一株吡啶降解菌及其應用的製作方法

2023-04-29 14:51:11 1

專利名稱：：一株吡啶降解菌及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一株吡啶降解菌及其應用。
背景技術：
：吡啶在常溫下是一種無色有刺激性氣味的液體，是目前雜環芳烴中開發應用範圍最廣的品種之一。吡啶有毒，致癌、致畸、致突變，且易在生物體內富集。可通過吸入、攝取或皮膚接觸對人體產生危害，能麻醉中樞神經系統，對眼及上呼吸道有刺激作用。長期吸入出現頭暈、頭痛、失眠、步態不穩及消化道功能紊亂，可發生肝腎損害，引起皮炎。吡啶是一種良好的溶劑，在工業上可用作變性劑、助染劑，以及其它一系列產品，包括農藥、醫藥、染料、日用化工、香料、飼料添加劑、橡膠助劑等的合成起始物。很多工業廢水中都含吡啶，如焦化廢水、染料廢水、製藥廢水等。焦化廢水等含吡啶工業廢水的處理方法一般有物化法、高級氧化法和生物法。相比而言，生物法處理量大，成本低，條件溫和，不需要特殊的儀器設備，具有降解徹底和不產生二次汙染的優點，是最經濟實用的汙染處理方法。然而傳統的生物處理技術很難達到處理效果，已不能滿足環保需求。20世紀70年代出現的生物強化技術可以在不改變現有處理設施的基礎上，大大提高汙水處理的範圍和能力，因而近年來受到了廣泛的關注。生物強化技術是通過向廢水處理系統中投加從自然環境中篩選出來的高效降解菌或者經過基因重組而得到的基因工程菌，去除某種或某幾種汙染物，以增強廢水處理系統的處理能力、提高處理效率。用生物強化法處理含吡啶廢水有諸多優勢，已成為研究的熱點。生物強化技術的核心是所投加的具有高效降解特性的微生物。人們已經分離出了很多吡腚降解菌株，其中大部分是細菌，如假單胞菌屬CPw^fe附o朋力、節桿菌屬04wAra6ac敏)、戈登氏菌(GoWom'a"/"c/a)芽孢桿菌(5(3c/〃us)等，也有放線菌和真菌，例如嗜鹽放線菌(A^c"Wo/cfesp.)和白腐真菌。這些研究大多停留在實驗室階段，由於水質水力條件及土著菌的競爭等各種原因，一些生物強化系統實際應用效果不理想。因此開發有利於汙水處理實際應用的降解菌株及其使用方法十分必要。本發明的高效降解菌株提取自焦化廢水，因此在實際應用中可較好適應廢水處理運行模式。國際上對幼^^zoog/oeo!Vfc菌的研究很少，目前未見其降解吡啶的報導。
發明內容本發明的目的是提供一株吡啶降解菌及其應用。本發明所提供的吡啶降解菌為幼/"e〃azoog/oeo/cfeyBC026CGMCCJ^.2224。所述幼/"eZ/azoog/oeo/^sBC026CGMCC來源於首鋼焦化廠汙水處理系統二沉池回流汙泥，經馴化、分離、純化得到。該菌株是陰性革蘭氏桿菌，好氧，有運動性，在固體培養基中是黃褐色、表面光滑的圓形小菌落，在液體培養基中有自絮凝現象。幼/"e/Zazoog/oeo/cfesBC026CGMCCW.2224對氨苄青黴素、硫酸卡那黴素、壯觀黴素有抗性，對氯黴素、四環素、頭孢敏感。在阿須貝無氮培養基中生長良好，攜帶有兩個大質粒。幼/"e〃azoog/oeo/cfesBC026CGMCCW2.2224的16SrRNA序列如序列表中序列1所示。所述幼/"e〃azoog/oeoW^BC026CGMCCWs.2224，已於2007年10月23日保藏於中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海澱區中關村北一條13號)，保藏號為CGMCCW.2224。本發明的幼/朋Z/azoog/oeo/cfeBC026可用於汙水體系中吡啶的降解，具體方法可為將S/^eZ/azoog/oeo/cfesBC026CGMCCW2.2224懸浮於含有吡啶和/或其衍生物的汙水中，在20—35"C，pH值為5-9的條件下培養。所述幼/we/Zazoog/oeo/^sBC026CGMCCJV2.2224在汙水中培養的溫度優選為30-35°C，最佳為3(TC，pH值條件優選為pH7-pH8，最佳為pH8。以上述幼/""^^00^/0￡0/^5BC026為活性成分的生物菌劑也屬於本發明的保護範圍；該菌劑中可根據需要，添加可接受的輔料。本發明的幼Z"e〃azoog/oeozVfesBC026，當投菌量為0.1g/L時，在30°C，180r/min，pH值為7的條件下，BC026菌可以在17h內將濃度為400mg/L的吡啶完全降解。在吡啶初始濃度為991806mg/L的無機鹽培養基中，BC026菌均能保持較高的降解活性；降解最適溫度為30。C，最適pH值為8。由氮轉化實驗推測，BC026菌降解吡啶的第一步是斷開兩條C-N鏈，生成氨氮和戊二醛，隨後戊二醛被氧化為戊二酸，並最終轉化為二氧化碳和水。整個降解過程中吡啶約有50%的氮轉化成氨氮。利用本發明的zoog/oeo/^fesBC026用於汙水體系中吡啶的降解，不僅具有很高的降解效率，同時本發明的S/^e/Zflzoog/oeo^fesBC026為具有自絮凝的特性，汙水處理中可發揮重要的作用，增強系統的耐衝擊性。本發明的幼/"e/Zazoog/oeoZ^feyBC026取自於廢水處理單元，是廢水處理系統中的優勢菌種，能適應複雜的實際條件，因而該菌株的應用前景廣闊。本發明的幼/we〃azoog/oeo/A^BC026攜帶兩個大質粒，可能編碼吡啶降解基因，為以後基因工程菌的4構造創造了條件。圖1為BC026掃描電鏡照片。圖2為BC026菌對吡啶的生物降解。圖3為BC026菌對不同濃度吡啶的降解情況。圖4為不同溫度下吡啶的降解特性研究。圖5為不同pH下BC026菌對吡啶的生物降解特性。圖6為BC026菌降解過程中吡啶與氨氮的濃度變化。圖7為BC026菌對吡啶的可能代謝途徑。圖8為BC026質粒電泳圖。具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例l、^/"e//azoog/oeo^feyBC026的分離、純化及其鑑定1、幼/"e〃fl加og/oeo/c^BC026的分離及純化S/2/"e〃a加og/c^WesBC026是從首鋼焦化廠汙水處理系統二沉池的活性汙泥中取樣，經過馴化、分離及純化得到的一株革蘭氏陰性菌。具體步驟如下取首鋼焦化廠廢水處理系統二沉池回流汙泥。在裝有汙泥樣本的容器中滴加少量吡啶溶液(使吡啶濃度保持100—200mg/L)，間歇曝氣，定期加入10mL吡啶(300mg/L)、以及50mL原焦化廢水，同時加入2mL磷酸鹽緩衝液(每L含8.5gKH2P04，21.75gK2HP04，33.4gNa2HP04'7H20，1.7gNH4Cl，pH為7.2)以及2mL微量元素溶液(每L含1.5gFeCl3'6H20，0.024gMCl2'6H20，0.19gCoCl2'6H20，0.002gCuCl2-2H20，0.024gNa2Mo04'2H20，0.07gZnCl2，0.006gH3B03)，馴化60天。取200mL上述馴化得到的培養液於三角瓶中，加入2滴0.01%的焦磷酸鈉溶液及數粒玻璃微珠，在30。C，180r/min的搖床中震蕩30min充分搖勻，然後離心。將沉澱轉移到100mL含500mg/L吡啶的無機鹽培養基(每L中含:Na2HPCV12H201.42g、KH2P041.36g、MgS04-7H200.216g、CaCl20.006g、MnS04-H201.69g、CoCl26H200.00024g、H3B030.00116g、Na2Mo04.2H200.000024g、FeS04-7H200.00278g、ZnS047H200.00115g、CuS04'5H200.00038g)中培養，30°C，搖床180r/min培養，約4天後，取5mL菌液在無機鹽培養基中相同條件下轉接培養兩次。此時，用滅菌去離子水將菌液稀釋10"到10_7倍，各取0.1mL稀釋液於無機鹽固體培養基(上述無機鹽液體培養基中加入2%瓊脂而製得)平板中塗布分離，30'C培養，長出明顯菌落後，挑取有代表性的單菌落，劃線分離純化。得到7株可以在無機鹽固體培養基上生長的菌株，將這些菌株的LB培養液於-7(TC保存在終濃度為15%的甘油中，分別給以編號。通過觀察菌的生長速率及檢測吡啶降解情況，確定一株菌株(BC026)降解吡啶的能力最強，同時該株菌在液體培養中有自絮凝的特性(菌株培養後肉眼可觀察到培養液中出現絮狀菌團)，這種特性將有助於其在汙水處理系統中形成菌膠團，增強生物處理系統的耐衝擊性，因而該菌具有較高研究價值。BC026液體培養條件是在250mL錐形瓶中加入100mL培養基，以500mg/L吡啶作為唯一的碳、氮源，搖床設為3(TC，180r/min。LB培養基中加入500mg/L吡啶，保持細菌降解活力，防止雜菌侵入。通過離心收集菌體，離心條件為4000r/min，10min。該BC026菌株是陰性革蘭氏桿菌，好氧，有運動性，在固體培養基中是黃褐色、表面光滑的圓形小菌落，在液體培養基中有自絮凝現象。該菌對氨節青黴素、硫酸卡那黴素、壯觀黴素有抗性，對氯黴素、四環素、頭孢敏感。在阿須貝無氮培養基中生長良好。BC026的掃描電鏡照片如圖1所示。將該BC026菌株送交微生物所進行的生理生化特徵鑑定，鑑定結果如表1所示。表1.BC026菌株的生理生化特徵tableseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage72、S/w'"e〃ofzoog/oeo/flfesBC026的16SrDNA鑑定通過16SrRNA序列分析和Biolog微生物鑑定系統鑑定，確定BC026菌為腸e〃a層g/oeo/cfe。具體步驟如下以TIANGEN基因組DNA提取試劑盒提取BC026菌的基因組DNA，作為PCR反應的模板，設計引物進行PCR片斷基因擴增。上下遊引物序列分別為27F:5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'1492R:5'TACGGTTACCTTGTTACGACTT3，PCR設定程序為先94。C預變性2min;然後94。C變性1min，55。C退火1min，72。C延伸lmin，共30個循環；最後72。C終延伸15min，4。C保存。PCR產物用0.8%的瓊脂糖凝膠分離，純化與回收後測序。測序結果BC026菌的16SrDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。將BC026的16SrRNA測序結果導入GenBank中進行同源性比對，結果表明它與CraZ)/ree//ai^cc/za,o/Ma(AB238789)、Zoog/oeflraw扭m(X74915)、Afyco//"""sp.(AB248361)的同源性均為99。/。。為了確認實驗室的鑑定結果，委託中國科學院微生物研究所進行專業鑑定，根據該菌的多項生理生化特性，以及Biolog微生物鑑定系統的分析，確定BC026屬S//"e〃a加og/oeo/afey。iS"綠e〃azoog7o柳'dey同禾中異名為Cra6free〃aj"cc/aro/M"禾口生枝動膠菌(Zoog/oeflraw/gera)，2006年重新分類後命名為5Tn'we〃azoog/oeo〖cfes，暫無中文譯名。因此，該細菌被正式命名為幼/朋〃azoog/oeo/^sBC026，已於2007年10月23日保藏於中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海澱區中關村北一條13號)，保藏號為CGMCCW.2224。3、幼/Me〃flzoogfoeo/c^BC026為自生固氮菌根據文獻，生枝動膠菌是自生固氮菌。通過阿須貝無氮培養基培養，證明BC026菌是一株自生固氮菌。具體方法為將BC026菌塗布於阿須貝無氮培養基上，阿須貝無氮培養基組成為C7H1206，10g/L;KH2P04，0.2g/L;MgS04.7H20，0.2g/L;NaCl，0.2g/L;CaS04-2H20，0.1g/L;CaC03，5g/L。觀察BC026菌可在培養基上良好生長，以此判斷BC026菌是一株自生固氮菌。實施例2、57'"e//flzoog/oeozVfesBC026CGMCCW2.2224對吡啶的生物降解效果檢測1、S/w>7e//azoog/oeoWesBC026CGMCCJ^.2224對吡啶的生物降解能力檢測在以吡啶為唯一碳、氮源的條件下，考察BC026對吡啶的降解能力。發現BC026菌對吡啶有較好的去除效果，能在較短時間內完成降解。具體步驟如下.-1)取2mL培養至對數期的幼/"e〃azoog/oewVfeBC026CGMCCJV2.2224的LB培養液，收集菌體沉澱，接種到裝有200mL無機鹽培養基的三角瓶中，培養至對數期。2)離心菌液，所得S/n'"e化zoogfoecH'cfcBC026菌體沉澱用無機鹽培養基重懸、離心三次以去除幼/"e/fezoog/oeo/cfeyBC026菌表面吸附的雜質，再轉移到一定體積的滅菌無機鹽液體培養基中，製備成菌液光密度值OD6。2為12的幼/"e/tozoog/oeoWeyBC026菌懸液，作為降解實驗的接種液，同時用乾重法測定實際接種量。3)將步驟2)製備的^/"e//azoog/oeo/^/&zoog/oeo/a^BC026菌懸液，作為降解實驗的接種液。同時用乾重法測定實際接種量。3)在4個裝有100mL無機鹽培養基的250mL三角瓶中分別加入吡啶，其終濃度分別為99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L，然後分別將步驟2)製備得到的幼/we〃azoog/oeo/flfeyBC026菌懸液以幹菌體接種量為0.06g/L接種於上述三角瓶中，以未接種裝有100mL含吡啶終濃度為1896mg/L的無機鹽培養基的250mL三角瓶為空白對照，將各個三角瓶用封口膜密封，在3(TC，180rpm的搖床中振蕩培養。4)在步驟3)所述的培養過程中，間隔12小時分別取在步驟3)所述的處理及空白對照的反應液，測定吡啶濃度和菌液吸光度。吡啶濃度和菌液吸光度檢測方法如步驟1中的步驟4)所述。結果如圖3所示，其中吡啶濃度變化曲線如圖3中B所示，由圖3中B可以看出在吡啶初始濃度為991806mg/L的培養液中，S/z/"e〃azoog/oeo/^sBC026菌都可降解吡啶，但各吡啶初始濃度條件下，抑制期的長短和降解速率不同。在吡啶初始濃度為99mg/L的培養液中，W/"e〃flzoog/oeo/^sBC026幾乎沒有表現出抑制期，吡啶濃度直線下降。隨著吡啶初始濃度的升高，抑制期時間變長，說明吡啶初始濃度越高，細菌適應越慢。但是一旦進入降解期，吡啶初始濃度高的培養液中微生物降解速率快，從圖中看即為斜率絕對值較大，這是因為細菌完全適應了生長環境，高濃度的吡啶給細菌提供更充足的營養基質從事生命活動並大量繁殖，而細菌數量增大後，所需的碳、氮源多，吡啶的降解速率相應提高，二者相互促進。菌液吸光度的變化曲線如圖3中A所示；圖3中A可以看出，四個濃度下，菌量都隨著吡啶的降解而升高。在吡啶初始濃度為99mg/L的培養液中，菌密度曲線很快達到最高點，與圖3中B對照，表明在吡啶初始濃度為99mg/L的培養液的吡啶濃度降到20mg/L時，可利用的基質過少成為幼/"eZ/azoog/oeo/tfesBC026生長的限制因素，S/^e/Zazoog/oeoW^BCOSG菌量開始下降。從吡啶初始濃度為1806mg/L的菌液吸光度的變化曲線可以看出實驗初期細菌生長速度較慢，吡啶的降解速率也比較慢，但隨著吡啶的降解，高濃度吡啶對幼/朋//"200^/0￡0/&58(:026生長的抑制作用逐漸減弱；當吡啶濃度降為400mg/L左右時，幼/朋Z/azoog/oeo^eyBC026生長進入對數期，菌量迅速增大。在不同的吡啶濃度下，所能達到的最大菌密度及所需時間各不相同，四條曲線中，最大菌密度分別為0.217g/L、0.623g/L、0.857g/L、1.375g/L，所需時間分別為15.5h、17.5h、27.5h和56.5h。隨著吡啶初始濃度的升高，培養液中碳、氮源的量變大，最大菌密度遞增。但是這種增長並不成正比，這說明，幼/"e/^zoog/oeo^eyBC026的生長的限制因素不僅有吡啶的濃度，還有其它的因素，例如與代謝產物的積累以及細菌對生存空間的競爭有關。圖3中A中的99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L分別指S/n'"e〃azoog/oeo/ofe;yBC026在上述含吡啶濃度為99mg/L、473mg/L、932mg/L或1806mg/L的培養基中培養過程中菌密度(OD602)的變化曲線；圖3中B中的99mg/L、473mg/L、932mg/L、1806mg/L、空白對照分別指S/z/"e〃azoog/oeo/^feBC026在上述含吡啶濃度為99mg/L、473mg/L、932mg/L或1806mg/L的培養基培養或上述空白對照處理過程中吡啶濃度變化曲線。3、S/w'"e〃azoog/oeoW^BC026菌在不同溫度下的降解特性在不同溫度下實施降解實驗，發現BC026菌在3035C具有較高的吡啶降解效率，從實際應用的角度看，選擇3(TC較為適宜。具體步驟如下在無機鹽培養基中加入終濃度為500mg/L吡啶後，將步驟2中的步驟2)製備得到的幼f"e〃azoog/oeo/^fesBC026菌懸液以幹菌體接種量為0.14g/L接種於該培養基中，分取100mL培養液分裝至四個250mL三角瓶中，分別置於20°C、25°C、30°C、35。C的搖床中培養。將一個裝有lOOmL未接菌、終濃度為500mg/L吡啶的無機鹽培養基在35'C的搖床中同時培養，以設為空白對照。然後按照步驟l中的步驟4)所述的方法進行取樣，測定培養過程中的吡啶濃度變化，繪製吡啶濃度變化曲線。結果如圖4所示，結果表明，由於實驗加大了幹菌體投菌量(0.14g/L)，因此細菌直接進入對數降解期。從圖4可以看出，2(TC時的降解速度最慢，25"C時的速度稍快，3(TC和35。C時的降解速率最高。3(TC與35。C的降解能力相差很小，在反應12h時的降解速率幾乎同時達到85y。。這說明細菌最適的生長、降解溫度可能處於3035。C之間，考慮到汙水處理工藝的實際情況，BC026菌的培養溫度選擇3(TC較為合理。圖4中的標註20。C、25°C、30°C、35°C、空白對照分別是上述幼/朋〃azoog/oewVfeBC026在20°C、25°C、3(TC或35。C條件下培養或上述空白對照處理過程中吡澱濃度變化曲線。4、幼!'Me/Zazoog/oeoWesBC026菌在不同pH值下的降解特性由不同起始pH值條件的降解實驗，發現BC026菌的最適降解pH值為8。具體步驟如下在7個250mL三角瓶中裝入相同體積的無機鹽培養基，分別調節pH至4、5、6、7、8、9、10，均以接種量為0.13§化接種步驟2中的步驟2)製備得到的幼^//0zoog/oeo^^BC026菌懸液，並分別加入吡啶至終濃度為500mg/L，培養液終體積均11為100mL。將各個三角瓶用封口膜密封，在30。C，180rpm的搖床中振蕩培養。培養過程中，按照步驟1中的步驟4)所述的方法進行取樣，測定培養過程中的吡啶濃度變化，繪製吡啶濃度變化曲線。結果如圖5所示，從圖5分析得出，pH值為4和10時，BC026菌對吡啶沒有降解作用。pH為4的培養液中，溶液很清亮，細胞凝聚成小顆粒沉澱。pH值為10時，培養基中的部分成分生成沉澱，破壞了培養基組成。實驗中測定在pH值為4和10的條件下菌量略有降低。在pH為59的條件下，細菌都能以吡啶為唯一的碳、氮源生長，只是降解的速率不同，降解最快的pH值為8，其它依次為pH7〉pH6-pH5>pH9。圖5中的pH二4、pH=5、pH=6、pH=7、pH=8、pH=9、pH二10分別指W/"e〃"zwg/oeoW^BC026在pH為4、5、6、7、8、9或10條件下培養過程中吡啶濃度變化曲線。5、幼/"e〃azoog/oeo/cfeyBC026菌對吡啶代謝途徑的檢測測定降解過程中的氨氮濃度與吡啶的變化關係，推測出BC026菌對吡啶的可能代謝途徑。具體步驟如下1)取2mL培養至對數期的幼/"e〃azoog/oeo/tfeyBC026CGMCCW.2224的LB培養液，收集菌體沉澱接種到裝有200mL無機鹽培養基的三角瓶中，培養至對數期。2)離心菌液，所得zoog/oeo/tfeyBC026菌體沉澱用無機鹽培養基重懸、離心三次以去除幼/"eZ/azoog/oeoW^BC026菌表面吸附的雜質，再轉移到一定體積的滅菌無機鹽液體培養基中，製備成菌液光密度值OD6Q2為12的S/e/ZazoogfoeoWMBC026菌懸液，作為降解實驗的接種液。同時用乾重法測定實際接種量。3)將步驟2)製備得到的幼/we〃flzoog/oewVfesBC026菌懸液以幹菌體接種量為0.1g/L接種於100mL含有400mg/L吡啶的無機鹽培養基中，用封口膜密封，在30°C，180rpm的搖床中振蕩培養。取未加菌、含有400mg/L吡啶的無機鹽培養基進行相同條件下的培養，以設為空白對照。4)間隔23h取培養菌液樣品，按照下述步驟測定吡啶和氨氮的濃度。間隔34h取培養菌液樣品，按照下述步驟測定中間產物。檢測方法為吡啶濃度樣品由0.22pm濾膜過濾後，通過高效液相色譜(島津LC10ADVP,SPD10AVPUV-VisDetector;DiamonsilC18色譜柱，250mmx4.6mm，5(im)測定。氨氮濃度樣品經0.22(im濾膜過濾，用水楊酸-次氯酸鹽光度法(GB7481-87)測定。中間產物樣品經0.22pm濾膜過濾、二氯甲烷等體積萃取，然後用預先烘乾的無水硫酸鈉過濾，在GC/MS(Agilent6890NGC/5973MSD，DB-5MS毛細管柱，30mx0.25mmx0.25)im)上定性分析。結果如圖6所示，由圖6表明，降解過程中產生氨氮。吡啶開始減少的同時，氨氮的量升高，這說明吡啶降解的第一步就脫去氮原子，氮分子以氨氮的形式釋放到溶液中。吡啶完全降解後，氨氮的量不再增加，這進一步證明沒有其他的中間產物可以脫氮轉變成氨氮。而根據文獻吡啶能促使與戊二醛、戊二酸脫氫酶有關的輔酶產生，結合吡啶完全對稱的結構推測，吡啶脫氮時打開了兩個C-N鍵。當吡啶降解完全後，氨氮的量開始降低，這證明培養液中還有可以充當碳源的物質，即吡啶脫氮後的中間代謝產物。實驗過程中取樣由GC-MS測定，沒有檢出中間代謝產物，這與文獻報導相同。降解過程中的pH值隨著吡啶的降解而降低，吡啶完全降解後，pH值開始升高。這說明吡啶降解產生酸性的中間產物，根據文獻報導，推測這種中間代謝產物有可能是戊二酸，而這種物質可能由戊二醛氧化而來。戊二醛可能並不是經由吡啶脫氮羥基化所得的產物氧化而來，因此推測吡啶脫氮後生成戊二醛，這與文獻報導的吡啶中間產物為氨基乙酸和丙二酸不同。在17h左右，氨氮量不再減少，而氨氮是BC026菌可利用的一種氮源，根據文獻報導，生枝動膠菌為化能異養菌，這說明培養體系中缺乏可利用的有機碳，因此可推斷戊二酸進一步轉化為BC026無法利用的無機碳。一般情況下，生物通過同化與異化作用將一部分碳轉化為自身的生命物質外，其它碳由呼吸作用，最終以二氧化碳的形式釋放，因此這種無機碳可能為二氧化碳。由吡啶和氨氮的對應關係可以看出，在降解過程中，吡啶中的氮約有50%轉化為氨氮。另有50%的氮在生物體內或環境中以其他形式存在。圖6中的吡啶-N是BC026培養過程中吡啶濃度變化曲線，氨氮是BC026培養過程中氮濃度變化曲線。綜上所述，推測當BC026菌以吡啶為唯一碳、氮源時的代謝途徑如圖7所示。繼續對菌液進行培養，氨氮的量基本沒有變化，當向培養液中補加滅菌葡萄糖溶液後，測定體系中的氨氮量，發現氨氮濃度快速降低至零，這是因為吡啶是培養液中的唯一碳、氮源，而吡啶的碳、氮比遠小於微生物生長的最佳碳、氮比，因此證明培養後期表現出來的細菌衰亡是由缺乏碳源引起的。6、zoog/oemVfeyBC026菌的質粒提取用QIAGEN試劑盒提供的方法提取BC026菌中的質粒。證明了幼/"eZ/flzoog/oeo^esBC026中有兩個大質粒，其功能還在進一步驗證中。具體步驟如下1)在LB培養液中加入終濃度為500mg/L的吡啶，接種zoog/oeo^esBC026，培養至對數後期。2)根據QIAGEN質粒提取試劑盒的方法提取質粒。3)用瓊脂糖凝膠電泳分離。結果如圖8所示，結果表明，S/2/"e//flzoog/oeoW^BC026中有兩個大質粒(圖8中質粒1條帶，質粒2條帶)。圖8中，泳道L1為分子量標準，泳道L2—L7序列表1<210〉11449DNAiS7z/"e〃ofzoog/o柳V/es1catggctcag33Cg犯CgCtggcggcaggcttaacacatgc犯gtcgsac60gccccgcaaggggagtggcagacgggtgagt咖gcgtgggaatctacccatctctacgg120犯t犯ctcsggg3a3cttgtgctaataccgtatacgcccttcgggggaaagatttatcgg180卿tggatg3gcccgcgttggatt3gctsgttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacg240atccatagctggtctg卿ggatg3tcsgccacattgggactg3gscacggcccaaactc300ctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgcc360gcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaCCggtg犯g3taatgacggt420aaccggagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacg肌gggggct■agcgttgttcggaattactgggcgt犯3gcgcacgtaggcgggt3ttt犯gtc鄉ggtg540aaatcccggagctcaactccggaactgcctttgatactgggta_cct3gagtatgga^gsg600gtaagtggaattccgagtgt卿ggtg犯attcgtagatattcgg鄉肌caccagtggc660gaaggcggcttactggtccattactgacgctgaggtgcga33gCgtggggagcaaacagg720attagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtcggcatgcatgca780tgtcggtggcgC3gCt犯Cgcattaaaca"ttccgcctggggagtacggtc840aeictcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggeigcatgtggtttaattcgaagc■犯cgcgcag3accttaccagcccttgacatgtcggtcgcggattacagagatgttttcct960tcagttaggctggaccgaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagat1020gttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttggg1080C3ctctaagggg3CtgCCggtgataagccgagagg鄉gtggggatgacgtcaagtcctc1140acggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaMggtggtgacagtgggceigcg卿1200cagcgatgtcgagctaatctccaa3Eigcc3tctcagttcggattgcactctgcaactcga1260gtgC3tgaagttggaatcgctagtaatcgcgga_tcagcatgccgcggtgeiatacgttccc1320gggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgatgcgc1380taaccgcaaggaggcagtcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaag1440gtaaccgta1449權利要求1、ShinellazoogloeoidesBC026CGMCC№.2224。2、S/zZ"e〃azoog/oeo/tfesBC026CGMCCJY2.2224在降解含氮雜環化合物中的應用。3、根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述含氮雜環化合物為吡啶或其衍生物。4、根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述降解含氮雜環化合物為降解汙水中的吡啶和/或其衍生物，具體方法為將幼/"e/Zazoog/oeoW^BC026CGMCCW2,2224懸浮於含有吡啶和/或其衍生物的汙水中，在20—35。C，pH值為5-9的條件下培養。5、根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述幼/"e〃azoog/oeo/cfeBC026CGMCC在汙水中培養的溫度為30-35°C，pH值條件為pH7-pH8。6、根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述幼,"e〃azoog/oeo^^BC026CGMCCWs.2224在汙水中培養的溫度為30°C，pH值條件為pH8。7、以幼/"e〃azoog/oeo/cfesBC026CGMCCW2.2224為活性成分的生物菌劑。全文摘要本發明公開了一株吡啶降解菌及其應用。該吡啶降解菌為ShinellazoogloeoidesBC026CGMCC№.2224。利用本發明的ShinellazoogloeoidesBC026用於汙水體系中吡啶的降解，不僅具有很高的降解效率，同時本發明的ShinellazoogloeoidesBC026為具有自絮凝的特性，汙水處理中可發揮重要的作用，增強系統的耐衝擊性。文檔編號C12N1/20GK101255403SQ20071030387公開日2008年9月3日申請日期2007年12月26日優先權日2007年12月26日發明者唐孝炎,孫慶華,柏耀輝,溫東輝,翠趙申請人:北京大學