抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-29 18:56:16 2

專利名稱：抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製品製備技術及應用領域，尤其是涉及一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體及其製備方法和應用。
背景技術：
甲魚系統性敗血症球狀病毒(Soft-shelledturtle systemic septicemiaspherical virus, STSSSV)是從發病甲魚中分離的一種新型病毒。毒株為P1015株,保藏號為CGMCC N0.5378，於2011年10月21日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。該病毒無囊膜，直徑23-40nm，細胞核內、外均可增殖。該病毒能導致甲魚系統性出血、敗血，來勢猛，7-10天內累積死亡率可達90-100%。2005年來，浙江寧波等地區中華鱉生態養殖場發生的暴發性敗血症多由該病毒所致，常規藥物治療無效，給養殖戶造成巨大經濟損失。目前，該病尚處於研究初始階段，無有效治療方法，部分養殖戶濫用抗生素進行防治，非但沒有療效，反而破壞了生態環境，使其他病原生物產生耐藥性，造成並發性疾病，給該病的防治增加了壓力。鑑於此，尋找一種高效、綠色的甲魚系統性敗血症治療方法勢在必行。卵黃抗體(IgY)是從經抗原免疫的禽類所產卵中分離的具有特異性的蛋白，它具有產率高、穩定性好、特異性強等優點，是一種易於生產的廉價抗體，免疫I只雞所收集到的僅I個雞蛋中含有的特異性IgY的量(約200mg)遠遠高於免疫I只兔所收集到的全部血清中的抗體量。IgY具有較強的耐酸、耐鹼、耐熱能力。高效卵黃抗體可以通過注射、拌餌投餵、浸泡等方式對水產動物起到保護劑疾病治療作用，還可用於免疫學檢測等領域。目前，卵黃抗體在畜牧業上已經得到較廣泛的關注和應用，如防治傳染性法氏囊病、禽流感、新城疫等疾病。但在水產行業的研究開發還處於基礎階段，目前在水產方面申請公開和授權的專利有抗對蝦病毒病、抗貝氏隱孢子蟲病、抗副溶血弧菌病以及抗嗜水氣單胞菌的卵黃抗體，但是，目前還沒有關於抗甲魚系統性敗血症球狀病毒卵黃抗體及其製備方法和應用的相關研究報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒(STSSSV)的卵黃抗體及其製備方法和應用，該卵黃抗體純度高，且對甲魚系統性敗血症球狀病毒有較強的抑制作用，其製備方法簡便易行，可用於STSSSV引起的疾病的預防和治療上及開發STSSSV檢測試劑盒和免疫學上的免疫反應及診斷。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為:一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體，採用甲魚系統性敗血症球狀病毒為抗原免疫產蛋母雞，從免疫雞蛋卵黃中提取得到所述的抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的雞卵黃抗體粗提物，純化後得到抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃 抗體純品。
一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的製備方法，包括以下步驟:
(O抗原製備
選取患病甲魚，取甲魚內臟置於預先冰浴過的TNE緩衝液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在4°C，6000g條件下離心IOmin後，取上清液在4°C，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液於4°C，35000g離心1.5h後獲取一次沉澱物，將一次沉澱物的沉澱上層疏鬆部分用TM緩衝液小心衝洗掉，沉澱下層白色部分重懸於Iml的TM緩衝液中，4°C冰浴過夜；次日將過夜處理的沉澱重新懸浮起來，4°C下3500g條件下離心5min後，取上清液於4°C，38000g條件下離心1.5h獲取二次沉澱物，將二次沉澱物的沉澱上層疏鬆部分小心去掉後，下層白色沉澱用少量TM緩衝液重懸後製成病毒懸浮液，即為甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原；
(2)動物免疫
將蛋雞進行I次基礎免疫和2 3次加強免疫，所述的基礎免疫為在步驟(I)得到的甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化後對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在步驟(I)得到的甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化後對蛋雞進行注射免疫，注射用量為每千克母雞注射500mg甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原，每次免疫間隔時間為15天，完成免疫後10天，開始收集雞蛋，於4 C冰箱保存；
(3)特異卵黃抗體的分離和純化將步驟(2)得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼並分離卵黃，吸取卵黃液，然後在卵黃液中加入卵黃液10倍體積的0.05 M的pH為5.0的乙酸-乙酸鈉緩衝液，混勻後於4 °C冰箱靜置過夜處理，將過夜處理後的混合液於4 0C，IOOOOg的條件下離心20 min後取上清液，在上清液中加入飽和的(NH4) 2S04使其終濃度為40%，4 °C靜置10h，再IOOOOg離心20 min後取沉澱，將沉澱用140g/L的Na2SO4稀釋至100 ml，再次於4°C靜置10 h後，10000 g離心20 min，沉澱用0.0lM的pH為7.2的PBS重懸，最後用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到甲魚系統性敗血症球狀病毒卵黃抗體。步驟(I)中所述的TNE緩衝液的pH為7.5，配製終濃度如下:50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，lmM苯甲基磺醯氟(PMSF)。步驟(I)中所述的TM緩衝液的pH為7.5，配製終濃度如下:50 mM Tris-HCl, 10mM MgCl2 ，ImM PMSF。 一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的應用，可應用於製備預防和治療因甲魚系統性敗血症球狀病毒引起的相關疾病的藥物、保健品或飼料添加劑，並可用於開發甲魚系統性敗血症球狀病毒檢測試劑盒和免疫學上的免疫反應及診斷。與現有技術相比，本發明的優點在於:本發明首次公開了一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體及其製備方法和應用，該方法製備得到的卵黃抗體純度較高，且對甲魚系統性敗血症球狀病毒有較強的抑制作用，同時高免卵黃的獲取廉價、方便，便於低成本、大批量生產，其製備方法簡便易行，最終獲得的高產、高效、高純度的卵黃抗體可用於由甲魚系統性敗血症球狀病毒引起的疾病的預防和治療上及開發甲魚系統性敗血症球狀病毒檢測試劑盒和免疫學上的免疫反應及診斷，經間接ELISA檢測本法製備的抗STSSSV卵黃抗體效價達10240，可用於STSSSV導致的疾病的防治。本發明首次提出了抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體及其製備方法和應用，填補了抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的相關研究的空白，並為以後的研究與應用奠定基礎。
上述甲魚系統性敗血症球狀病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemiaspherical virus，STSSSV)，毒株為 P1015 株，保藏號為 CGMCC N0.5378，於 2011 年 10 月 21日保藏在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。一、具體實施例
本發明一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體，採用甲魚系統性敗血症球狀病毒為抗原免疫產蛋母雞，從免疫雞蛋卵黃中提取得到抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的雞卵黃抗體粗提物，純化後得到抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體純品，具體過程如下:1、甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原的製備 選取患病甲魚，取甲魚內臟置於預先冰浴過的TNE緩衝液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在4°C，6000g條件下離心IOmin後，取上清液在4°C，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液於4°C，35000g離心1.5h後獲取一次沉澱物，將一次沉澱物的沉澱上層疏鬆部分用TM緩衝液小心衝洗掉，沉澱下層白色部分重懸於Iml的TM緩衝液中，4°C冰浴過夜；次日將過夜處理的沉澱重新懸浮起來，4°C下3500g條件下離心5min後，取上清液於4°C，38000g條件下離心1.5h獲取二次沉澱物，將二次沉澱物的沉澱上層疏鬆部分小心去掉後，下層白色沉澱用少量TM緩衝液重懸後製成病毒懸浮液，即為甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原，其中TNE緩衝液的pH為7.5，配製終濃度如下:50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl,5mM EDTA, ImM PMSF，TM緩衝液的pH為 7.5，配製終濃度如下:50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2，ImM PMSF。2、母雞的免疫
將蛋雞進行I次基礎免疫和2 3次加強免疫，所述的基礎免疫為在步驟(I)得到的甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化後對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在步驟(I)得到的甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化後對蛋雞進行注射免疫，注射用量為每千克母雞注射500mg甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原，每次免疫間隔時間為15天，完成免疫後10天，開始收集雞蛋，於4 C冰箱保存。3、抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的分離和純化
將步驟(2)得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼並分離卵黃，吸取卵黃液，然後在卵黃液中加入卵黃液10倍體積的0.05 M的pH為5.0的乙酸-乙酸鈉緩衝液，混勻後於4 °C冰箱靜置過夜處理，將過夜處理後的混合液於4 0C，IOOOOg的條件下離心20 min後取上清液，在上清液中加入飽和的(NH4) 2S04使其終濃度為40%，4 °C靜置10h，再IOOOOg離心20 min後取沉澱，將沉澱用140g/L的Na2SO4稀釋至100 ml，再次於4°C靜置10 h後，10000 g離心20 min，沉澱用0.0lM的pH為7.2的PBS重懸，最後用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到甲魚系統性敗血症球狀病毒卵黃抗體。二、抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的應用效果研究
本發明一種抗STSSSV卵黃抗體，通過製備STSSSV抗原免疫雞蛋，收集高免疫雞蛋進行分離和純化，保護實驗來確定應用效果，保護實驗方案及結果具體如下:1、雞胚水平的保護效果研究
(1)選取符合SPF標準的O日齡種蛋，氣室向上38°C孵化，相對溼度50%，每4小時翻蛋一次，培養4-6d後，選取血管粗大且呈鮮紅色的發育良好的雞胚在暗室內畫出氣室輪廓，並標明大血管所處位置，以備病毒接種用；
(2)選取患系統性敗血症的甲魚若干只，取甲魚內臟，加入質量體積比1:5的pH為7.4的TM緩衝液，於勻漿器中勻漿，將勻漿液於4°C，6000g離心20min後取含病毒的上清液，將離心所得的沉澱用1 2ml的TM緩衝液重懸，再次勻漿，將再次勻漿得到的勻漿液於40C，6000g,離心20min，合併兩次離心所得的上清液，將上清液先後用0.45 μπι,Ο.22 μ m的濾膜抽濾除去組織碎片，再用0.22 μ m的針式濾頭過濾除菌，除菌後的上清液每毫升加入1000IU青黴素和1000 μ g鏈黴素，於4°C冰浴過夜處理，即得到甲魚系統性敗血症球狀病毒液(STSSSV)；
(3)選取健康，發育良好的4 6日齡的雞胚，按表I將各組份注射到雞胚的卵黃囊內，每組10個。表1雞胚接種液處理及分組
權利要求
1.一種抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體，其特徵在於:採用甲魚系統性敗血症球狀病毒為抗原免疫產蛋母雞，從免疫雞蛋卵黃中提取得到所述的抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的雞卵黃抗體粗提物，純化後得到抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體純品O
2.—種權利要求1所述的抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的製備方法，其特徵在於包括以下步驟:(O抗原製備選取患病甲魚，取甲魚內臟置於預先冰浴過的TNE緩衝液中，勻漿直至完全碎裂，將勻漿液在4°C，6000g條件下離心IOmin後，取上清液在4°C，8000g條件下離心20min，取再次離心所得上清液於4°C，35000g離心1.5h後獲取一次沉澱物，將一次沉澱物的沉澱上層疏鬆部分用TM緩衝液小心衝洗掉，沉澱下層白色部分重懸於Iml的TM緩衝液中，4°C冰浴過夜；次日將過夜處理的沉澱重新懸浮起來，4°C下3500g條件下離心5min後，取上清液於4°C，38000g條件下離心1.5h獲取二次沉澱物，將二次沉澱物的沉澱上層疏鬆部分小心去掉後，下層白色沉澱用少量TM緩衝液重懸後製成病毒懸浮液，即為甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原；(2)動物免疫將蛋雞進行I次基礎免疫和2 3次加強免疫，所述的基礎免疫為在步驟(I)得到的甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐劑，充分乳化後對蛋雞進行注射免疫，所述的加強免疫為在步驟(I)得到的甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐劑，充分乳化後對蛋雞進行注射免疫，注射用量為每千克母雞注射500mg甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原，每次免疫間隔時間為15天，完成免疫後10天，開始收集雞蛋，於4 C冰箱保存； (3)特異卵黃抗體的分離和純化將步驟(2)得到的免疫雞蛋用酒精擦拭蛋殼並分離卵黃，吸取卵黃液，然後在卵黃液中加入卵黃液10倍體積的0.05 M的pH為5.0的乙酸-乙酸鈉緩衝液，混勻後於4 °C冰箱靜置過夜處理，將過夜處理後的混合液於4 0C，IOOOOg的條件下離心20 min後取上清液，在上清液中加入飽和的(NH4) 2S04使其終濃度為40%，4 °C靜置10h，再IOOOOg離心20 min後取沉澱，將沉澱用140g/L的Na2SO4稀釋至100 ml，再次於4°C靜置10 h後，10000 g離心20 min，沉澱用0.0lM的pH為7.2的PBS重懸，最後用截留量為100KD的透析袋透析除鹽得到甲魚系統性敗血症球狀病毒卵黃抗體。
3.根據權利要求2所述的抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的製備方法，其特徵在於步驟(I)中所述的TNE緩衝液的pH為7.5，配製終濃度如下:50 mM Tris-HCl，200mM NaCl, 5mM乙二胺四乙酸，ImM苯甲基磺醯氟。
4.根據權利要求2所述的抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的製備方法，其特徵在於步驟(I)中所述的TM緩衝液的pH為7.5，配製終濃度如下:50 mM Tris-HCl, 10 mMMgCl2 , ImM苯甲基磺醯氟。
5.—種權利要求1所述的抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的應用，其特徵在於應用於製備預防和治療因甲魚系統性敗血症球狀病毒引起的相關疾病的藥物、保健品或飼料添加劑，並可用於開發甲魚系統性敗血症球狀病毒檢測試劑盒和免疫學上的免疫反應及診斷。
全文摘要
本發明公開了抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體及其製備方法和應用，特點是採用甲魚系統性敗血症球狀病毒為抗原免疫產蛋母雞，從免疫雞蛋卵黃中提取得到特異雞卵黃抗體粗提物，純化後得到抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體純品，包括甲魚系統性敗血症球狀病毒抗原的製備步驟；蛋雞免疫和收集免疫雞蛋的步驟；最後分離和純化得到抗甲魚系統性敗血症球狀病毒的卵黃抗體的步驟，並應用於製備預防和治療因甲魚系統性敗血症球狀病毒引起的相關疾病的藥物、保健品或飼料添加劑，優點是該卵黃抗體純度較高，且對甲魚系統性敗血症球狀病毒有較強的抑制作用，同時高免卵黃的獲取廉價、方便，便於低成本、大批量生產，其製備方法簡便易行。
文檔編號C07K16/02GK103073640SQ20121010712
公開日2013年5月1日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者李登峰, 周永強, 劉聯國, 彭嬌, 陳炯 申請人:寧波大學