用於包裹光動力學療法治療劑的陶瓷納米微粒及其使用方法

2023-04-29 12:34:46

專利名稱：用於包裹光動力學療法治療劑的陶瓷納米微粒及其使用方法
技術領域：
總體上，本發明涉及光動力學療法領域，更具體說，涉及一種用於光動力學療法的新穎藥物運載體系統。
背景技術：
光動力學療法(PDT)是一個新出現的治療各種腫瘤、心血管、皮膚以及眼科疾病的治療方法[1，2]。癌症的光動力學療法依據光敏感物質或者光敏劑(PS)通過全身給藥而可優先定位於腫瘤組織的理念[2，3]。當用合適波長的可見光或近紅外光(NIR)照射光敏劑時，激活的分子將它們的能量傳導給周圍的氧分子，而導致活性氧物質(ROS)的產生，比如單態氧(1O2)或者自由基的產生。活性氧物質可氧化各種細胞膜，包括質膜、線粒體膜、溶酶體膜和核膜等，導致細胞不可逆性損傷[2-6]。在合適的條件下，光動力學療法具有的優點是，能有效地、有選擇性地破壞患病組織，而不損傷周圍健康組織[3]。
然而，大多數光敏感藥物(PS)是疏水性的，例如水溶性差，因而阻礙了將其製作成為胃腸道外注射藥物製劑[2-7]。為了克服該困難，發展了各種策略，通常藉助於輸送運載體，以促使這些藥物能夠穩定地分散在水相系統中。全身給藥時，摻有藥物的運載體由於『可滲透性和滯留效應的增強(EPR)』[2，8-10]更優先被腫瘤組織攝取。運載體包括油狀分散體(膠束)、脂質體、聚合膠束、親水性藥物-聚合體組合物等。採用非離子聚氧乙烯化蓖麻油(poloxyethylated castor oils)(比如吐溫-80，Cremophor-EL，CRM等)的油性物質劑型(膠束系統)顯示了增加的藥物攜帶能力及腫瘤攝取，推測是由於與血液中的胞質脂蛋白相互作用所致[11-13]。然而也據報導，這類乳化劑可在體內引起急性超敏反應[14，15]。脂質體是包裹有水性腔室的同心磷脂雙層，可包含親水性和親脂性藥物[2]。雖然藥物通過脂質體包裝後，腫瘤對其攝取優於簡單的水相分散體，但是脂質體的藥物負載量少和藥物在包裹狀態下自聚合增多[2，16-18]。脂質體也容易被調理然後被機體主要防禦系統(網狀內皮系統，RES)所捕獲[18]。最近，在體外摻入pH敏感性多聚膠束內部的藥物顯示出比CRM製劑增強的腫瘤光毒性作用，然而體內研究顯示腫瘤退縮少，而正常組織中的積聚卻有所增加[7，19，20]。
基於水合陶瓷的、摻入光敏藥物的納米微粒，為解決游離或聚合物包裝藥物相關問題提供了光明前景。這種陶瓷微粒相對於有機多聚物微粒聚有許多優點。首先，其製備過程與眾所周知的溶膠製備過程非常相似，只需要簡單的和室溫條件[21，22]。這些微粒可被製成需要的大小、形狀和多孔性，並且極其穩定[22]。它們極小的尺寸(50nm以下)可以幫助它們逃避網狀內皮系統(RES)的捕獲。並且，在pH值變化時，它們不會膨脹或改變其多孔性；同時，這些微粒不易受到微生物侵襲[23]。這些微粒也能有效地保護摻入其中的分子(酶、藥物等)抵制極端pH值和溫度所引起的變性[24]。也知曉這些微粒如二氧化矽、氧化鋁、二氧化鈦等與生物系統具有相容性[24，25，26]。而且，它們的表面易於用不同的基團功能化[26，27]，因此，它們可以連接各種單克隆抗體和其它配體以使它們能靶向體內需要的部位。
雖然文獻中廣泛報導的陶瓷納米微粒的合成，大多數而非全部以二氧化矽為基礎[28-30]，但是它們在藥物輸送方面的應用仍然沒有完全開發。因此，現時仍需要開發新的光動力學療法的藥物輸送系統。
發明概述本發明提供了用於光動力學療法的組合物和方法。本發明的組合物包含包裹(entrapped)有一種或多種治療劑的陶瓷納米微粒。
本發明還提供合成包裹有一種或多種治療劑的陶瓷納米微粒的方法。當用本發明的方法合成時，發現這些微粒呈球形並具有高度均勻分散性。
在一個實施例中，本發明提供了合成摻有光敏劑染料/藥物的二氧化矽納米微粒的方法(直徑～30nm)，該方法是可控性鹼水解膠束介質中的陶瓷物質(如三乙氧基乙烯基矽烷(VTES)。
在一個實施例中，所用的光敏感染料/藥物2-脫乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脫鎂葉綠甲酯一酸(HPPH)，是一種有效的光敏劑，其在Roswell園區癌症研究所(美國紐約州布法羅市)已經進入臨床I/II期試驗[32，33]。雖然該微粒基質並不幹擾所包裹的光敏藥物的可見光吸收光譜，但是該藥物在水相介質中，其螢光淬滅大部分被抑制。單態氧檢測實驗揭示該包裹的光敏劑能夠與周圍分子氧相互作用，產生的單態氧能夠穿出二氧化矽基質。這種摻入藥物的微粒能被腫瘤細胞主動攝入，然後用合適波長的光照射導致那些攝入這種微粒的細胞不可逆轉性破壞。因此，本發明的陶瓷微粒可以用作光動力學療法藥物的運載體。
附圖的簡要說明

圖1是摻入HPPH的二氧化矽納米微粒的透射電鏡照片說明，顯示出高度均一分散的微粒，平均直徑為30納米。
圖2是在膠束介質中合成和純化摻入HPPH的二氧化矽納米微粒的示意圖。
圖3是(a)溶於AOT/BuOH/水膠束中的HPPH，(b)摻入二氧化矽納米微粒中的HPPH和(c)空的二氧化矽納米微粒的紫外-可見光吸收光譜圖。
圖4是(a)透析前溶於AOT/BuOH/水膠束中的HPPH，(b)透析前摻入二氧化矽納米微粒中的HPPH、(c)透析後溶於AOT/BuOH/水膠束中的HPPH和(d)透析後摻入二氧化矽納米微粒中的HPPH的發射光譜圖，激發光波長414nm。
圖5是在1270nm波長照射下，(a)溶於AOT/BuOH/D2O膠束中的HPPH(實線)，(b)分散於D2O中摻入二氧化矽納米微粒中的HPPH和(c)分散於D2O中的空二氧化矽納米微粒所產生的單態氧磷光發射光譜圖。
圖6是由光照射時，(a)溶於AOT/BuOH/D2O膠束中的HPPH，(b)分散於D2O中摻入二氧化矽納米微粒中的HPPH和(c)分散於D2O中的空二氧化矽納米微粒所產生的單態氧的時間依賴地漂去染料ADPA(最大波長400nm)的圖示。
圖7是用摻入HPPH的納米微粒處理的單個腫瘤細胞(KB)的雙光子共聚焦螢光圖像，插圖是受處理細胞的胞質局部螢光光譜圖。
圖8是用MTT法測定的UCI-107細胞存活率的圖示發明詳述本發明提供了包裹有一種或多種治療劑的陶瓷納米微粒。本發明也提供合成和使用裝載有一種或多種治療劑的陶瓷微粒的方法。術語「納米微粒」本文用於指直徑在100nm或更小的微粒。
本發明的陶瓷納米微粒可用於光動力學療法將治療劑，例如光敏感的藥物或染料，傳送給細胞。例如這些藥物可以是疏水性和親水性的。
在一個實施例中，本發明使用的二氧化矽微粒是有機方法修飾的裝載有疏水性光敏感(本文也稱為光敏劑)藥物的矽酸鹽(ORMOSIL)納米微粒。為了製備該納米微粒，將光敏劑包裹到溶解於烷氧基-有機矽(例如三乙氧基乙烯基矽烷)的雙(2-乙基己基)硫代琥珀酸鈉(AOT)/1-丁醇/水膠束的非極性核心，然後在溫和條件下(例如用氨水、銨類化合物或者含胺的化合物)鹼水解(如室溫攪拌24小時)沉澱。透析沉澱物質，去除表面活性劑，可以延長透析時間(如50小時)，表明包裹的物質在長時間內具有穩定的分散度。
ORMOSIL納米微粒與其它納米微粒相比主要優點在於在合適的條件下，在前體烷氧基-有機矽中存在的疏水和親水基團幫助它們自身聚集成為正向膠束和反向膠束。產生的膠束(和反向膠束)核心可以用來包裹生物分子，例如藥物、蛋白等。這種系統具有許多優點，包括(a)它們可以裝載疏水性和親水性染料，(b)它們可以在水包油微乳液中沉澱，從而可避免採用腐於蝕性溶劑如環己烷，和複雜的純化步驟如溶劑蒸發、超速離心等。(c)可以進一步修飾它們的有機基團，以便與靶分子連接。(d)它們可通過生化分解矽-碳鍵而生物降解。有機基團的存在也減少此微粒的整體剛性和密度，預計這可增加該微粒在水相系統中的穩定性而不沉澱。
該球狀、均勻分散的矽膠微粒可以通過四烷基甲矽烷的水解方便地製備。該方法通常稱為「溶膠(sol-gel)」方法，可以進一步延伸有機修飾二氧化矽(ORMOSIL)微粒的合成，其中前體烷氧基矽烷分子也包含有一或兩個有機基團。摻入有機基團修飾了該二氧化矽網絡的最終結構，例如導致多孔基質的形成，其特徵是形成了有序而均勻的多孔性網絡結構。這些多孔性基質可以容納各種光學和生物學活性分子，如螢光染料、蛋白、抗癌藥物、成像對比劑等。
關於本發明的陶瓷微粒的使用，載有藥物的微粒可以局部或者全身給藥。局部給藥可以通過例如在靶組織附近或腫瘤內注射含有裝載藥物/染料微粒的混合物，而發揮作用。在局部治療表面腫瘤時，該納米微粒可摻入到標準的外用組合物，包括洗液、懸液或軟膏中局部應用。全身給藥可以通過靜脈、皮下、肌肉內、腹膜內或直腸途徑進行。這些給藥方法的劑型是該領域公知的；示範性的劑型，例如見雷明頓藥理科學(Easton，Pa.；Mack出版公司)中的描述。
包裹有藥物/染料的納米微粒可以用適合所需用途的合適劑型的組合物給藥；比如口服、胃腸道外給藥或者局部給藥。口服用的合適劑型懸浮液、分散液、乳液製成的片劑、可分散粉劑、粒劑、膠囊、糖漿和酏劑。片劑的惰性稀釋液和載體包括例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖和滑石粉。片劑也可以包含成粒劑和崩解劑，如澱粉和褐藻酸；粘合劑，如澱粉、明膠和阿拉伯膠和潤滑劑如硬脂酸鎂、硬脂酸和滑石粉。片劑也可以通過已知的技術無糖衣或者包糖衣，以延遲其崩解和吸收。可以在膠囊中使用的惰性稀釋劑和載體包括，例如碳酸鈣、磷酸鈣和瓷土。懸液、糖漿和酏劑可以包含常規賦形劑，如甲基纖維素、黃芪膠、海藻酸鈉；潤溼劑，如卵磷脂和聚氧乙烯硬脂酸酯；和防腐劑，如對乙基-羥基安息香酸鹽。適合胃腸道外給藥的劑型包括陶瓷納米微粒懸浮液、分散液、乳化液等。
通常情況下，陶瓷微粒是高度穩定的，並且即使在極端pH值和溫度條件下也不會釋放所包封的任何生物分子[24]。常規藥物輸送方法需要運載體釋放出所封裝的藥物以產生適當的生物學反應[3]。然而在光動力學療法中採用大分子載體來輸送光敏感藥物時，不需要這樣[3，31]。本發明中，我們開發了陶瓷納米微粒，作為用於光動力學療法中的光敏感藥物運載體。該納米微粒的多孔基質對於氧分子和活性氧物質(單態氧和自由基)是可以穿透的，故該納米微粒不必釋放任何有意義數量的包裹藥物進入水相環境。因此，即使在包裹形式下也可以保持所需要的光破壞效應。
採用本發明的方法，可以在膠束介質中合成包裹有水不溶性光敏抗癌藥物，如HPPH的二氧化矽納米微粒。可將包有藥物的30nm單峰大小分布的微粒製成穩定的水相分散劑。雖然藥物包裹在微粒基質中，但可以被合適波長的光照射活化，產生的單態氧可以從微粒基質中擴散出去。此包裹藥物的納米微粒被腫瘤細胞主動攝入，用光照射攝入的細胞可導致顯著的細胞死亡。這些觀察結果證明，各種陶瓷性基質可用作光動力學療法的藥物運載體。本發明中的微粒可用作體內安全而有效的輸送至腫瘤組織的注射製劑。
在一個實施例中，可將特異性靶向腫瘤的配體連接於該陶瓷納米微粒的表面。近來，我們小組已經合成了包裹有一個磁性核心的二氧化矽納米微粒[39]。這些微粒借用一種多肽激素靶向物質(促黃體素釋放激素(LH-RH))而功能化。結果顯示，產生的「nanoclinic」能選擇性靶向含有LH-RH受體的腫瘤細胞。然後使腫瘤細胞暴露在DC磁場中，只選擇性導致該受體陽性細胞發生磁性細胞溶解(美國專利號6,514,481，納入本文作參考)。因此，本發明納米微粒的陶瓷表面可用不同配體功能化，以使該微粒能靶向含有這些配體特異性受體的腫瘤細胞。
本發明進一步通過下面陳述的實施例進行描述，這是為了闡述本發明，而不是以任何方式限制本發明。
實施例1本實施例描述了載有藥物的二氧化矽納米微粒的製備。為了說明本實施例，合成了載有HPPH的二氧化矽微粒。表面活性劑氣溶膠0T(AOT，98％)、輔助表面活性劑n-丁醇複合物(99.8％)和三乙氧基乙烯基矽烷(VTES，97％)購自Aldrich。MTT和異丙醇是Sigma的產品。氧化氘(99.9％原子比例)由美國Isotec公司獲得。染料/藥物HPPH 2-脫乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脫鎂葉綠甲酯一酸[38]由美國紐約州布法羅市Roswell園區癌症研究所的Tom Dougherty博士饋贈。染料二丙基蒽酸二鈉鹽(ADPA)購自美國Molecular Probes公司。細胞培養產品，如MEM-alpha培養基，5％胎牛血清(FBS)，磷酸鹽緩衝液(PBS)等，均購自美國GIBCO公司。所有上述化學品使用時並不作進一步純化。
空的和載有藥物的納米微粒，都在AOT/n-丁醇/水膠束的非極性中心合成，合成方案如圖2所示。將0.44克AOT和800微升(O.56克)n-丁醇溶於20毫升雙蒸水中強烈磁力攪拌成膠束。在產生的澄清溶液中加入40微升溶有HPPH的DMF(15mM)和10微升純DMF，磁力攪拌溶解(製備空微粒時，加入50微升DMF而不加入HPPH)，然後向此膠束系統加入200微升純三乙氧基乙烯基矽烷(VTES)，混合攪拌一小時左右，或者攪拌至溶液澄清為止。然後，向次系統中加入10微升氨水(10M)溶液，攪拌大約20小時。整個反應過程在室溫下進行。此步驟結束時，觀察到藍白色透明液體的產生，表明納米微粒已形成。在摻入藥物的納米微粒形成以後，通過截留值12-14kD的纖維素膜(購自美國Spectrum Laboratories公司)用水透析40小時完全除去表面活性劑AOT和輔助表面活性劑-n-丁醇。然後使透析溶液通過0.2微米濾膜(美國Nalgene公司)過濾，用於後續實驗。
採用透射電鏡(TEM)測定所產生的納米微粒水分散劑的形態和大小，使用JEOL JEM 2020電子顯微鏡，操作時的加速電壓為200千伏。結果見圖1所示載有藥物的納米微粒的透射電鏡(TEM)照片。該微粒呈球形，單峰大小分布，平均大小為30納米(用上述方案製備的產物)。
實施例2本實施例證明被包裹藥物的發射譜特徵與非包裹藥物相同。為了說明本實施例，將包裹有藥物的二氧化矽微粒和游離藥物的紫外-可見光吸收光譜均用Shimadzu UV-3101電腦分光光度計作記錄，使用1釐米厚石英玻璃杯；螢光光譜用Shimadzu RF 5000U分光螢光光度計記錄，使用1釐米厚石英玻璃杯。在AOT/BuOH/水膠束中的與包裹在納米微粒內的HPPH的紫外-可見光吸收光譜顯示了二者相同的峰位置(圖3)。這證明HPPH包裹在納米微粒內並不引起峰位置的變化。採用空納米微粒的對照實驗表明，其在可見光和近紅外波長區域內，並沒有實質上的吸收，此波長區域因為光的組織透過率高，正是光動力學療法中關心的區域(治療區域)。因此，這種微粒可有效用於光動力學療法，因為它們不幹擾用於激發光敏感藥物的治療光線。
圖4代表了AOT/BuOH/水膠束中的和包裹在納米微粒中的HPPH的螢光發射光譜。記錄了雙蒸水透析(有效去除所用的表面活性劑和輔助性表面活性劑分子)前後兩個樣品在414納米激發波長下的光譜。雖然透析前，膠束中的或納米微粒中的HPPH的發射光譜幾乎相同，但透析後，可觀察到二者之間的實質性區別。雖然透析後，載有HPPH的納米微粒的發射光強度仍顯著(為透析前的大約75％的強度)，但實際上，透析後未能檢測到HPPH/膠束的發射光。這可用如下事實解釋，即HPPH作為一種非極性分子，在極性溶劑中可發生凝聚，因此造成其螢光自我淬滅。只要HPPH分子處於膠束的非極性核心中，它們可以保持彼此分離，但是隨著表面活性劑的去除，這些分子逐漸與周圍水相接觸，從而開始凝聚。但是在納米微粒中摻入HPPH的情況下，可以看到藥物分子分散地包埋在微粒基質中(如圖1)，因此接觸水相系統時不會導致其凝聚和明顯的喪失發射光強度。可利用包裹藥物/染料在水相介質中抵制自我淬滅的這種性能來製作生物系統成像用的微探針。
實施例3本實施例通過磷光光譜檢測證明了包裹藥物能產生單態氧。已廣泛報導了單態氧(1O2)可以通過其在1270納米處的磷光發射光譜[34，35]檢測到。因為1O2在水中的生命周期非常短(2-5微秒)，因此通過上述方法檢測非常困難。我們採用了氧化氘(D2O)，因為1O2在這種溶劑中具有更長的生命周期(50-60微秒)[36]。在一個典型實驗中，將3毫升22.5μM的HPPH，包裹在分散於D2O中的納米微粒中。分別採用溶解在AOT/BuOH/D2O膠束中的HPPH和分散在D2O中的空納米微粒作為陽性和陰性對照。用裝有In-Ga-As光探頭(美國Electro-Optical System公司)的SPEX 270M分光光度計(Jobin Yvon)來記錄單態氧磷光發射光譜。採用固態晶體二極體驅動的雷射器(Verdi，Coherent)作為激發光源(532納米)。將裝有樣品溶液的1釐米厚的方石英杯直接放在分光光度計入射光狹縫前端，收集與激發雷射束呈90度的石英杯側面發出的發射信號。在光探頭之前還放置了另一NIR長波邊緣過濾器(美國Andover公司)也被放。
結果證明，因為陶瓷基質通常是多孔的，包裹在其中的光敏感藥物可以與通過這些孔洞擴散進來的氧分子相互作用。氧分子與受激發光敏劑相互作用而產生的任何活性氧物質(ROS)，將從該多孔基質中擴散出去，進入周圍環境而被檢測到，我們通過產生的1270納米磷光光譜研究了單態氧的產生，該單態氧是HPPH產生的活性氧物質ROS。圖5顯示了溶解在膠束中的和包裹在納米微粒中的HPPH的光譜。二光譜均顯示在1270納米處有波峰，表明在兩種情況都產生了單態氧。用空的納米微粒得到對照光譜不顯示此磷光波峰。這證明包裹狀態的光敏化HPPH確實產生了單態氧，該單態氧可以通過陶瓷基質的孔洞擴散出來，與周圍環境相互作用。
實施例4本實施例證明通過化學方法採用二丙基蒽酸二鈉鹽(ADPA)檢測到被包裹藥物所產生的單態氧。除磷光光譜分析外，單態氧的產生也可以用化學方法檢測，採用ADPA(9，10-二丙基蒽酸)的二鈉鹽作為單態氧傳感器[36]。ADPA的二鈉鹽(一種水溶性的蒽衍生物)與單態氧反應後被漂白成其相應的內過氧化物，之後用分光光度法記錄為400納米處(ADPA的λmax)光密度下降。在一個典型實驗中，將150微升ADPA二鈉鹽的D2O溶液(5.5mM)與3毫升15μM的HPPH(溶解於AOT/D2O膠束中，以及包裹在納米微粒中分散於D2O)混合，裝在1釐米厚的石英玻璃杯中。對照實驗用ADPA二鈉鹽與空的納米微粒混合分散於D2O中進行。產生的溶液用650納米雷射源(固態晶體二極體驅動的雷射器)照射，每10分鐘由分光光度計記錄它們的光密度。
圖6顯示了時間依賴的ADPA的漂白，通過觀測其與不同樣品孵育及光照射後400納米處(ADPA的最大吸收)光密度(OD)的下降得到該結果。溶解在膠束中的和摻入納米微粒中的HPPH的曲線，顯示了隨著光照時間延長OD值迅速降低，表明在兩種情況下都產生了大量的單態氧。與ADPA共孵育的空納米微粒的曲線則沒顯示任何OD值隨時間的下降，表明ADPA的漂白是因為產生了單態氧而非光照所致。
實施例5本實施例證明包裹有光敏劑藥物/染料的二氧化矽納米微粒可以被細胞攝取。為了研究納米微粒的攝取，使用了KB細胞系(人口腔上皮癌細胞)。細胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中37℃(含有5％CO2的潮溼環境)培養。在60×15毫米組織培養板中，將3毫升培養基培養的單層細胞與100微升摻入有HPPH(15μM)的納米微粒的水相分散液共孵育1小時。用無菌磷酸鹽緩衝液(PBS)衝洗細胞後，在雷射共聚焦掃描顯微鏡下直接觀察。
已經確定了摻入有HPPH的納米微粒會產生細胞毒性單態氧分子後，我們通過螢光成像技術檢測了腫瘤細胞對此種摻入有藥物的納米微粒的攝取。腫瘤細胞(KB)的雙光子螢光圖像(圖7A)顯示了胞質和胞膜上有顯著染色，表明納米微粒聚集在這些區域。圖7B是胞質的定位光譜，顯示了HPPH的特徵性發射峰(665納米)，此峰有效地將HPPH螢光與這些細胞的自發螢光分離開來。處理後的細胞活力通過其形態得到驗證，表明即使在染色10小時後，細胞仍然存活。
實施例6本實施例證明本發明的二氧化矽納米微粒可以被用於光動力學療法。作為闡述，研究了攝取了載有藥物的二氧化矽納米微粒的細胞，給予或不給予光照射後的細胞活力。採用UCI-107(美國歐文，加利福尼亞大學)腫瘤細胞系來研究細胞活力。將細胞在含有5％胎牛血清(FBS)的MEM alpha培養基中37℃(含有5％CO2的潮溼環境)培養。實驗之前，接種細胞於24孔板(7.5×105細胞/孔)並培養過夜。除去培養基後，用無菌PBS衝洗細胞3次。仔細衝洗後，向各孔中加入2毫升新鮮培養基。預先通過光密度測定確定藥物濃度，例如將(a)20μM HPPH溶於120微升0.25％吐溫-80/水膠束中，(b)20μM HPPH包裹在120微升納米微粒的水相分散溶液，(c)120微升0.25％吐溫-80/水膠束和(d)120微升空納米微粒的水相分散溶液，此時加入到標定的諸孔中，將培養板送回培養箱培養2小時。用無菌PBS衝洗培養孔3次，再用2毫升/孔體積的新鮮培養基代替。加入新鮮培養基後，立刻將諸孔置於650納米光源(用固態晶體二極體驅動的雷射器)下照射，每孔照射10分鐘。在光源照射完成後，將培養板送回培養箱培養過夜。細胞活力通過比色的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)試驗檢測[37]。MTT方法只檢測有活力的活細胞，發現570納米處的吸光度值與細胞數成直接比例。簡單地說，將MTT溶解在無菌PBS中，濃度5毫克/毫升。每個培養孔中加入200微升此溶液。然後，培養板在37℃，5％CO2環境中培養4小時。培養後，小心吸除諸孔中含有MTT的培養基。每孔中加入2毫升0.1N鹽酸的無水異丙醇溶液，以溶解形成的紫色MTT甲臢晶體。使用Bausch Lomb Spectronic 601分光光度計測定產生的紫色溶液在570納米處的吸光度值。只與含有血清的培養基共孵育的對照細胞的平均吸光度值代表細胞存活為100％。每種藥物和光照劑量都做四復孔，每個實驗重複三次。
圖8中的結果顯示了用不同藥劑(純培養基作為對照)處理的UCI-107腫瘤細胞隨後經光激活後的細胞存活率。在吐溫-80膠束中的HPPH和摻入納米微粒的HPPH處理後都觀測到了明顯的細胞死亡，前者細胞存活率大約為7％，後者大約為11％。此外，觀察到空的吐溫-80膠束有實質性的細胞毒性，而通常認為吐溫-80是一種幾乎無毒性的表面活性劑；而空的納米微粒幾乎沒有毒性。總的來說可得出如下結論作為藥物/運載體系統，將HPPH摻入納米微粒中或溶解於吐溫-80膠束中，對於殺傷腫瘤細胞幾乎具有相同的效率。
實施例7本實施例描述了本發明的納米微粒在動物中的應用情況。向負荷有人腫瘤的雌性SCID小鼠腹腔注射載有HPPH的納米微粒(每克體重1014微粒)。注射之後，動物單只培養在絕對黑暗的條件下24小時。用每100克體重5.5微克芬太奴和5.5毫克美託咪酯的鹽酸鹽(溶於0.9％NaCl)(德國Sulzbach JanssenCilag公司)麻醉小鼠，在光照射前剪去鼠毛。使腫瘤暴露於532納米、功率為50毫瓦的雷射下2分鐘，以達到30J/cm2的總照射劑量(環境溫度25℃)。光照射也可以經由光纖傳輸系統傳導。不經過光照射的動物腫瘤作為對照。腫瘤反應的評價可通過腫瘤大小的變化以及組織學形態變化來確定。根據本文提供的說明，該納米微粒可用於其它個體的光動力學療法(PDT)，包括人類。
雖然本發明通過本文提供的實施例得到證明，但是該領域技術人員知道可在不同實施方案中對實施路線作出修改，這些修改應包括在說明書與權利要求書所描述的本發明的範圍之內。
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權利要求
1.一種製備攜帶有一種或多種光敏感藥物的陶瓷納米微粒的方法，其特徵在於，該方法包括下述步驟a)製備包裹有光敏感藥物的膠束；b)在該膠束中加入烷氧基有機矽烷，以形成二氧化矽和膠束的複合物；c)將該二氧化矽和膠束的複合物鹼水解以沉澱包裹有光敏感藥物分子的二氧化矽納米微粒；和d)通過透析分離得到沉澱的納米微粒。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述烷氧基有機矽烷是三乙氧基乙烯基矽烷。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述膠束包括AOT和1-丁醇。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述鹼水解用氨水進行。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述鹼水解用銨化合物進行。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述光敏感藥物是2-脫乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脫鎂葉綠甲酯一酸。
7.一種包含陶瓷納米微粒的組合物，其特徵在於，通過下述步驟在所述複合物內包裹了一種或多種光敏感藥物a)製備包裹有光敏感藥物的膠束；b)在該膠束中加入烷氧基有機矽烷，以形成二氧化矽和膠束的組合物；c)將該二氧化矽和膠束的組合物鹼水解以沉澱包裹有光敏感藥物分子的二氧化矽納米微粒；和d)通過透析分離得到沉澱的納米微粒。
8.如權利要求7所述的組合物，其特徵在於，所述藥物是2-脫乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脫鎂葉綠甲酯一酸。
9.如權利要求7所述的組合物，其特徵在於，該組合物還包含藥學上可接受的運載體。
10.如權利要求7所述的組合物，其特徵在於，所述鹼水解用氨水或者銨化合物進行。
11.如權利要求7所述的組合物，其特徵在於，所述陶瓷納米微粒的大小顯示出單峰分布特徵，平均大小為直徑30納米左右。
12.一種抑制細胞生長的方法，其特徵在於，該方法包括下述步驟a)將包含權利要求1所述方法製成的包裹有一種或多種光敏感藥物的陶瓷納米微粒的組合物輸送給細胞，讓該納米微粒被細胞攝入；和b)將細胞暴露在光照射下，所述的暴露於光照射下導致活性氧物質的產生，而所述活性氧物質抑制該細胞生長。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述活性氧物質包括單態氧。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述光敏感藥物是2-脫乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脫鎂葉綠甲酯一酸。
15.一種減少個體內腫瘤生長的方法，其特徵在於，該方法包括下述步驟a)給於需要治療的個體一種組合物，該組合物包含由權利要求1所述方法製成的包裹有一種或多種光敏感藥物的陶瓷納米微粒；b)讓該陶瓷納米微粒被腫瘤細胞攝取；並且c)用輻射照射腫瘤所在的區域，導致光敏感藥物產生活性氧物質，其中所產生的活性氧物質將導致腫瘤生長的減少。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述光敏感藥物是2-脫乙烯基-2-(1-己基氧乙基)焦脫鎂葉綠甲酯一酸。
17.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述組合物包含有藥學上可接受的運載體。
18.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述組合物可局部給藥或全身給藥。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，局部給藥是腫瘤內注射。
20.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述活性氧物質包括單態氧。
全文摘要
本發明提供了用於光動力學療法的方法和組合物。該組合物由包裹有光敏感的藥物/染料的陶瓷納米微粒組成。該陶瓷微粒通過形成染料的膠束組合物而製備得到。將陶瓷材料加入膠束組合物，通過鹼水解沉澱陶瓷納米微粒。沉澱的、其中包裹有光敏感藥物/染料的納米微粒可通過透析分離獲得。產生的摻有藥物的納米微粒在水相系統中呈球狀、高度均勻分散和穩定。用合適波長的光照射該內部包裹有光敏感藥物的納米微粒產生單態氧，其可從陶瓷基質的孔洞中擴散出來。本發明攜帶藥物的陶瓷納米微粒可用作光動力學療法的藥物運載體。
文檔編號A61K9/50GK1741788SQ200480002718
公開日2006年3月1日 申請日期2004年1月26日 優先權日2003年1月24日
發明者P·N·普拉薩德, I·羅伊, E·J·伯吉, T·Y·奧爾佔斯基, H·普達瓦 申請人:紐約州立大學研究基金會