pepAd；或者與其具有至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少88％、至少85％、至少80％、至少70％或至少60％的序列同一性的功能性同源序列。關於根據本發明將被失活的基因，derA和derB基因被認為在ER降解途徑中行使作用。ER降解途徑的酶包括ER駐留蛋白，例如在錯誤摺疊蛋白從ER到胞質的易位中所涉及的蛋白，以及非ER駐留蛋白，例如遍在蛋白綴合酶，其以錯誤摺疊蛋白為靶標以進行蛋白酶體降解(BonifacinoandWeissman[1998]Ann.Rev.Cell.Biol.1419-57)。htmA、mnn9、mnn10和ochA基因被認為在糖蛋白修飾中行使作用。糖蛋白修飾酶是修飾寡糖分子的酶，所述寡糖分子被加入到蛋白質上的胺基酸殘基。dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepB、pepC和pepD基因被認為是蛋白酶。蛋白酶是蛋白降解酶，其催化蛋白質的水解切割。更具體而言，蛋白酶是切割肽鍵的酶。在一些實施方式中，蛋白酶基因是天冬氨酸蛋白酶(例如pepAa、pepAb、pepAc、pepAd和pepB)。具有酶促活化的天冬氨酸蛋白酶，是在其活性位點包括天冬氨酸殘基的那些酶或其片段(Kosta，V(Ed)ASPARTICPROTEINASESANDTHEIRINHIBITORS，WalterdeGruyter，NYpp27-40；151-161and163-177)。在另外的實施方式中，蛋白酶基因是二肽醯肽酶(例如dpp4和dpp5)。在另外的實施方式中，蛋白酶基因是絲氨酸羧肽酶(例如pepF)，在另外的實施方式中，蛋白酶基因是絲氨酸蛋白酶(例如pepC和pepD)。在一些實施方式中，失活基因將包括兩種或多種(例如兩種、三種或四種)根據本發明的失活基因。在其它的實施方式中，失活基因將包括至少一種上述的基因和選自pepB、pepC、pepD、其組合和與其具有至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少88％、至少85％、至少80％、至少70％或至少60％的序列同一性的功能性同源序列的基因。在其它的實施方式中，失活基因將包括上面列舉的基因中的任何一種和失活的pepA基因或其同源序列，例如在Berka等，[1990]Gene86153-162、美國專利5,840,570和美國專利6,509,171公開的aspergillopesins。並不打算用任何方式限制本發明，將被失活的基因包括下列組合和其功能性同源基因(a)mnn9和mnn10；(b)mnn9和ochA；(c)mnn9、mnn10和ochA；(d)dpp4和dpp5；(e)dpp4、dpp5和pepA；(f)pepAa和pepAb；(g)pepAa、pepAb和pepAc；(h)pepAa和pepAc；(i)pepAa、pepAb、pepAc和pepB；(j)pepAa、pepAb、pepAc和pepC；(k)pepAa、pepAb、pepAc和pepD；(I)pepB、pepC、pepD和pepF；(m)pepAa、pepAb和pepAc；和n)dpp4、dpp5和mnn9。進一步的實施方式包括上述組合(a-n)中的任意一種和失活的pepA基因或其同源基因。[100]在一些實施方式中，麴黴屬的這些基因的DNA編碼序列被提供在SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO15、SEQIDNO17、SEQIDNO19、SEQIDNO21、SEQIDNO23、SEQIDNO25、SEQIDNO27、SEQIDNO29和SEQIDNO31。如上面指出的，預期在絲狀真菌細胞中發現的功能性同源基因，將在本發明中有用。在一些實施方式中，功能性同源基因將與上面列舉的序列中的任何一種具有至少80％的序列同一性。[101]用於確定宿主細胞中的同源序列的方法在本領域是已知的，方法包括使用本文公開的核酸序列構建寡核苷酸探針，所述探針與被編碼的蛋白的大約6到20個胺基酸相對應。然後，該探針可被用來克隆同源的蛋白降解基因。使用適當的限制性酶分離和消化絲狀真菌宿主基因組DNA。分離片段，並按照標準方法使用從蛋白質降解序列製備的寡核苷酸探針探測片段。分離對應於通過與寡核苷酸探針雜交而被鑑定出的DNA片段的片段，將該片段連接到適當的載體，然後轉化到宿主中以產生DNA克隆。[102]在另外的實施方式中，DNA編碼選自下列的蛋白序列SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12、SEQIDNO14、SEQIDNO16、SEQIDNO18、SEQIDNO20、SEQIDNO22、SEQIDNO24、SEQIDNO26、SEQIDNO28、SEQIDNO30和SEQIDNO32，以及其功能性同源序列。在一些實施方式中，功能性同源序列將是在絲狀真菌細胞(即麴黴屬)中找到的蛋白，並且與上面列舉序列的任何一個具有至少95％的序列同一性。在一些實施方式中，功能性同源序列將在黑麴黴或米麴黴中找到，並且將與上面列舉序列的任何一個具有至少90％或具有至少95％的序列同一性。在其它的實施方式中，通過一個或多個保守的胺基酸取代，蛋白序列將與上面列舉序列的任何一個有所不同，所述保守的胺基酸取代例如但不限於下列組甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和穀氨酸；天冬醯胺和穀氨醯胺；絲氨酸和蘇氨酸；色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；以及賴氨酸和精氨酸。失活的方法和用來失活染色體基因的DNA構建物的一般性構建[103]在一些實施方式中，本發明包括包含了引入序列的DNA構建物。該DNA構建物被在體外進行組裝，然後構建物被直接克隆入感受態宿主(例如麴黴屬宿主)，這樣，DNA構建物整合入宿主染色體。例如，PCR融合和/或連接可被用來在體外組裝DNA構建物。在一些實施方式中，DNA構建物是非質粒構建物，而在另外的實施方式中，DNA構建體被併入載體(例如質粒)。在一些實施方式中，使用環狀質粒。在優選的實施方式中，設計環狀質粒以便使用適當的限制性酶(即，不會破壞DNA構建物的酶)。因此，線性質粒在本發明中可用。[104]在一些實施方式中，引入序列包括derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF、pepC、pepB、pepD基因、其基因片段、其同源序列；或者臨近的染色體編碼區側翼序列。同源序列為這樣的核酸序列，其與上面列舉的序列之一具有功能相似性，並且其與derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF、pepB、pepC、pepD基因或其基因片段具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、70％或60％的序列同一性。[105]在一些實施方式中，其中基因組DNA是已知的，通過兩個PCR反應克隆出將被缺失的基因的5』側翼片段和3』側翼片段，在所述基因被破壞的實施方式中，通過一個PCR反應克隆所述DNA片段。[106]在一些實施反式中，編碼區側翼序列包括大約1bp到2500bp的範圍；大約1bp到1500bp的範圍；大約1bp到1000bp的範圍；大約1bp到500bp的範圍和大約1bp到250bp的範圍。構成編碼區側翼序列的核酸序列的數目，在基因編碼序列的每一端可以是不同的。例如，在一些實施方式中，編碼序列的5』端包括25bp以下，編碼序列的3』端包括100bp以上。[107]在一些實施方式中，引入序列包括選擇標記，其5』端和3』端的兩側為基因序列的片段。在另外的實施方式中，當包括選擇標記和基因、基因片段或其同源序列的DNA構建物被轉化入宿主細胞時，選擇標記的位置致使該基因沒有它原本應有的功能。在一些實施方式中，引入序列包括位於基因啟動子區的選擇標記。在另外的實施方式中，引入序列包括位於基因啟動子區之後的選擇標記。在又一個另外的實施方式中，引入序列包括位於基因編碼區的選擇標記。在進一步的實施方式中，引入序列包括選擇標記，同源盒位於該選擇標記的兩側的每一邊。在又進一步的實施方式中，引入序列包括中斷編碼序列的轉錄和/或翻譯的序列。在另外的實施方式中，DNA構建物包括被設計在該構建物上遊和下遊端的限制性位點。[108]無論DNA構建物是被併入載體或者是在不存在質粒DNA的情況下使用，DNA構建物被用來轉化微生物，其導致了失活突變體，優選地，所述突變體具有穩定和不可回復的染色體基因失活。用來連接DNA構建物和將其插入適當的載體的方法在本領域是眾所周知的。通常通過在方便的限制性位點的連接作用來完成連接。如果這類位點不存在，那麼合成的寡核苷酸連接子依照傳統實踐被使用(見，Sambrook(1989)supra，andBennettandLasure，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPress，SanDiego(1991)pp70-76)。另地，可以使用已知的重組技術構建載體(例如，InvitrogenLifeTechnologies.GatewayTechnology)。可在本發明的實踐中使用的適當的表達載體和/或整合載體的實例被提供在Sambrooketal.，(1989)supra，Ausubel(1987)supra，vandenHondeletal.(1991)inBennettandLasure(Eds.)MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPresspp.396-428和美國專利第5,874,276號。特別有用的載體包括pFB6、pBR322、pUC18、pUC100和pENTR/D。[109]在一些實施方式中，DNA構建物的至少一個拷貝被整合到宿主染色體。在一些實施方式中，本發明的一種或多種DNA構建物被用來轉化宿主細胞。例如，一種DNA構建物可被用來失活derA基因，而另一種構建物可被用來失活derB基因。當然，本發明考慮和提供了另外的組合。[110]失活通過任合適合的手段發生，包括在所述核酸基因序列中進行刪除、取代(例如突變)、中斷和/或插入，以及基因沉默機制，例如RNA幹擾(RNAi)。在一個實施方式中，失活基因的表達產物是截短的蛋白質，其在蛋白質的生物活性上具有相應的改變。在優選的實施方式中，失活導致了基因生物活性的丟失。在一些實施方式中，相比相應的親代菌株中的相同基因或功能性同源基因的生物活性，重組真菌細胞中的失活基因的生物活性將在25％以下(例如20％、15％、10％、5％和2％)。[111]在一些優選的實施方式中，通過缺失，實現失活，在其它優選的實施方式中，通過基因的蛋白編碼區的破壞，實現失活。在一些實施方式中，通過同源重組使基因失活。如本文使用，基因的「缺失」指全部編碼序列的缺失、部分編碼序列的缺失或包括側翼區域的編碼序列的缺失。只要留在染色體中的序列致使基因功能失活，那麼所述缺失可以是部分的。在優選的實施方式中，缺失突變體包括一種或多種基因的缺失，這樣導致了穩定且不可回復的缺失。編碼序列的側翼區域可以在5』和3』端包括大約1bp到大約500bp。側翼區域可大於500bp，但側翼區域優選不在根據本發明可被失活或剔除的區域中包括其它的基因。最終結果是，缺失的基因是有效地非功能性的。簡單地說，「缺失(剔除)」被定義為核苷酸或胺基酸序列的變化，其中一個或多個核苷酸或胺基酸殘基分別被除去(即，不存在)。並不打算限制用來失活的方法，在一些實施方式中，derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、pepC和pepB和功能性同源基因可以通過剔除而被失活。[112]「破壞(disruption)」是在核苷酸或胺基酸序列中的變化，當與親代或自然發生的序列比較時，其分別導致了一個或多個核苷酸或胺基酸殘基的添加。在一些實施方式中，破壞可以是在體外通過限制性酶位點將標記基因插入到蛋白編碼區。編碼序列的側翼區域可以在5』和3』端包括大約1bp到大約500bp。側翼區域可大於500bp，但是優選地在該區域不包括其它基因。DNA構建物與宿主染色體的同源序列聯配，並且在雙交換事件中，基因的翻譯或轉錄被破壞。例如，包含基因或基因編碼序列的一部分和選擇標記的質粒與ochA染色體基因聯配。在一些實施方式中，選擇標記位於基因編碼序列內或在與基因分開的質粒部分上。將載體整合入宿主染色體，並且通過將標記插入到編碼序列來失活該基因。並不打算限制用來失活的方法，在一些實施方式中，這種方法可以使ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF、pepD和功能性同源序列失活。[113]「插入」或「添加」是在核酸或胺基酸序列中的變化，其中，當與內源染色體序列或蛋白質產物比較時，一個或多個核苷酸或胺基酸殘基已被添加。在一些實施方式中，使用質粒作為載體，在單交換事件中進行的插入導致了失活。例如，將載體整合入宿主細胞染色體，並且通過在基因的蛋白質編碼序列或者在基因的調控區插入載體，使該基因失活。[114]在可選擇的實施方式中，由於基因的突變產生了失活。突變基因的方法在本領域是眾所周知的，包括但不限於定點突變、隨機突變的產生和缺口雙鏈體方法(見例如美國專利第4,760,025號；Moringetal.，Biotech.2646[1984]；andKrameretal.，NucleicAcidsRes.，129441[1984])。宿主細胞[115]在本發明中，宿主細胞優選絲狀真菌細胞(見，Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYork)，優選的絲狀真菌細胞包括麴黴屬某種(例如米麴黴、黑麴黴、泡盛麴黴、構巢麴黴、醬油麴黴(A.sojae)、日本麴黴(A.japonicus)、河內麴黴(A.kawachi)和棘孢麴黴(A.aculeatus))；根黴屬某種(Rhizopussp.)、木黴屬某種(Trichodermasp.)(例如裡氏木黴(Trichodermareesei)(以前被分類為長枝木黴(T.longibrachiatum)，現在也稱為紅褐肉座菌(hypocreajecorina))、綠色木黴(Trichodermaviride)、康氏木黴(Trichodermakoningii)和哈茨木黴(Trichodermaharzianums)))和毛黴屬某種(Mucorsp.)(例如米黑毛黴(Mmiehei)和微小根毛黴(Mpusillus))。最優選的宿主細胞為黑麴黴細胞。在一些實施方式中，黑麴黴特定的菌株包括ATCC22342(NRRL3112)、ATCC44733和ATCC14331和從其衍生的菌株。在一些實施方式中，宿主細胞是能表達異源基因的細胞。宿主細胞可以是重組細胞，其包括異源蛋白。在另外的實施方式中，宿主是這樣的細胞，其過表達已被引入細胞的蛋白質。在一些實施方式中，宿主菌株是一個或多個基因有缺陷的突變菌株，所述基因，例如，相應於除本文公開的蛋白酶基因之外的蛋白酶基因的基因。例如，優選的宿主為黑麴黴，其中，編碼主要分泌的天冬氨醯蛋白酶例如aspergillopepsin的基因已被剔除(美國專利第5,840,570號和第6,509,171號)。確定基因失活的方法[116]本領域的技術人員可使用多種方法來確定基因是否已被失活。並不打算限制本發明，一種可以使用的方法為被Zhu(Zhuetal.，AcatMycologicaSinica1334-40[1994])描述的苯酚/氯仿方法。簡言之，在該方法中，基因組DNA被用作進行PCR反應的模板。設計引物，這樣，一種引物與選擇標記基因(例如潮黴素抗性標記基因，hph)退火，另一引物與在基因3』端的距離DNA同源片段的3』端遠處的序列退火。當失活突變體的基因組DNA被用作PCR反應模板時，失活突變體將產生特定的PCR產物，與之相反，當相應的親代菌株(具有非失活基因)基因組DNA被用作模板時，將不會產生PCR片段。另外，失活突變體的PCR片段可經過DNA測序來確認失活基因的情況。其它可用的方法包括包括Southern分析，可參考Sambrook(1989)supra。感興趣的蛋白(目標蛋白)[117]在一些實施方式中，本發明包括的失活突變體將過表達目標同源蛋白質，在另外的實施方式中，本發明包括的失活突變體將表達目標異源蛋白質。[118]在一些實施方式中，目標蛋白質是細胞內的，而在另外的實施方式中，目標蛋白是分泌多肽。另外，目標蛋白可以是融合蛋白或雜合蛋白。優選的多肽包括酶，其包括但不限於選自澱粉分解酶、蛋白水解酶、細胞裂解酶、氧化還原酶和植物細胞壁降解酶的酶。更具體而言，這些酶包括但不限於澱粉酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶(perioxidase)、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、肌醇六磷酸酶、果膠酶、葡萄糖苷酶、異構酶、轉移酶、半乳糖苷酶和幾丁質酶。特別優選的酶包括但不限於澱粉酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、酚氧化酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡萄糖氧化酶和肌醇六磷酸酶。在本發明一些特別優選的實施方式中，目標多肽是蛋白酶、纖維素酶、葡糖澱粉酶或澱粉酶。這些酶在本領域是眾所周知的。[119]在一些實施方式中，目標蛋白是分泌多肽，其被融合到信號肽(即在將被分泌的蛋白質上的氨基端延伸)。幾乎所有的分泌蛋白都使用氨基端的蛋白質延伸，其在前體蛋白質向膜的靶向和其跨膜的轉移中起關鍵的作用。該延伸通過信號肽酶，在膜轉移期間或者膜轉移之後馬上進行蛋白水解而除去。[120]在本發明的一些實施方式中，目的多肽是這樣的蛋白質，例如蛋白酶抑制劑，其抑制蛋白酶的作用。蛋白酶抑制劑在本領域是眾所周知的，例如屬於絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的蛋白酶抑制劑，已知它們可抑制胰蛋白酶(trysin)、組織蛋白酶G、凝血酶和組織激肽釋放酶。特別優選的蛋白酶抑制劑包括Bowman-Birk抑制劑和大豆胰蛋白酶抑制劑(見，Birk，Int.J.PeptProteinRes.25113-131[1985]；Kennedy，Am.J.Clin.Neutr.681406S-1412S[1998]andBillingsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.893120-3124[1992])。[121]在本發明的一些實施方式中，目的多肽選自激素、抗體、生長因子、受體、細胞因子等等。本發明包括的激素包括但不限於，促濾泡素、促黃體激素、促腎上腺皮質素釋放因子、促生長素抑制素、促性腺激素、血管加壓素、催產素、促紅細胞生成素、胰島素和類似物。生長因子包括但不限於血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、神經生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子、細胞因子例如白介素(例如IL-1到IL-13)、幹擾素、集落刺激因子和類似物。抗體包括但不限於，從預期可產生抗體的任意物種中直接獲得的免疫球蛋白。另外，本發明包括修飾的抗體。本發明也包括多克隆和單克隆抗體。在特別優選的實施方式中，抗體或其片段是人源化的抗體，例如抗-p185Her2和HulD10-。[122]在進一步的實施方式中，編碼目標蛋白的核酸被可操作連接到適當的啟動子，其在真菌宿主細胞中表現出轉錄活性。啟動子可來自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白的基因。啟動子可以是截短啟動子或者雜合啟動子。進一步，啟動子可以是誘導型啟動子。優選地，啟動子可用於木黴屬宿主或麴黴屬宿主中。啟動子的適當的非限制性實例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、xyn1和amy。在一個實施方式中，啟動子是相對於宿主細胞為天然的啟動子。有用的啟動子的其它實例包括來自下列基因的啟動子泡盛麴黴和黑麴黴葡糖澱粉酶基因(glaA)(Nunbergetal.，(1984)Mol.CellBiol.42306-2315andBoeletal.，(1984)EMBOJ.31581-1585)；米麴黴TAKA澱粉酶；米黑根酶天冬氨酸蛋白酶；黑麴黴中性α-澱粉酶；黑麴黴酸穩定α-澱粉酶；裡氏木黴xln1和纖維二糖水解酶1基因啟動子(EPA137280A1)，以及其突變的、截短的和雜合的啟動子。[123]在一些優選實施方式中，多肽編碼序列被可操作連接到指導編碼多肽進入細胞分泌途徑的信號序列。編碼序列的5』端可天然地包括，按翻譯閱讀框與編碼分泌多肽的編碼區片段天然連接的信號序列。編碼信號序列的DNA優選那些與將被表達的多肽天然連接的DNA。優選地，信號序列由黑麴黴α-澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶或黑麴黴葡糖澱粉酶編碼。在一些實施方式中，信號序列是可操作連接到cdh1啟動子的木黴cdh1信號序列。真菌細胞的轉化[124]將DNA構建物或載體引入宿主細胞包括下列技術，例如轉化；電穿孔；核微注射；轉導；轉染(例如，脂轉染調節的轉染和DEAE-Dextrin介導的轉染)；用磷酸鈣溫育沉澱DNA；使用DNA包被的微射彈進行高速轟擊；農桿菌介導的轉化和原生質體融合。一般的轉化技術在本領域是已知的(見，例如Ausubeletal.，(1987)，supra，chapter9；andSambrook(1989)supra，Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56andTHEBIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI，Chap.6.Eds.FinkelsteinandBall(1992)ButterworthandHeinenmann)。異源蛋白在木黴中的表達描述在美國專利第6,022,725號；美國專利第6,268,328號；Harkkietal.(1991)；EnzymeMicrob.Technol.13227-233；Harkkietal.，(1989)BioTechnol.7596-603；EP244，234；EP215，594；andNevalainenetal.，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes」，inMOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY，Eds.LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp.129-148)。對於麴黴屬菌株的轉化，也參考Cao等，(2000)Sci.9991-1001和美國專利第6,509,171號。然後使用已知的技術純化轉化子。細胞培養[125]真菌細胞可以在傳統的培養基中生長。用於轉化細胞的培養基可被改性為適合用於活化啟動子和選擇轉化子。具體的培養條件，例如溫度、pH和類似條件，對本領域的技術人員是明顯的。優選的培養條件可在科學文獻例如Sambrook，(1982)supra以及從美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)找到。另外，用於生產異源蛋白質的發酵過程，在本領域是已知的。例如，可以使用固體培養或浸沒培養生產蛋白質，包括分批、補料分批和連續流動工藝。發酵溫度可以稍微變化，但是對於絲狀真菌例如黑麴黴，溫度通常在大約20℃到40℃的範圍內，通常優選的在大約28℃到37℃的範圍內，這取決於所選擇的微生物菌株。含水微生物發酵物(發酵混合物)的pH範圍應該在大約2.0到8.0的典型範圍內。對於絲狀真菌，pH通常在大約2.5到8.0的範圍內；對於黑麴黴，pH通常在大約4.0到6.0的範圍內，優選地在大約4.5到5.5的範圍內。發酵混合物在發酵罐裡的平均存留時間可以有極大的變化，這部分取決於發酵溫度和所使用的培養物，但通常平均存留時間在大約24到500小時的範圍內，優選地，目前在大約20到400小時。儘管目前優選在15LBiolafitte(Saint-Germain-en-Laye，France)中操作，但是使用的發酵罐的類型不是關鍵的。確定表達蛋白的活性的方法[126]各種用於檢測和測量細胞內和細胞外表達的多肽活性的方法，對本領域的普通技術人員是已知的。用於確定在宿主細胞內目標蛋白分泌水平和檢測表達蛋白的方法，包括使用免疫測定，所述免疫測定使用蛋白特異性的多克隆抗體或單克隆抗體。實例包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、螢光免疫測定(FIA)和螢光活化細胞分撿(fluorescentactivatedcellsorting，FACS)。然而，其它的方法對本領域技術人員是已知的，它們可以用於評估目標蛋白(見，例如Hamptonetal.，SEROLOGICALMETHODS，ALABORATORYMANUAL，APSPress，St.Paul，MN[1990]；andMaddoxetal.，J.Exp.Med.，1581211[1983])。在一些優選的實施方式中，目標蛋白的表達和/或分泌在失活突變體中得到增強。在一些實施方式中，相對於相應的親代菌株，失活突變體中目標蛋白的產生多至少100％、至少95％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少15％、至少10％、至少5％和至少2％。蛋白回收[127]一旦需要的蛋白被表達，並且任選地，被分泌，目標蛋白可被回收並進一步純化。從發酵肉湯回收和純化目標蛋白可通過在本領域本身已知的方法進行。通常，發酵肉湯包括細胞碎片以及需要的蛋白產品，所述細胞碎片包括細胞、各種懸浮固體和其它的生物材料汙染物。[128]用於此類除去的適當方法包括傳統的固液分離技術，例如離心、過濾、透析、微過濾、旋轉真空過濾或其它已知的方法，以產生無細胞的濾液。在使用技術例如超濾、蒸發或沉澱進行結晶之前，可優選進一步濃縮發酵肉湯或無細胞濾液。[129]可以依靠鹽來沉澱上清液或濾液的蛋白質成分，然後利用各種層析方法進行純化，例如離子交換層析、親和層析或本領域已知的類似技術。當被表達的期望多肽被分泌時，多肽可從生長培養基中純化。優選地，在多肽純化之前，從培養基中除去表達宿主細胞(例如通過離心)。[130]當被表達的重組期望多肽不從宿主細胞中分泌時，優選地，宿主細胞被碎解，多肽被釋放到含水「提取物」中，這是純化的第一階段。優選地，在細胞碎解之前，從培養基收集表達宿主細胞(例如通過離心)。[131]本領域技術人員，通過參考下列的實施例，可以更充分地理解實施本發明的方式和方法，這些實施例並不打算以任何方式限制本發明或其涉及的權利要求的範圍。實驗[132]提供下列的實施例以便證明和進一步闡明本發明的某些優選實施方式和方面，它們不被理解為是對其範圍的限制。[133]在下面的實驗公開內容中，使用下列縮寫℃(攝氏度)；H2O(水)；dH2O(去離子水)；HCl(鹽酸)；aa(胺基酸)；bp(鹼基對)；kb(千鹼基對)；kD(千道爾頓)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μl(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；NaCl(氯化鈉)；PBS(磷酸緩衝鹽溶液[150mMNaCl，10mM磷酸鈉緩衝液，pH7.2])；PCR(聚合酶鏈反應)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；w/v(質量比體積)；v/v(體積比體積)；ATCC(美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Rockville，MD)；BDBioSciences(以前的CLONTECHLaboratories，PaloAlto，CA)；Invitrogen(InvitrogenCorp.，SanDiego，CA)；和Sigma(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。[134]下面表1闡明了在實施例中使用以使相應的基因失活的引物(和它們的序列鑑定情況)。表1實施例1麴黴屬缺失構建物和菌株的產生[135]使用在內質網(ER)降解[Der1基因(M.Knopetal，[1996]EMBOJ.15753-763)，Der2基因(Hilleretal，[1996]Science2731725-1728)和Htm1基因(C.Jakobetal，[2001]EMBOreport21423-430)]和糖基化[(Mnn9基因(Yipetal.，[1994]Proc.NatlAcad.Sci.912723-2727，Mnn10(Deanetal.，[1996]Glycobiol.673-81和Ochl(Nakayamaetal.[1992]EMBOJ112511-2519)]中被涉及的已知酵母基因去檢索麴黴屬基因組序列資料庫以找出同源基因。基於基因的注釋，ddp4和ddp5基因是來自麴黴屬基因組序列資料庫。使用黑麴黴pepA基因(Berkaetal.[1990]Gene86153-162)去檢索麴黴屬基因組序列資料庫以找出同源基因(pepAa、pepAb、pepAc和pepAd)。黑麴黴pepB(Inoueetal.[1991]J.Biol.Chem26619484-19489)；pepC(Fredericketal.，[1993]Gene12557-64)；pepD(Jaraietal.，[1994]Gene13951-57)和pepF(vandenHomberghetal.，[1994]Gene15173-79)可在公共資料庫中找到。a.derA基因的缺失[136]圖1(SEQIDNO1)列出了麴黴屬derA基因的2400bp基因組DNA序列，圖2(SEQIDNO2)列出了由圖1的derA基因組DNA翻譯的246個胺基酸的序列。[137]為了構建缺失質粒，設計了兩對PCR引物。第一對PCR引物擴增基因的啟動子區域，它們作為SEQIDNO33(P1a)和SEQIDNO34(P2a)被表示在表1中。第二對PCR引物擴增基因的終止子區域，它們作為SEQIDNO35(T1a)和SEQIDNO36(T2a)被表示在表1中。在PCR中使用下列條件擴增終止子片段DNA序列(T1)在94℃加熱PCR管3分鐘以使模板DNA變性。然後運行PCR反應在94℃下1分鐘，57℃下1分鐘和72℃下1分30秒，重複30遍該循環。最後，在該管於4℃下溫育之前，將PCR反應在72℃延伸10分鐘。然後，用T4DNA聚合酶填充T1片段的末端，然後，用限制性酶(BamH1)切割。然後，將該修飾的PCR片段克隆到pMW1(UlrichKucketal.，[1989]Appl.Micorbiol.Biotechnol.31358-365)，從而構建質粒pMW1-T1(derA)。[138]用兩種引物(SEQIDNO3和SEQIDNO4)，使用與T1片段相同的條件，在PCR反應中擴增啟動子DNA序列(P1片段)。然後，用T4DNA聚合酶填充P1片段的末端，用限制性酶Sall切割。然後，將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-T1(derA)，從而產生pMW1-ΔderA。通過限制性酶消化來分析該質粒，以確定其身份。通過兩種限制性酶消化(HapI和NruI)使質粒線性化。[139]使用消化的DNA片段去轉化AP-4黑麴黴菌株的衍生株(Wardetal.[1993]Appli.Microbiol.Biotechnol39738-743)，其包括在葡糖澱粉酶啟動子和終止子控制下表達Trameteversicolor漆酶的表達質粒。[140]圖33A闡明了用來製備如本文詳細描述的和提供的實施例中使用的缺失質粒的一般策略。[141]被使用的轉化方案是對Campbell方法(Campbelletat.1989.Curr.Genet.1653-56)的修改，其中β-D-甜素酶(glucinase)G(InterSpexProducts，Inc.SanMateo，CA)被用來產生原生質體，並且將pH調節到5.5。所有的溶液和培養基高壓滅菌或通過0.2微米濾器過濾滅菌。使用苯酚/氯仿方法(Zhuetal.1993.NucleicAcidRes.215279-80)從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37(Phph)和SEQIDNO38(Pt-outa)的PCR來檢測缺失菌株，當來自缺失菌株的DNA被用作PCR擴增的模板時，其產生了1064bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到(圖34)。b.derB基因的缺失[142]圖3(SEQIDNO3)列出了麴黴屬derB基因的2673bp基因組DNA序列，圖4(SEQIDNO4)列出了由圖3的derB基因組DNA翻譯的166個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建缺失質粒，其中具有下列的差異。[143]被用來擴增啟動子區域的第一對PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO39(P1b)和SEQIDNO40(P2b)。被用來擴增終止子區域的第二對引物，在表1中被指定為SEQIDNO41(T1b)和SEQIDNO42(T2b)。在該實施例中，用T4DNA聚合酶填充T2片段的末端，然後，用限制性酶(BamH1)切割。然後，將修飾的PCR片段克隆到pMW1中，構建質粒pMW1-T2(derB)。使用與P1片段相同的條件，在PCR反應中擴增P2片段。然後，用T4DNA聚合酶填充P2片段的末端，用限制性酶SalI切割。[144]將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-T2(derB)，產生pMW1-ΔderB。按照在上面實施例1a中所描述的，通過限制性酶分析該質粒。通過兩種限制性酶消化(HapI和EcoRV)，使質粒線性化。[145]如在上面實施例1A中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO43(Pt-outb)的PCR，檢測缺失菌株，當來自缺失菌株的DNA用作PCR擴增的模板時，其產生了694bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。然而，野生型條帶也從所述缺失菌株中被鑑定出來。c.htmA基因的缺失[146]圖5(SEQIDNO5)列出了麴黴屬htmA基因的7000bp基因組DNA序列，圖6(SEQIDNO4)列出了由圖5的htmA基因組DNA翻譯的1076個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建缺失質粒，其中具有下列的差異。[147]被用來擴增啟動子區域的第一對PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO44(P1c)和SEQIDNO45(P2c)。被用來擴增終止子區域的第二對引物，在表1中被指定為SEQIDNO46(T1c)和SEQIDNO47(T2c)。在該實施例中，使用與P1和T1片段相同的條件在PCR反應中擴增P3和T3片段。用T4DNA聚合酶填充T3片段的末端，然後用限制性酶(BamHI)切割。然後，將修飾的PCR片段克隆到pMW1中，構建質粒pMW1-T3(htmA)。用T4DNA聚合酶填充P3片段的末端，用限制性酶XhoI切割。將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-T3(htmA)中，產生pMW1-ΔhtmA。按照在上面實施例1a中所描述的，通過限制性酶分析該質粒。通過兩種限制性酶消化(HapI和EcoRV)，使質粒線性化。[148]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴GAP3-4(Wardetal.[1993]Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743)，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO48(Pt-outc)的PCR檢測缺失菌株，當來自缺失菌株的DNA用作為PCR擴增的模板時，其產生了1497bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。d.mnn9基因的缺失[149]圖7(SEQIDNO7)列出了麴黴屬mnn9基因的4947bp基因組DNA序列，圖8(SEQIDNO8)列出了由圖7的mnn9基因組DNA翻譯的369個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建缺失質粒，其中具有下列的差異。[150]被用來擴增啟動子區域的第一對PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO49(P1d)和SEQIDNO50(P2d)。被用來擴增終止子區域的第二對引物，在表1中被指定為SEQIDNO51(T1d)和SEQIDNO52(T2d)。[151]在該實施例中，用T4DNA聚合酶填充P4片段的末端，然後，用限制性酶(SalI)切割。然後，將修飾的PCR片段克隆到pMW1中，構建質粒pMW1-P4(mnn9)。用T4DNA聚合酶填充T4片段的末端，然後，用限制性酶(BamHI)切割。然後，將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-P(mnn9)，產生質粒pMW1-Δmnn9。按照在上面實施例1a中所描述的，通過限制性酶分析該質粒。通過兩種限制性酶(HapI和NruI)使質粒線性化。[152]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO53(Pt-outd)的PCR來檢測缺失菌株，當來自缺失菌株的DNA用作PCR擴增的模板時，其產生了1330bp的特異的PCR產物(圖34A，第7泳道)。當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到(圖34A，第3泳道)。e.mnn10基因的缺失[153]圖9(SEQIDNO9)列出了麴黴屬mnn10基因的4524bp基因組DNA序列，圖10(SEQIDNO10)列出了由圖9的mnn10基因組DNA翻譯的466個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建缺失質粒，其中具有下列的差異。[154]被用來擴增啟動子區域的第一對PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO54(P1e)和SEQIDNO55(P2e)。被用來擴增終止子區域的第二對引物，在表1中被指定為SEQIDNO56(T1e)和SEQIDNO57(T2e)。[155]在該實施例中，用T4DNA聚合酶填充P5片段的末端，然後，用限制性酶(SphI)切割。然後，將修飾的PCR片段克隆到pMW1，構建質粒pMW1-P5(mnn10)。用T4DNA聚合酶填充T5片段的末端，然後，用限制性酶(BamHI)切割。將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-P5(mnn10)中，產生pMW1-Δmnn10。按照在上面實施例1a中所描述的，通過限制性酶分析該質粒。通過兩種限制性酶(NruI和EcoRV)使質粒線性化。[156]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO53(Pt-oute)的PCR來檢測缺失菌株，當來自缺失菌株的DNA用作PCR擴增的模板時，其產生了1295bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。f.ochA基因的破壞[157]圖11(SEQIDNO11)列出了麴黴屬ochA基因的6724bp基因組DNA序列，圖12(SEQIDNO12)列出了由圖11的ochA基因組DNA翻譯的380個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建破壞質粒(disruptionplasmids)，其中具有下列的差異。[158]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO59(Pf)，被用來擴增終止子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO60(Tf)。使用這些引物，擴增包括80bp啟動子區和624bp終止子區的ochA基因編碼區。在PCR反應中，使用下列條件擴增命名為W6片段的DNA序列在94℃加熱PCR管4分鐘以使模板DNA變性，然後運行PCR反應在94℃下1分鐘，55℃下2分鐘和72℃下1分30秒，並且重複30遍該循環。在該管於4℃溫育之前，所述PCR反應在72℃延伸10分鐘。將產生的1787bpPCR片段W6克隆到pBS-T，一種衍生自pBlue-script的TA載體(TianWeiBiotech.Co.Ltd)，以構建質粒pBS-W6(ochA)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到ochA基因的編碼區的EcoRV位點，以產生pBS-破壞ochA。通過限制性酶(HapI)消化使質粒線性化。[159]圖33B闡明了用來製造如本文詳細描述的和提供的實施例中使用的破壞質粒的一般策略。[160]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO61(Pt-outf)的PCR檢測缺失菌株，當來自破壞菌株的DNA用作PCR擴增的模板時，產生了1336bp的特異性的PCR產物(圖34B，第7泳道)，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到(圖34B，第3泳道)。g.dpp4基因的破壞[161]圖13(SEQIDNO13)列出了麴黴屬ddp4基因的3989bp基因組DNA序列，圖14(SEQIDNO14)列出了由圖13的ddp4基因組DNA翻譯的915個胺基酸的序列。如上面實施例1f所描述地構建破壞質粒，其中具有下列的差異。[162]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO62(Pg)，被用來擴增終止子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO63(Tg)。使用這些引物，擴增ddp4基因的編碼區(817-3663)的950-3356bp區域。[163]將產生的2407bpPCR片段W7克隆到pBS-T中，以構建質粒pBS-W7(ddp4)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到dpp4基因的編碼區的EcoRI-EcoRI(2175-2257bp)位點，以產生pBS-破壞dpp4。通過限制性酶消化(NruI)使質粒線性化。[164]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO64(Pt-outg)的PCR檢測缺失菌株，當來自破壞菌株的DNA用作PCR擴增的模板時，其產生了1191bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。h.dpp5基因的破壞[165]圖15(SEQIDNO15)列出了麴黴屬ddp5基因的2647bp基因組DNA序列，圖16(SEQIDNO16)列出了由圖15的ddp5基因組DNA翻譯的726個胺基酸的序列。如上面實施例1f所描述地構建破壞質粒，其中具有下列的差異。[166]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO65(Ph)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO66(Th)。[167]使用這些引物，擴增ddp5基因的編碼區(1-2647bp)的195-2490bp區域。將產生的2295bpPCR片段W8克隆到pBS-T中，來構建質粒pBS-W8(ddp5)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到dpp5基因的編碼區的Bglll位點以產生pBS-破壞dpp5。通過限制性酶(EcoRV)消化使質粒線性化。[164]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO67(Pt-outh)的PCR檢測缺失菌株，當來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1282bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。i.pApAa基因的破壞[169]圖17(SEQIDNO17)列出了麴黴屬pepAa基因的2777bp基因組DNA序列，圖18(SEQIDNO18)列出了由圖17的pepAa基因組DNA翻譯的394個胺基酸的序列。[170]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO68(Pi)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO69(Ti)。[171]使用這些引物，擴增pepAa基因的編碼區、一些啟動子區域(355bp)和一些終止子區域(326bp)。被命名為W9片段的該DNA序列在PCR反應中被擴增，如上面實施例1f所描述的，但具有下列的差異。[172]將產生的1920bpPCR片段W9克隆到pBS-T，以構建質粒pBS-W9(pepAa)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到pepAa基因的編碼區的BstB1位點，以產生pBS-破壞pepAa。通過限制性酶(HpaI)消化使質粒線性化。[173]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO70(Pt-outi)的PCR檢測缺失菌株，當使用來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1140bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。j.pepAb基因的破壞[174]圖19(SEQIDNO19)列出了麴黴屬pepAb基因的3854bp基因組DNA序列，圖20(SEQIDNO20)列出了由圖19的pepAb基因組DNA翻譯的417個胺基酸的序列。[175]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO71(Pj)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO72(Tj)。[176]使用這些引物，擴增pepAb基因的編碼區和一些啟動子區域(1025bp)。被命名為W10片段的該DNA序列在PCR反應中被擴增，如上面實施例1f所描述的，但具有下列的差異。[177]將產生的2170bpPCR片段W10克隆到pBS-T中，來構建質粒pBS-W10(pepAb)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到pepAb基因的編碼區的Eco47III位點以產生pBS-破壞pepAb。通過限制性酶(HpaI)消化使質粒線性化。[178]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO73(Pt-outj)的PCR檢測缺失菌株，當使用來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1191bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。k.pepAd基因的破壞[179]圖21(SEQIDNO21)列出了麴黴屬pepAd基因的2411bp基因組DNA序列，圖22(SEQIDNO22)列出了由圖21的pepAd基因組DNA翻譯的480個胺基酸的序列。[180]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO74(Pk)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO75(Tk)。[181]使用這些引物，擴增1443bppepAd基因的1201bp的編碼區和一些啟動子區域(858bp)。被命名為W11片段的該DNA序列在PCR反應中被擴增，如上面實施例1f所描述的，但具有下列的差異。[182]將產生的2059bp(23-2081bp)PCR片段W11克隆到pBS-T中，來構建質粒pBS-W11(pepAd)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到pepAd基因的編碼區的AauI位點以產生pBS-破壞pepAd。通過限制性酶(HpaI)消化使質粒線性化。[183]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO76(Pt-outh)的PCR檢測缺失菌株，當使用來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1086bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。l.pepF基因的破壞[184]圖23(SEQIDNO23)列出了麴黴屬pepF基因的3525bp基因組DNA序列，圖24(SEQIDNO24)列出了由圖23的pepF基因組DNA翻譯的531個胺基酸的序列。如上面實施例1f所描述地構建破壞質粒，其中具有下列的差異。[185]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO77(Pl)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO78(Tl)。[186]使用這些引物，擴增pepF基因的編碼區和一些啟動子區域(1058bp)。被命名為W12片段的該DNA序列在PCR反應中被擴增，如上面實施例1f所描述。[187]將產生的2350bpPCR片段W12克隆到pBS-T中，來構建質粒pBS-W12(pepF)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到pepF基因的編碼區的NruI位點以產生pBS-破壞pepF。通過限制性酶(HpaI)消化使質粒線性化。[188]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO79(Pt-outl)的PCR檢測缺失菌株，當使用來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1231bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。m.pepB基因的缺失[189]圖25(SEQIDNO25)列出了麴黴屬pepB基因的3000bp基因組DNA序列，圖26(SEQIDNO26)列出了由圖25的pepB基因組DNA翻譯的282個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建缺失質粒，其中具有下列的差異。[190]被用來擴增啟動子區域的第一對PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO80(P1m)和SEQIDNO81(P2m)。被用來擴增終止子區域的第二對引物，在表1中被指定為SEQIDNO82(T1m)和SEQIDNO83(T2m)。[191]在該實施例中，用T4DNA聚合酶填充P13片段的末端，然後，用限制性酶(SalI)切割。然後，將修飾的PCR片段克隆到pMW1以構建質粒pMW1-P13(pepB)。用T4DNA聚合酶填充T13片段的末端。然後，將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-P13(pepB)，產生質粒pMW1-ΔpepB。按照在上面實施例1a中所描述的，通過限制性酶分析該質粒。通過限制性酶(HpaI)消化使質粒線性化。[192]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO84(Pt-outm)的PCR檢測缺失菌株，當使用來自缺失菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1357bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。n.pepC基因的缺失[193]圖27(SEQIDNO27)列出了麴黴屬pepC基因的3220bp基因組DNA序列，圖28(SEQIDNO28)列出了由圖27的pepC基因組DNA翻譯的533個胺基酸的序列。如上面實施例1a所描述地構建缺失質粒，其中具有下列的差異。[194]被用來擴增啟動子區域的第一對PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO85(P1n)和SEQIDNO86(P2n)。被用來擴增終止子區域的第二對引物，在表1中被指定為SEQIDNO87(T1n)和SEQIDNO88(T2n)。[195]在該實施例中，用T4DNA聚合酶填充T14片段的末端，然後用限制性酶(BamHI)切割。然後，將修飾的PCR片段克隆到pMW1中，構建質粒pMW1-T14(pepC)。用T4DNA聚合酶填充P14片段的末端，然後用限制性酶(SalI)切割。然後，將該修飾的PCR片段克隆到pMW1-P14(pepC)，產生pMW1-ΔpepC。按照在上面實施例1a中所描述的，通過限制性酶分析該質粒。通過兩種限制性酶(HpaI和EcoRV)消化使質粒線性化。[196]如在上面實施例1a中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴菌株GAP3-4(Wardetal.[1993]Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743)，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO89(Pt-outn)的PCR檢測缺失菌株，當使用來自缺失菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1054bp的特異的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。o.pepD基因的破壞[197]圖29(SEQIDNO29)列出了麴黴屬pepD基因的2993bp基因組DNA序列，圖30(SEQIDNO30)列出了由圖29的pepD基因組DNA翻譯的416個胺基酸的序列。如上面實施例1f所描述地構建破壞質粒，其中具有下列的差異。[198]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO90(Po)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO91(To)。[199]使用這些引物，擴增pepD基因的編碼區、一些啟動子區域(392bp)和終止子區域(521bp)。在PCR反應中，如上面實施例1f所描述地，擴增被命名為W15片段的該DNA序列。將產生的2317bpPCR片段W15克隆到pBS-T中，構建質粒pBS-W15(pepD)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到pepD基因的編碼區的BstBI位點以產生pBS-破壞pepD。通過限制性酶消化(StuI)使質粒線性化。[200]如在上面實施例1f中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO92(Pt-outo)的PCR檢測破壞菌株，當使用來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1334bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。p.pepAc基因的破壞[201]圖31(SEQIDNO31)列出了麴黴屬pepAc基因的4531bp基因組DNA序列，圖32(SEQIDNO32)列出了由圖31的pepAc基因組DNA翻譯的453個胺基酸的序列。如上面實施例1f所描述地構建破壞質粒，其中具有下列的差異。[202]被用來擴增啟動子區域的PCR引物，在表1中被指定為SEQIDNO93(Pp)，被用來擴增終止子區域的引物，在表1中被指定為SEQIDNO94(Tp)。[203]使用這些引物，擴增pepAc基因的編碼區、一些啟動子區域(789bp)和一些終止子區域(509bp)。在PCR反應中，擴增被命名為W16片段的DNA序列。[204]將產生的2753bpPCR片段W16克隆到pBS-T中，構建質粒pBS-W16(pepAc)。將包含潮黴素抗性基因的DNA片段插入到pepAc基因的編碼區的EcoRV位點以產生pBS-破壞pepAc。通過限制性酶(HpaI)消化使質粒線性化。[205]如在上面實施例1f中描述的，使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴，並從轉化體中提取DNA。通過使用兩種引物SEQIDNO37和SEQIDNO95(Pt-outp)的PCR檢測破壞菌株，當使用來自破壞菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1520bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自親代菌株時，沒有條帶被觀察到。實施例2失活的雙缺失突變體a.dpp4和d5的破壞[206]為了構建dpp4(amdS)缺失質粒，將包含amdS基因的2.7kbDNA片段插入到質粒pBS-W7(dpp4)的ddp4基因編碼區(位置950到3356)的EcoRV-EcoRV位點(位置2175到2256)，產生質粒pBS-破壞ddp4(amdS)。通過限制性酶消化對質粒進行分析以確認該質粒的身份。通過限制性酶消化(NruI)使質粒線性化。使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴菌株(Δdpp5-19)，該菌株在葡糖澱粉酶啟動子和終止子的控制下表達Tramete漆酶並攜帶破壞的dpp5基因(如在實施例1h中所描述的)。通過PCR使用兩對引物來檢測雙缺失菌株。第一對的兩個引物每一個分別與染色體DNA上的amdS基因和W7片段3』下遊退火，當來自dpp4缺失菌株的DNA作為模板進行PCR擴增時，其產生了1224bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自受體菌株時，沒有條帶被觀察到。引物Pout(dpp4)5』┄TCTGGATAGAAATGCAAATCGTAG┄3』SEQIDNO64PamdS5』┄TTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGC┄3』SEQIDNO96第二對引物與最初用於檢測單dpp5缺失菌株的引物相同(SEQIDNOs37和67)。雙缺失菌株和其對照菌株被用於漆酶生產和全蛋白質生產。b.mnn9和ochA的破壞[207]為了構建mnn9(amdS)缺失質粒，將包含amdS基因的2.7kbDNA片段插入到pMW1-Δmnn9(amdS片段直接取代hph片段)，產生質粒pMW1-破壞mnn9(amdS)。通過限制性酶消化對質粒進行分析以確認該質粒的身份。通過限制性酶消化(AsuII-NruI)使質粒線性化。使用消化的DNA片段去轉化黑麴黴菌株(ΔochA-23)，該菌株在葡糖澱粉酶啟動子和終止子的控制下表達Tramete漆酶並攜帶破壞的ochA基因，如在實施例1f中所描述。通過PCR使用兩對引物檢測雙缺失菌株。第一對的兩個引物每一個分別與染色體DNA上的amdS基因和3』下遊T4片段退火，當來自mnn9缺失菌株的DNA用作模板進行PCR擴增時，其產生了1380bp的特異性的PCR產物，而當DNA來自受體菌株(recipientstrain)時，沒有條帶被觀察到。引物Pout(mnn9)5』┄GATATCAACCTCAGCGTCAAATTGG┄3』SEQIDNO53PamdS5』┄TTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGC┄3』SEQIDNO97第二對引物與最初用於檢測單ochA缺失菌株的引物相同(SEQIDNOs37和61)。然後，雙缺失菌株和其對照菌株被用於漆酶生產和全蛋白質生產。實施例3失活突變體用於生產異源蛋白質[208]為了闡明使用根據本發明的失活突變體的優勢，將親代(野生型)中的漆酶生產量與在上述實施例1和2中描述的失活突變體中的漆酶生產量進行了比較。[209]使用250ml擋板瓶，以搖瓶培養物進行分析，所述擋板瓶中包含50ml本領域已知的適合漆酶產生的生長培養基(Promosoy)。菌株在搖瓶中生長120小時。按照標準的分析方法，測量漆酶活性，所述分析方法是基於在醋酸鈉緩衝液(pH4.6)中氧對ABTS、2，2』-azino-二(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸酯)的氧化。用含有ABTS的醋酸鈉緩衝液(SIGMA)在37℃溫育培養物肉湯30分鐘，並在OD420nm光密度下測量產生的顏色。相對於相應的親代菌株，測量失活菌株產生的漆酶水平。結果在表2A和2B中示出。使用描述於Lowry，etal.，[1951]J.Biol.Chem.193265-275中的Folin苯酚方法測量細胞外總蛋白，結果在表2A中示出。表2A-單失活表2B-多種失活權利要求1.一種重組絲狀真菌細胞，其包括選自derA(SEQIDNO1)、derB(SEQIDNO3)、htmA(SEQIDNO5)、mnn9(SEQIDNO7)、mnnl0(SEQIDNO9)、ochA(SEQIDNO11)、dpp4(SEQIDNO13)、dpp5(SEQIDNO15)、pepAa(SEQIDNO17)、pepAb(SEQIDNO19)、pepAc(SEQIDNO31)、pepAd(SEQIDNO21)、pepF(SEQIDNO23)、其功能性同源序列和它們的組合的一種或多種失活染色體基因。2.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其包括兩種失活染色體基因。3.權利要求2所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述兩種失活染色體基因是a)dpp4(SEQIDNO13)和dpp5(SEQIDNO15)；b)mnn9(SEQIDNO7)和ochA(SEQIDNO11)；或c)與其具有至少95％序列同一性的同源序列。4.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述失活染色體基因是dpp5(SEQIDNO15)和其同源序列。5.權利要求4所述的重組絲狀真菌細胞，其進一步包括第二種失活染色體基因。6.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述一種或多種失活染色體基因選自derA(SEQIDNO1)、derB(SEQIDNO3)、htmA(SEQIDNO5)、mnn9(SEQIDNO7)、mnnl0(SEQIDNO9)、ochA(SEQIDNO11)、dpp4(SEQIDNO13)、dpp5(SEQIDNO15)和與其具有至少95％序列同一性的功能性同源序列。7.權利要求6所述的重組絲狀真菌細胞，其進一步包括選自pepAa(SEQIDNO17)、pepAb(SEQIDNO19)、pepAc(SEQIDNO31)、pepAd(SEQIDNO21)、pepF(SEQIDNO23)和與其具有至少95％序列同一性的功能性同源序列的失活染色體基因。8.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述的絲狀真菌細胞是麴黴屬細胞。9.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其進一步包括失活pepA。10.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述失活基因已被剔除。11.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述失活基因已被破壞。12.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其進一步包括選自pepB(SEQIDNO25)、pepC(SEQIDNO27)、pepD(SEQIDNO29)、其同源序列和其組合的失活基因。13.權利要求1所述的重組絲狀真菌細胞，其進一步包括編碼目標蛋白的被引入的核酸。14.權利要求13所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述目標蛋白是酶。15.權利要求13所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述目標蛋白是蛋白酶抑制劑。16.權利要求13所述的重組絲狀真菌細胞，其中所述目標蛋白是抗體或其片段。17.一種用於在絲狀真菌細胞中產生目標蛋白的方法，其包括a)獲得根據權利要求1的重組絲狀真菌細胞，b)將編碼目標蛋白的核酸序列引入所述的重組真菌細胞，和c)在適合於表達和產生所述的目標蛋白的培養條件下培養所述重組真菌細胞。18.根據權利要求17所述的方法，其進一步包括回收所述目標蛋白。19.根據權利要求18所述的方法，其中與所述目標蛋白在相應的親代細胞中的表達比較，所述的目標蛋白的表達被增強。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述絲狀真菌細胞是麴黴屬細胞。21.一種用於從麴黴屬菌株中獲得目標蛋白的方法，其包括a)獲得根據權利要求8的重組麴黴屬細胞；b)使用編碼目標蛋白的核酸序列轉化所述重組麴黴屬細胞；c)在適合的生長條件下使所述轉化的麴黴屬細胞生長，以允許所述目標蛋白表達；和d)回收所述的蛋白。22.根據權利要求21所述的方法，其中所述蛋白質是蛋白酶抑制劑。23.根據權利要求21所述的方法，其中所述蛋白質是抗體或其片段。24.根據權利要求21所述的方法，其中所述蛋白質是酶。25.根據權利要求21所述的方法，其中所述麴黴屬是黑麴黴。26.分離的核酸，其編碼具有選自下列的胺基酸序列的蛋白SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12和與其具有至少95％序列同一性的功能性同源序列。27.權利要求26所述的分離的核酸序列，其中所述核酸序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO3、SEQIDNO5、SEQIDNO7、SEQIDNO9和SEQIDNO11。全文摘要提供了具有一個或多個失活染色體基因的重組絲狀真菌細胞(例如麴黴屬)。在一些實施方式中，所述染色體基因相應於derA、derB、htmA、mnn9、mnn10、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、pepAd、pepF和其組合。所述重組絲狀真菌細胞可進一步包括相應於pepA、pepB、pepC和pepD的失活染色體基因。所述重組絲狀真菌細胞可包括編碼目標蛋白的異源核酸。本發明也提供了在所述的重組絲狀真菌細胞中產生目標蛋白的方法。文檔編號C12N1/15GK101146907SQ200680009221公開日2008年3月19日申請日期2006年4月11日優先權日2005年4月12日發明者王華明申請人:金克克國際有限公司