用於因子xa抑制劑的解毒劑和其使用方法

2023-04-29 16:03:26

用於因子xa抑制劑的解毒劑和其使用方法
【專利摘要】本發明涉及靶向因子Xa的抗凝血劑的解毒劑。所述解毒劑是因子Xa蛋白質衍生物，所述因子Xa蛋白質衍生物結合至因子Xa抑制劑，由此實質上中和所述因子Xa抑制劑而不會組裝成凝血酶原酶複合物。本文所述衍生物缺少固有凝血活性或具有降低的固有凝血活性。本文揭示了停止或阻止目前正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的患者出血的方法。
【專利說明】用於因子XA抑制劑的解毒劑和其使用方法
[0001] 本申請為2010年3月19日進入中國國家階段、申請號為200880107973.8、申請日為2008年9月26日、發明名稱為「用於因子XA抑制劑的解毒劑和其使用方法」的發明專利申請的分案申請。
_2] 相關_請案交叉參考
[0003]本申請案根據35U.S.C.§ 119(e)主張2007年9月28日提出申請的美國臨時申請案第60/976，343號和2008年8月20日提出申請的美國臨時申請案第61/090，574號的權利，這兩個臨時申請案均以整體引用的方式併入本文中。
【技術領域】
[0004]本發明涉及因子Xa(fXa)衍生物的用途，所述因子Xa (fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或沒有固有促凝血活性，但能夠結合和/或中和fXa抑制劑，由此作為靶向fXa的抗凝血劑的解毒剤。
【背景技術】
[0005]市場上在治療或預防在不活動時或正接受醫療手術時易於形成血凝塊的患者(例如，那些患有凝血病症的患者)的不期望血栓形成時需要抗凝血劑。然而，抗凝血療法的一個重要限制是與治療有關的出血風險，且在服用過量或如果需要緊急手術的情況下限制了迅速逆轉抗凝血活性的能力。因此，業內極為期望針對所有形式的抗凝血療法的特定且有效解毒剤。出於安全考慮，同樣有利的是在研發新的抗凝血劑藥物中獲得抗凝血劑-解毒劑對。
[0006]目前對於過度抗凝血可用的抗凝血劑-解毒劑對是肝素-魚精蛋白和華法林(warfarin)-維生素K。新鮮的冷凍血眾和重組因子Vila(rfVIIa)也已用作在低分子量肝素治療中正經受嚴重創傷或嚴重失血的患者的非特異性解毒剤。(勞裡岑(Lauritzen』B.)等人，血液(Blood) ,2005，607A-608A。)還報導了魚精蛋白片段(美國專利第6，624，141號)和小的合成肽(美國專利第6，200，955號)作為肝素或低分子量肝素解毒劑；和凝血酶突變蛋白質(美國專利第6，060, 300號)作為凝血酶抑制劑的解毒剤。已報導將凝血酶原中間產物和衍生物作為水蛭素和合成凝血酶抑制劑的解毒劑(美國專利第5，817，309號和第6，086，871 號)。
[0007]抗凝血療法的一種有希望的形式靶向因子Xa(fXa)，且實際上，目前在臨床研發的不同階段中有多種直接fXa抑制劑用於抗凝血療法中。這些中的大多數是小分子。儘管這些新的fXa抑制劑展示有希望用於治療，但仍需要特定且有效的解毒剤。在過度抗凝血或利用這些fXa抑制劑治療的患者需要手術的情況下，可能需要一種試劑來實質上中和所投與的ー種或多種fXa抑制劑並恢復正常止血。
[0008]目前可用試劑(例如重組因子`Vlla(rfVIIa))是以機械方式進行限制且並非特定用於fXa抑制劑的逆轉且因此臨床醫生極為期望經改良的方案。在人類研究中，已經使用rfVIIa來逆轉間接抗凝血酶III依賴性fXa抑制劑(例如磺達肝素(fondaparinux)和伊達肝素(idraparinux))的作用(比斯特沃特(Bi jsterveld, NR)等人,循環(Circulation)
,2002, 106:2550-2554 ;比斯特沃特(Bi jsterveld, NR)等人，英國血液病學雜誌(BritishJ.0f Haematology), 2004(124):653-658 )。因子 Vlla(fVIIa)的作用機制是與組織因子一起作用將血液循環中存在的因子X(fX)轉化成fXa來恢復患者的正常止血。必須說明的是，這種作用模式可能達到以中和活性位點定向fXa抑制劑的fXa的最高可能濃度受fX的循環血漿濃度限制。因此，使用rfVIIa來逆轉直接fXa抑制劑的作用的潛力機械上受限。由於fX的循環血漿濃度為150毫微摩爾(「nM」)，所以通過這種模式所產生的fXa的最大量將為150nM。因此，使用rfVIIa來逆轉直接fXa抑制劑的作用的潛力機械上受限。小分子fXa抑制劑(例如利伐沙班(rivaroxaban))的報告治療濃度(大約600nM,庫比察(KubitzaD)等人，歐洲臨床藥理學雜誌(Eur.J.Clin.Pharmacol), 2005, 61:873-880)高於由 rfVIIa所生成的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa來逆轉由fXa抑制劑所產生的治療或超治療水平的抗凝作用將提供不充分的效能水平。如圖4中所示，在中和因子Xa抑制劑貝特沙班(betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所闡述)。重組fVIIa展示50nM至100nM的劑量反應解毒活性，但所述作用在100nM至200nM之間趨於穩定，此表明其解毒作用受除其濃度以外的因素的限制。在所有所測試的rfVIIa濃度中，貝特沙班在250nM的濃度下仍展示fXa的劑量反應抑制(高達約75%抑制)。此觀察結果與fVIIa的建議作用機制一致。此結果還被展示rfVIIa不能完全逆轉磺達肝素對凝血酶生成和凝血酶原活化的參數的抑制作用的研究所支持。(吉偌提法斯(Geix)tiafaS，GT)等人，血栓形成和止血(Thrombosis&Haemostasis) 2204 (91): 531-537)。
[0009]外源活性fXa不能以類似於rfVIIa的方式直接投與個體。不像rfVIIa在缺少其輔因子組織因子的情況下具有極低促凝血活性那樣，天然fXa是強效酶且具有造成血栓形成的潛在風險。因此，使用rfVIIa或活性fXa作為fXa抗凝血療法的解毒劑具有許多缺點。
[0010]因此，需要經改良的解毒剤，其不會造成不期望的血栓形成且在fXa抑制劑服用過量的情況下或在需要恢復正常止血以阻止或停止出血的情況下有效地實質上中和fXa抑制劑的抗凝血活性。
[0011]本文所提及的任何及所有出版物、專利和專利申請案均以整體引用的方式併入本文中。

【發明內容】

[0012]現在已發現，投與fXa蛋白質的經修飾衍生物可用作靶向fXa的抗凝血劑的解毒劑。所述fXa蛋白質的經修飾衍生物並不與fXa競爭組裝成凝血酶原酶複合物，而是結合和/或實質上中和抗凝血劑(例如fXa抑制剤)。可用作解毒劑的衍生物經修飾以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同時保留結合至抑制劑的能力。預計本發明的衍生物可包括修飾活性位點、或改變Gla結構域或自fXa去除整個Gla結構域、或其各種組合。由於已知活性位點經修飾的全長fXa是抗凝血劑，因此進ー步預計修飾Gla結構域將降低或消除fXa衍生物對正常止血的抗凝血作用。
[0013]進一步預計，修飾fXa的EGF結構域(通過EGF1、EGF2、或EGF1和EGF2兩個結構域的缺失或取代)提供用於本發明方法的衍生物。EGF結構域修飾可單獨實施或連同Gla結構域修飾一起實施。[0014]在一個實施例中，衍生物保留結合靶向fXa的抗凝血劑(或fXa抑制劑)所需的結構特性。通過衍生物直接或間接結合抑制劑，抑制劑實質上被中和。
[0015]在ー個方面中，本發明提供阻止或降低正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法，其包含向所述個體投與有效量的因子Xa蛋白質衍生物，所述衍生物結合至因子Xa抑制劑但不會組裝成凝血酶原酶複合物。在一個實施例中，衍生物具有一個或ー個以上的以下性質:降低的促凝血活性或沒有促凝血活性；經修飾或去除的Gla結構域；和經修飾的活性位點。本發明的衍生物選擇性地結合併抑制以外源方式投與的因子Xa抑制劑，由此實質上中和fXa抑制劑的抗凝血活性。此方法涵蓋活體外和活體內方法二者。本發明所涵蓋的對因子Xa蛋白質的各種修飾可在整個【具體實施方式】中找到。
[0016]應了解，本發明所涵蓋的衍生物不是血漿源性因子Vila、重組因子Vila、新鮮冷凍血漿、凝血酶原複合物濃縮物、或全血。
[0017]本發明的ー個方面是使用因子Xa衍生物和含有其的組合物來治療已接受或正利用因子Xa抑制劑接受過度抗凝血療法的患者或之前已投與因子Xa抑制劑且然後需要止血的患者(例如非急需或急診手術可能需要)。在ー個方面中，經修飾fXa蛋白質不同於天然存在的fXa，這是因為其具有降低的固有促凝血活性或消除固有促凝血活性且將不會妨礙在止血方面的生理fXa功能，同時仍能夠結合併實質上中和fXa抑制劑。
[0018]在另一方面中，經修飾的因子Xa蛋白質是與能夠延長所述因子Xa衍生物的血漿半壽期(或循環半壽期)的試劑共同投與。在又一方面中，解毒劑與ー個部分偶聯以延長其血漿半壽期。
[0019]還提供含有因子Xa衍生物的醫藥組合物，所述因子Xa衍生物結合(和/或實質上中和)因子Xa抑制劑，但不會組裝成凝血酶原酶複合物。所述醫藥組合物任選地包含醫藥上可接受的載劑。
[0020]在另一方面中，本發明提供試劑盒，其包含用於抗凝血用途的fXa抑制劑和當需要實質上中和fXa抑制劑的抗凝血活性時使用的fXa抑制劑解毒劑(或因子Xa衍生物)。
[0021]本發明的ー個實施例涉及分離的多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.12或與SEQID N0.12具有至少80%同源性的多肽。另ー實施例涉及分離的雙鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.13或與SEQ ID N0.13具有至少80%同源性的多肽。再ー實施例涉及分離的多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.15或與SEQ ID N0.15具有至少80%同源性的多肽。
[0022]還提供包含載劑和剛剛所闡述多肽的醫藥組合物。
[0023]還提供編碼剛剛所闡述多肽的多核苷酸。
[0024]本發明進一歩提供肽偶聯物，其包含以共價或非共價方式連接至剛剛所闡述多肽的載劑。載劑可為脂質體、膠束、醫藥上可接受的聚合物、或醫藥上可接受的載劑。
[0025]本發明還涉及結合剛剛所闡述多肽的抗體。所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。還提供抗體的生物活性片段。所述抗體可以可檢測方式標記。所述抗體(或抗體片段)還作為組合物的一部分提供，所述組合物進ー步包含載劑。
[0026]在一個實施例中提供抗體-肽複合物，其包含本發明的抗體和特異性結合至所述抗體的多肽。所述多肽是受到對抗可產生所述抗體的多肽。所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0027]在另ー實施例中提供製備本發明多肽的方法，其包含在原核或真核宿主細胞中表達編碼所述多肽的多核苷酸。在一個實施例中，所述宿主細胞是真核細胞且尤其是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell)。在一個實施例中，重鏈(SEQ ID N0.15)表達於原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))中。在另ー實施例中，多肽經分離。
[0028]在再一實施例中提供分離的原核或真核宿主細胞，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸。在一個實施例中，所述宿主細胞在組合物中，所述組合物進ー步包含載劑。
[0029]在又一實施例中提供阻止或降低正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法，其包含向所述個體投與有效量的組合物，所述組合物包含本發明的多肽和載劑。進ー步提供選擇性結合併抑制正進行抗凝血療法的個體中以外源方式投與的因子Xa抑制劑，其包含向所述個體投與有效量的剛剛所闡述的組合物。
[0030]在ー種阻止或減少正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法中，其中所述衍生物包括催化結構域，所述催化結構域任選地以化學方式或重組方式經修飾以失去蛋白水解活性但保持結合所需的結構特性，所述結構域源自以下中的任一者:a.哺乳動物蛋白酶，其選自由血漿激肽釋放酶、凝血酶和胰蛋白酶組成的群組；或b.細菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶。
[0031]在ー種阻止或減少正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法中，其中所述衍生物包含具有經修飾輕鏈的胺基酸序列SEQ ID N0.7或其等效物，其中所述衍生物包含經修飾輕鏈以降低磷脂膜結合，其中與野生型人類因子Xa蛋白質的Gla-結構域相比，所述經修飾輕鏈在所述Gl a-結構域中包含至少ー個胺基酸取代、添加或缺失，其中所述衍生物選自由未羧化的因子Xa蛋白質、羧化不全的因子Xa蛋白質和脫羧的因子Xa蛋白質組成的群組，其中所述衍生物包含SEQ ID N0.7的經修飾重鏈或其等效物，其中所述衍生物是通過至少ー個選自由Glu216、Glu218、Arg332、Arg347、Lys351和Ser379組成的群組的胺基酸的胺基酸取代來修飾，其中Ser379經修飾成為脫氫丙氨酸或丙氨酸，其中所述衍生物是具有胺基酸序列SEQ ID N0.10或其等效物的去Gla酐-fXa，其中所述衍生物是具有胺基酸序列SEQ ID N0.11或其等效物的去Gla fXa_S379A，其中所述衍生物與ATII1、輔因子fV/fVa和/或fVIII/fVIIIa的相互作用降低且包含胺基酸序列SEQ ID N0.7或其等效物，其中所述衍生物包含胺基酸序列SEQ ID N0.12或13或15或與SEQ ID N0.12或13或15具有至少80%同源性的多肽，其中所述衍生物在胺基酸位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414、或Arg424處具有至少ー個胺基酸取代，其中所述衍生物在EGF結構域中具有修飾，所述修飾選自由EGF1結構域缺失、EGF2結構域缺失和EGF1和EGF2兩個結構域缺失組成的群組，其中所述衍生物偶聯至能夠延長所述衍生物的循環半壽期的部分，其中所述部分選自由以下組成的群組:聚こニ醇、醯基、脂質體、囊封劑、載劑蛋白、人工磷脂膜、納米粒子、Fc肽片段、包含Fc載劑結構域和fXa衍生物的嵌合蛋白質和其組合，其中所述方法進ー步包含投與有效量的延長所述衍生物的循環半壽期的試劑，其中所述試劑是特異性識別並結合fXa的外部位點的抗fXa抗體或結合fXa衍生物的α _2_巨球蛋白，其中所述因子Xa抑制劑選自由以下組成的群組:磺達肝素(fondaparinux)、伊達肝素(idraparinux)、生物素化的伊達肝素、依諾肝素(enoxaparin)、法安明(fragmin)、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班(apixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、PD-348292、奧米沙班(otamixaban)、DU_176b、LY517717、GSK913893、雷扎沙班(razaxaban)、低分子量肝素、貝特沙班(betrixaban)或其醫藥上可接受的鹽、和其組合，其中所述因子Xa抑制劑選自貝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其組合，其中所述個體正經歷選自由以下組成的群組的臨床重大出血事件:失血、重要器官出血、需要再次手術或新的治療程序的出血、和出血指數等於或大於2.0並伴有明顯出血，其中所述個體正經歷選自由以下組成的群組的出血事件:持續性或復發性鼻出血、不需要治療程序的直腸或泌尿道出血、顯著的注射位點血腫、非注射位點的自發性血腫、伴隨輕微創傷出現的血腫、大量血液流失、和需要非計劃性輸血的出血，其中所述衍生物是在手術之前投與。
[0032]ー種醫藥組合物，其包含結合至因子Xa抑制劑且不會組裝成凝血酶原酶複合物的因子Xa衍生物蛋白質和醫藥上可接受的載劑。
[0033]一種分離的多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.12或與SEQ ID N0.12具有至少80%同源性的多肽。
[0034]一種分離的多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.12。
[0035]一種分離的雙鏈多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.13或與SEQ ID N0.13具有至少80%同源性的多肽。
[0036]一種分離的多肽，其包含胺基酸序列SEQ ID N0.15或與SEQ ID N0.15具有至少80%同源性的多肽。
[0037]ー種肽偶聯物，其包含以共價方式或非共價方式連接至根據權利要求35至38中任ー權利要求所述的多肽的載劑，其中所述載劑是脂質體、膠束、醫藥上可接受的聚合物或醫藥上可接受的載劑。
[0038]ー種醫藥組合物，其包含`載劑和上述任一多肽。
[0039]—種多核苷酸，其編碼上述任ー多肽多肽。
[0040]ー種抗體，其結合上述任ー多肽，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0041]ー種上述抗體的生物活性片段，其中所述抗體以可檢測方式經標記。
[0042]一種組合物，其包含上述抗體和載劑。
[0043]一種組合物，其包含上述抗體片段。
[0044]—種抗體-肽複合物，其包含上述抗體和特異性結合至所述抗體的多肽，其中所述多肽是受到對抗可產生所述抗體的多肽，其中所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0045]—種製備上述任一多肽的方法,其包含在原核或真核宿主細胞中表達多核苷酸，所述多核苷酸編碼上述任ー多肽，其中所述多肽包含胺基酸序列SEQ ID N0.12且所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID N0.16，其中所述宿主細胞是中國倉鼠卵巢細胞(Chinesehamster ovary cell),該方法還包含分離所述多肽。
[0046]—種分離的原核或真核宿主細胞，其包含編碼上述任一多肽的多核苷酸。
[0047]一種組合物，其包含載劑和上述原核或真核宿主細胞。
[0048]ー種阻止或降低正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法，其包含向所述個體投與有效量的根據權利要求41所述的組合物。
[0049]一種選擇性結合併抑制正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體中以外源方式投與的因子Xa抑制劑的方法，其包含向所述個體投與有效量的上述組合物，其中所述因子Xa抑制劑選自由以下組成的群組:磺達肝素、伊達肝素、生物素化的伊達肝素、依諾肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX_9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD-348292、奧米沙班、DU-176b、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、貝特沙班或其醫藥上可接受的鹽、和其組合，其中所述因子Xa抑制劑選自貝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其組合，其中所述衍生物是在手術之前投與。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1示意性地展示表1中所示的人類因子X(SEQ ID N0.1)的結構域結構，如在李塔斯(Leytus)等人，生物化學(Biochem.)，1986，25，5098-5102 中所報告。SEQ ID N0.1是由表2中所示的人類fX的核苷酸序列(SEQ ID N0.2)編碼的人類fX的胺基酸序列，如此項技術中所習知。例如，經翻譯的胺基酸序列報告於李塔斯等人(Leytus)，生物化學(Biochem.), 1986, 25, 5098-5102 中且可在〈http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731> 的基因庫(GenBank)，「NM_000504」 中找到。此序列中的胺基酸編號是基於fX序列。人類fX前體(SEQ ID N0.1)含有前導序列(SEQ IDN0.1的胺基酸1至40)，隨後是對應於fX輕鏈(LC)的序列(SEQ ID N0.1的胺基酸41至179)、在fX分泌期間去除的RKR三聯體的序列(SEQ ID N0.1的胺基酸180至182)、和fX重鏈的序列(SEQ ID N0.1的胺基酸183至488)，所述重鏈含有激活肽(AP) (SEQ ID N0.1的胺基酸183至234)和催化結構域(SEQ ID N0.1的胺基酸235至488)。
[0051]圖2(SEQ ID N0.3)展示成熟人類因子X的胺基酸序列。此圖中胺基酸編號是基於成熟fX序列自fX輕鏈的N-末端開始。因子X在血漿中作為通過二硫鍵連接的雙鏈分子循環。輕鏈(LC)具有139個胺基酸(SEQ ID N0.1的胺基酸41至179)殘基且含有富gamma-羧基穀氨酸(Gla)的結構域(SEQ ID Ν0.3的1_45)(包括短芳香族堆棧(AS) (SEQ ID N0.3的胺基酸40-45))，之後是兩個表皮生長因子(EGF)樣結構域(EGF1:SEQ ID N0.3的胺基酸46-84，EGF2:SEQ ID N0.3胺基酸85-128)。重鏈(HC)具有306個胺基酸且含有52個胺基酸激活肽(AP:SEQ ID N0.3的胺基酸143-194)，然後是催化結構域(SEQ ID N0.3的胺基酸195-448)。糜蛋白酶編號中的H57-D102-S195的催化三元體等效物位於fX序列中的 His236、Asp282、和 Ser379 處並加下劃線(SEQ ID N0.3 的胺基酸 236,282 和 379)。
[0052]圖3示意性地展示圖2中所示的成熟人類因子X的結構域結構。此圖中的胺基酸編號是基於成熟fX序列。突出顯示用於糜蛋白酶消化以去除含Gla-結構域的片段(SEQID N0.3的胺基酸1-44)和用於fX激活以去除激活肽的切割位點。糜蛋白酶消化fXa產生缺少1-44胺基酸殘基的無Gla結構域fXa(SEQ ID N0.4)。
[0053]圖4展示在凝血酶生成(表示為相對螢光單位(RFU))分析中在組織因子的存在下各種濃度的rfVIIa對fXa抑制劑貝特沙班(如下文所述)的抗凝血活性的影響(如實例2中所述))。數據顯示，rfVIIa和組織因子的組合在高達200nM的濃度下不能完全中和fXa抑制劑貝特沙班的抗凝血活性。
[0054]圖5展示在含活性fXa和貝特沙班(空心圓)的純化系統中Gla-結構域完整的酐_fXa逆轉貝特沙班的fXa抑制作用，而與活性fXa相比，僅酐-fXa的促凝血活性(空心三角)可忽略。將fXa發色活性標準化成在無任何抑制劑的情況下的活性fXa(空心正方形)。此更充分地闡述於實例2中。數據表明，酐-fXa對於fXa底物無活性，但仍保留fXa抑制劑結合能力。
[0055]圖6展示在血楽;凝血酶生成(表示為相對突光單位(RFU))分析(如實例2中所述)中，圖5中具有完整Gla結構域的酐-fXa是有效抑制劑。其在115nM約時幾乎完全抑制凝血酶生成。數據表明，Gla-結構域未修飾的酐-fXa並不適於用作fXa抑制劑解毒剤。
[0056]圖7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在糜蛋白酶消化之前和在糜蛋白酶消化15分鐘和30分鐘之後的比較。如此圖中所示，凝血時間(0D405的變化)在fXa被糜蛋白酶消化15分鐘之後明顯延遲，且當fXa被消化30分鐘時有長達20分鐘的時間未觀察到凝血。此結果還用於建立糜蛋白酶消化酐_fXa的條件，這是因為在消化期間可監測到酐_fXa沒有活性。此更充分地闡述於實例3中。
[0057]圖8展示去Gla的酐-fXa對因子Xa抑制劑貝特沙班的結合親和力，如實例4中所闡述。數據表明，通過糜蛋白酶消化酐_fXa所製備以去除含Gla-結構域的片段(殘基1-44)的去Gla的酐-fXa能夠以與天然fXa類似的親和カ結合貝特沙班(fXa:Ki=0.12nM，去 Gla 的酐-fXa:Kd=0.32nM)。
[0058]圖9展示，在實例2的凝血酶生成分析中，通過添加濃度為680nM的解毒劑(去Gla的酐-fXa)逆轉不同濃度 貝特沙班的抗凝血活性。在濃度為680nM吋，去Gla的酐-fXa能夠產生實質上完全的fXa活性恢復。
[0059]圖10展示，在凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式(如實例3中所述)，通過不同濃度的解毒劑(去Gla的酐-fXa)逆轉250nM貝特沙班的抗凝血活性。數據表明，當使用約608nM的解毒劑來中和250nM的fXa抑制劑貝特沙班時，凝血時間與對照貧血小板血漿的凝血時間相當。
[0060]圖11展示，在凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式中，563nM的解毒劑(去Gla的酐-fXa)對依諾肝素(enoxaparin) (0.3125-1.25U/mL)的抗凝血活性的影響，其表示為標準化之後的倍數變化。分析方案闡述於實例3中。數據表明，添加563nM的解毒劑明顯中和低分子量肝素依諾肝素的活性。
[0061]圖12展示在發色分析中解毒劑(去Gla的酐-fXa)對凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)(—種特異性凝血酶抑制劑)對其的抑制作用。正如所預期，fXa抑制劑的解毒劑在高達538nM濃度下不會以可檢測方式影響凝血酶活性或所述特異性抑制劑阿加曲班對其的抑制作用。此更充分地闡述於實例14中。
[0062]圖13展示，在aPTT分析中使用標準凝血計時器通過改變解毒劑去Gla的酐-fXa的濃度對400nM貝特沙班抗凝血活性的影響。分析方案闡述於實例3中。數據展示，fXa抑制劑的解毒劑實質上400nM貝特沙班對fXa的抑制作用。據估計，在400nM貝特沙班的情況下，解毒劑的EC5(i為約656nM。
[0063]圖14展示CH0細胞中用於表達fXa三重突變體(SEQ ID N0.12)的DNA構建體的圖。將質粒DNA線性化並轉染至CHO dhfr(-)細胞中。使用四氫葉酸酯(HT)缺乏的培養基加甲氨蝶呤(MTX)來選擇細胞。通過ELISA來針對高蛋白質表達篩選穩定克隆。在無血清培養基中產生fXa三重突變體並通過離子交換與親和柱的組合來純化。圖中的編號是基於編碼人類fX SEQ ID N0.1的多核苷酸序列進行。例如，活性位點S419(SEQ ID N0.1)處的丙氨酸突變等效於成熟人類fX的S379(SEQ ID N0.3)處的突變，如整個申請案且更具體地實例7所討論。[0064]圖15展示分別使用識別fX重鏈和輕鏈的單克隆抗體純化的r-解毒劑的西方印跡(Western blot)。當將連接輕鏈和重鏈的ニ硫鍵還原後，r_解毒劑重鏈以類似於血漿源性fXa的預計分子量遷移。與正常FXa相比，fXa突變體的Gla-結構域中缺失6_39aa使得r-解毒劑輕鏈的分子量帶較低。
[0065]圖16展示經ロ單獨投與貝特沙班(15mg/kg)、或經ロ投與貝特沙班(15mg/kg)然後靜脈注射(300 μ g，IV)根據實例1製得的血漿源性解毒劑(pd-解毒劑)之後小鼠(n=7-10/組)中的貝特沙班血漿水平。pd-解毒劑是在1.5小時的時間點之前5分鐘時投與，並在經ロ投與貝特沙班之後1.5,2.0和4.0小時時取小鼠血液樣品(0.5mL)。分析全血INR、貝特沙班和解毒劑血漿水平。將小鼠血漿中的貝特沙班水平(平均值土SEM)繪示為小鼠投與15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg然後解毒劑注射(空心圓)之後隨時間變化的曲線。在1.5小時時間點(解毒劑注射後5分鐘)解毒劑治療組的PK-PD相關性匯總於表13中。根據INR測量值，單次注射解毒劑使功能性貝特沙班減少>50%。此更充分地闡述於實例8中。
[0066]圖17展示利用經純化r-解毒劑進行小鼠實驗(n=4_10/組)的結果。比較經ロ單獨投與貝特沙班(15mg/kg)或經ロ投與貝特沙班(15mg/kg)然後靜脈注射(300yg)r_解毒劑之後小鼠血漿中的貝特沙班水平(圖17A)和全血INR(圖17B)。標明各治療組的平均值。如表14中所匯總，單次靜脈注射r-解毒劑使得離體全血INR有>50%校正，此證明經由多次注射或其它方案解毒劑有效中和fXa抑制劑。這些結果表明，本發明的fXa變體具有用作普遍解毒劑來逆轉在出血或其它醫療急診的患者中fXa抑制劑的抗凝血作用的潛力。此更充分地闡述於實例8中。
[0067]圖18展示在96孔濁度變化凝血分析中r-解毒劑逆轉依諾肝素的抑制作用。這些結果基本上類似於pd-解毒劑(圖11)，此表明兩種fXa衍生物具有相當的功能性解毒劑活性。50nM r-解毒劑實質上校正(>75% ) 1.25U/mL依諾肝素的抑制作用。分析方案呈現於實例11中。
`[0068]圖19展示r-解毒劑逆轉低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人類血漿凝血分析中所測試。圖18和19 二者均於實例11中討論。
[0069]圖20展示r-解毒劑逆轉利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地討論於實例12中。
[0070]圖21展示r-解毒劑的多核苷酸序列和經翻譯多肽序列的排列。
[0071]圖22展示在單次靜脈注射(1次注射)或兩次注射(2次注射)r-解毒劑的情況下小鼠實驗(n=5/組，312ug/200ul r_解毒剤)的結果。對經ロ投與貝特沙班(15mg/kg)之後靜脈注射媒劑或r-解毒劑之後的血漿中的貝特沙班水平進行比較(圖22A)(參見實例8的詳細闡述)。如圖22A中所示，與媒劑對照(對照1)相比，單次靜脈注射r-解毒劑使血漿中的貝特沙班水平増加8倍以上，此表明解毒劑在活體內有效捕獲貝特沙班的能力。與單次注射相比，第二次注射解毒劑又使貝特沙班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血漿中貝特沙班的數量有限且其抗凝血作用可能被解毒劑逆轉。圖22B表明，單次和雙次注射解毒劑之後，所測量的INR隨小鼠血漿中解毒劑/貝特沙班的比例的增加而降低。
【具體實施方式】
[0072]1.定義[0073]除非另有說明，否則本發明的實踐將使用組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的常規技木，此在所屬領域的技術人員的範圍內。參見例如薩姆布魯克(Sambrook)和羅塞爾(Russell)編輯(2001)分子克隆:實驗室手冊(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第 3版；奧蘇貝爾(Ausubel)等人編輯(2007)最新分子生物學實驗方法彙編(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶學方法(Methods in Enzymology)系列(學術出版社公司(Academic Press, Inc.)，紐約(Ν.Υ.));麥克弗森(MacPherson)等人(1991)PCR1:實用方法(PCR1:A Practical Approach)(牛津大學出版社(Oxford University Press)的 IRL Press);麥克弗森(MacPherson)等人(1995)PCR2:實用方法(PCR2:A Practical Approach);哈洛(Harlow)和萊恩(Lane)編輯(1999)抗體，實驗室手冊(Antibodies, A Laboratory Manual);富潤氏尼(Freshney)(2005)動物細胞的培養:基本技術手冊(Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique),第 5 版；蓋特(Gait)編輯(1984)寡核苷酸的合成(OligonucleotideSynthesis);美國專利第4，683，195號；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984)核酸雜交(Nucleic Acid Hybridization);安德森(Anderson) (1999)核酸雜交(NucleicAcid Hybridization);黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)編輯(1984)轉錄和翻譯；固化細胞矛ロ酶(Transcription and Translation ；Immobilized Cells and Enzymes)(IRL Press (1986));佩巴爾(Perbal) (1984)分子克隆實驗指南(A Practical Guide 至Molecular Cloning);米勒(Miller)和考斯(Calos)編輯(1987)哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(冷泉港實驗室(Cold SpringHarbor Laboratory));馬克瑞德斯(Makrides)編輯(2003)哺乳動物細胞的基因轉移和表達(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells);邁耳(Mayer)和沃克(Walker)編輯(1987)細胞核分子生物學中的免疫化學方法(Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology)(學術出版社(Academic Press),倫敦(London))；赫岑貝格(Herzenberg)等人編輯(1996)串爾的實驗免疫學手冊(Weir’s Handbook ofExperimental Immunology);小鼠胚胎探作實驗J旨南(Manipulating the Mouse Embryo:ALaboratory Manual),第 3版(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress) (2002))?
[0074]所有包括範圍在內的數值指定(例如，pH、溫度、時間、濃度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)0.1的增量變化。應了解，但不一定明確陳述所有數值指定前面皆有術語「約」。還應該了解，但未必明確陳述本文所述的試劑僅是例示性的且這些試劑的等效物已為此項技術習知。
[0075]除非上下文另有明確說明，否則說明書和權利要求書中使用的単數形式「一(a，an)」和「所述的(the)」包括複數意義。例如，術語「醫藥上可接受的載劑」包括多種醫藥上可接受的載劑(包括其混合物)。
[0076]本文所用術語「包含」意欲指組合物和方法包括所列舉要素，但並不排除其它要素。當使用「基本上由…組成」定義組合物和方法時，將意味著出於所想要的用途不包括對所述組合有任何本質意義的其它要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物不會將來自分離和純化方法的痕量汙染物和醫藥上可接受的載劑(例如磷酸鹽緩衝的鹽水、防腐劑、和諸如此類)排除在外。「由…組成」將意味著排除超過其它成分的痕量元素和用於投與本發明組合物的大量方法步驟。通過這些過渡術語中的每ー者定義的實施例均在本發明的範圍內。
[0077]診斷或治療的「個體」是細胞或哺乳動物(包括人類)。診斷或治療的非人類動物個體包括(例如)鼠科動物(例如大鼠、小鼠)、犬科動物(例如狗)、兔科動物(例如兔子)、家畜、運動動物和寵物。
[0078]術語「蛋白質」和「多肽」可互換使用且在其最廣泛意義上是指兩個或兩個以上的亞單位胺基酸、胺基酸類似物或擬肽的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另ー實施例中，所述亞單位可通過其它鍵(例如，酷、醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸且對蛋白質或肽序列中可包含的胺基酸的最大數量並無限制。本文所用術語「胺基酸」涉及天然的和/或非天然的或合成的胺基酸，其包括甘氨酸和D與L光學異構體二者、胺基酸類似物和擬肽物質。天然存在的胺基酸的單個字母和三個字母縮寫列示於下文中。如果肽鏈短，通常將三個或三個以上胺基酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈較長，則通常將所述肽稱為多肽或蛋白質。
[0079]
【權利要求】
1.ー種阻止或減少正利用因子Xa抑制劑進行抗凝血療法的個體出血的方法，其包含向所述個體投與有效量的因子Xa蛋白質衍生物，所述因子Xa蛋白質衍生物結合至所述因子Xa抑制劑且不會組裝成凝血酶原酶複合物。
2.一種選擇性結合併抑制個體中以外源方式投與的因子Xa抑制劑的方法，其包含向所述個體投與有效量的Xa蛋白質衍生物，所述Xa蛋白質衍生物結合至所述因子Xa抑制劑且不會組裝成凝血酶原酶複合物。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述因子Xa蛋白質衍生物直接或間接地結合至所述因子Xa抑制劑。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述衍生物具有降低的促凝血活性或沒有促凝血活性。
5.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述衍生物是Gla缺乏的因子Xa蛋白質衍生物或去Gla因子Xa蛋白質。
6.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述衍生物具有經修飾的活性位點。
7.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述衍生物至少包含SEQID N0.3的胺基酸殘基46至448或其等效物。
8.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述衍生物至少包含SEQID N0.3的胺基酸殘基46至139和195至448或其等效物。
9.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述衍生物缺少fXa的輕鏈且含有在重鏈中存在的絲氨酸蛋白酶催化結構域。
10.根據任一前述權利要求所述的方法，其中所述衍生物是包含胺基酸序列SEQIDN0.5的多肽。
【文檔編號】A61P7/04GK103446579SQ201310301566
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2008年9月26日 優先權日:2007年9月28日
【發明者】盧根民, 戴維·R·菲利普斯, 派屈克·安德烈, 烏馬·辛哈 申請人:普託拉製藥有限公司