戊型肝炎病毒抗體以及利用所述抗體檢測戊型肝炎病毒的方法和試劑盒的製作方法

2023-04-29 16:52:31

專利名稱：戊型肝炎病毒抗體以及利用所述抗體檢測戊型肝炎病毒的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種針對HEV ORF2抗原的單克隆抗體，以及使用競爭ELISA與所述單克隆抗體的抑制率小於50％，優選的小於25％的單克隆抗體。本發明還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種前述單克隆抗體；一種使用雙抗體夾心ELISA方法檢測HEV抗原的試劑盒，其含有前述抗體組合物；以及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測樣品中HEV抗原的體外方法。本發明還涉及所述抗體組合物用於檢測HEV抗原的用途。
背景技術：
戊型肝炎病毒(HEV)為腸道傳播非甲非B型肝炎(EntericallyTransmitted non-A，non-B hepatitis，ET-NANBH)的主要病原體。過去認為，戊型肝炎主要流行於非洲和亞洲等不發達地區，隨著近年來對戊型肝炎病毒(HEV)研究的深入以及相關檢測手段的完善，在歐洲、美國和日本越來越多的非輸入性HE病例見諸報導，HEV的流行情況遠比先前想像的嚴重，因此HEV病毒的檢測工作越來越得到重視。
流行病學研究表明，從感染HEV到出現臨床症狀的時間在15-60天左右，病程持續時間1-6周。而在實驗感染中，志願者感染HEV後大約36天出現臨床症狀。
現有的戊型肝炎病原學檢測主要有以下幾種方法1.免疫學檢測免疫學檢測方法針對抗HEV抗體，主要採用酶聯免疫檢測方法，檢測血清中的抗HEV IgM、IgA和IgG抗體。
由於HEV抗體的不同型別對於HEV感染的檢測具有不同的意義，故HEV抗體檢測試劑需要針對抗HEV的不同型別抗體分別進行檢測。目前的HEV IgG檢測試劑採用間接法，這種方法特異性不高，而且抗HEV IgG抗體在感染後持續時間很長，因此，僅僅檢測IgG抗體不能有效的區分既往感染、近期感染和急性感染。此外，抗HEV IgG抗體在非流行地區陽性率為1-5％，但在HEV流行地區25歲以上人群中陽性率可達40％，對戊型肝炎急性感染的診斷存在一定的幹擾作用，IgM抗體作為急性感染和/或近期感染的標誌，具有比IgG更高的診斷價值。IgM抗體作為感染後最早出現的抗體，存在親和力和特異性低的缺點，IgM抗體的這種特性決定了HEV IgM抗體檢測試劑存在敏感性和特異性都較低的缺點。
而且目前的IgM檢測試劑多採用間接法或捕獲法，Yu et al建立的捕獲法的靈敏度高於經典間接法，但人體內IgM-類風溼因子和抗HEV IgG的同時存在可能引起假陽性，因為IgM-類風溼因子可以和抗HEV IgG的Fc段橋聯，通過對樣品進行稀釋來提高試劑的特異性，但這樣做的同時又降低了試劑的敏感性。
Chau et al認為，IgA抗體也可以作為HEV近期或急性感染的標誌抗體，雖然IgA抗體陽性持續時間與在HEV感染診斷中的意義還有待臨床和流行病學研究的進一步證實。
目前，國際上公認的HEV抗體ELISA檢測試劑為Genelab公司和Abott公司的HEV抗體檢測試劑盒，它們均採用HEV 1型和2型抗原為檢測抗原。
2.分子生物學檢測分子生物學檢測是指使用RT-PCR方法檢測血清、糞便和組織等樣本中的HEV病毒基因組RNA。然而，作為腸道傳播病毒，HEV病毒血症持續時間很短，許多病人就醫時已度過病毒血症期或已接近末期，血液中的病毒RNA拷貝數很低，難以通過RT-PCR檢出，這種情況在醫藥衛生條件不發達的發展中國家尤其突出。糞便排毒雖然持續時間略長於病毒血症，但樣品採集困難，易受汙染且糞便中可能存在影響PCR的物質。目前報導的RT-PCR在HE病人中檢出的陽性率存在很大的差別，從30％至80％不等，這可能與樣品採集時間、樣品保存情況、引物匹配、PCR條件和其它不確定因素有關。因此，目前檢測HEV RNA的RT-PCR診斷方法僅用於實驗室研究，還沒有商品化的試劑被臨床採用。
已知HEV在感染機體後進行複製，產生足夠量病毒後可引起肝組織的損傷，臨床上表現為肝炎症狀，實驗室檢測則會顯示相關酶類呈異常反應，為顯性感染；有些感染者機體內雖也有病毒的複製，但沒有引起典型的臨床症狀，為隱性感染。無論是顯性還是陰性感染，在感染的早期機體內均存在HEV，如果檢測手段足夠靈敏，在此期間可檢出HEV的核酸和抗原。隨著感染過程的進展，病毒可誘發機體產生免疫反應，首先誘導感染者產生抗HEV IgM抗體，並持續一定時間，在IgM產生以後IgG也會隨著產生，並持續較長的時間，同時也會產生IgA抗體。隨著抗體的產生，機體內病毒的滴度也會逐步降低，最後徹底清除。檢測IgM抗體以及IgG抗體的動態變化可以診斷HEV的急性感染，但在抗體產生以前，HEV的病毒核酸和抗原就已經存在，因此檢測HEV病毒核酸和抗原可達到更早期診斷的目的。
目前有些實驗室已發展了HEV核酸檢測技術，但其操作繁雜、技術要求高、容易汙染、成本較高等缺點限制了其廣泛應用。如果開發研製技術要求比較低的抗原檢測方法，將會為HEV感染的早期診斷提供很重要的工具。
為了及時準確檢測HEV感染，長期以來一直迫切需要更為靈敏和準確的快速檢測方法。為了解決上述問題，本發明人通過採用HEV ORF2作為抗原免疫小鼠，篩選針對所述HEV抗原的單克隆抗體，獲得了能夠以高靈敏度直接檢測樣品中存在的微量HEV抗原的試劑盒，從而實現了在HEV感染早期進行準確檢測。
發明概述本發明一方面，涉及一種針對HEV ORF2抗原的單克隆抗體。
本發明的另一方面還涉及使用競爭ELISA與本發明所述單克隆抗體的抑制率小於50％，優選的小於25％的單克隆抗體。。
本發明的另一方面，還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種前述單克隆抗體。
本發明的再一方面，涉及一種用於雙抗體夾心ELISA方法檢測HEV抗原的試劑盒，其中含有前述抗體組合物。
本發明的又一方面，涉及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測樣品中HEV抗原的體外方法。
本發明還涉及所述抗體組合物用於檢測HEV抗原的用途。
發明詳述現已確認的HEV基因組共存在3個開放讀碼框(ORF 1-3)。ORF1(約28-5106nt)編碼HEV病毒最大的蛋白，該蛋白約186kDa，包括至少4個結構區。到目前為止只有很少實驗室能夠表達完整的ORF1蛋白，分段表達的ORF1蛋白多應用於功能學研究，目前ORF1片段僅在HEV抗體Western印跡檢測試劑中應用，ELISA檢測試劑中很少使用。
ORF2基因長1980bp(約5147nt-7126nt)，編碼分子量約為72kDa的病毒衣殼蛋白。ORF2蛋白有一個111胺基酸的信號序列和三個可能用於分泌表達的潛在的糖基化位點。在HEV感染中抗ORF2蛋白抗體具有重要意義，雖然HEV的感染機理仍未闡明，但作為HEV衣殼蛋白的ORF2蛋白在感染過程中很可能扮演著與宿主細胞膜上的受體結合併誘發病毒脫殼和進入細胞的角色，因此目前已經發現的多數中和抗體都為抗ORF2蛋白抗體。
目前用於抗體檢測的ORF2蛋白主要來源於昆蟲細胞系統表達的完整ORF2蛋白和大腸桿菌系統表達的ORF2蛋白片段，但不同的抗原表現出不同的抗體結合能力，比如ORF2蛋白片段比ORF2蛋白全長能更有效的結合恢復期病人血清中的抗HEV抗體。使用合成肽對ORF2蛋白的抗原性研究過程中，發現ORF2蛋白的12-147、381-504和573-660區域存在較多的能夠與HE病人血清反應的抗原表位，這些區域適合於HEV抗體檢測試劑的構建。
ORF3編碼HEV病毒的一個小磷酸化蛋白，分子量約為13.5kDa。它同被稱為AMBP的肝細胞骨架蛋白相互作用。ORF3蛋白較小，其含有的抗原表位也相對較少，目前已經發現的3個ORF3蛋白抗原表位(31-40、63-76和105-122)均為線性表位，其中ORF3蛋白的C`端，特別是105-122aa，抗原性較高，HE病人中針對該表位的抗體陽性率較高，目前的抗體診斷試劑中多包括ORF3蛋白的部分片段。
為了獲得直接檢測HEV抗原的高靈敏度檢測方法，本發明人使用HEV ORF2免疫小鼠，常規方法製備雜交瘤細胞，使用免疫原包被ELISA板進行檢測和篩選，共製備24株雜交瘤細胞用於進一步篩選。
除非另外定義，這裡所用的所有技術和科學名詞都表達的是在本發明涉及領域裡的熟練技術人員所理解的通常含義。這裡所用的命名和在細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。
抗體包含通過二硫鍵連接在一起的多肽鏈集合體。稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構成抗體的所有主要結構類別(同型物)。重鏈和輕鏈都進一步分為稱作可變區和恆定區的一些亞區。重鏈包括單個的可變區和三個不同的恆定區，輕鏈則包括單個可變區(不同於重鏈的可變區)和單個的恆定區(不同於重鏈的恆定區)。重鏈和輕鏈的可變區負責抗體的結合特異性。
「重鏈可變區」是指一種多肽，(1)其長度為110至125個胺基酸；(2)其胺基酸順序相應於本發明單克隆抗體從重鏈N末端胺基酸開始的重鏈胺基酸順序。同樣，「輕鏈可變區」是指一種多肽，(1)其長度為95至115個胺基酸；(2)其胺基酸順序相應於本發明單克隆抗體從輕鏈N末端胺基酸開始的輕鏈胺基酸順序。
所用的術語Fab、Fc、F(ab)2及Fv各有其標準的免疫學含義(見Klein，免疫學，John Wiley，New York，1982；Parham，Chapter14，in Weir，ed.免疫化學，4thEd.，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，1986)。
本發明的一方面，涉及一種針對HEV ORF2抗原的單克隆抗體。
在本發明的一個實施方案中，採用已知技術建立本發明的雜交瘤細胞系。該方法通常包括一種可持久傳代的細胞系與一種可產生所需抗體的B淋巴細胞融合。從注射了靶抗原的哺乳動物來獲得適當淋巴細胞的技術是熟知的。一般說來，如果需要人的細胞，可使用外周血淋巴細胞；如果需要非人類哺乳動物細胞，則使用脾細胞或淋巴結細胞。給宿主哺乳動物重複注射純化的抗原，並使該哺乳動物產生所需的抗體生成細胞，然後收集這些細胞與可持久傳代的細胞系進行融合。細胞融合技術也是本領域內熟知的。一般包括將細胞與融合劑如聚乙二醇混合。用標準方法如HAT選擇法選擇雜交瘤細胞。使用ELISA法等標準的免疫分析法分析這些雜交瘤的培養基以選擇出分泌所需抗體的雜交瘤。使用標準的蛋白質純化技術由培養基中回收抗體。在應用任一種上述技術時有許多文獻可供參考(Kohler等人，雜交瘤技術(Hybridoma Techniques)，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1980；Tijssen，酶免疫檢測的實踐與理論(Practice andTheory of Enzyme Immunoassays)，Elsevier，Amsterdam，1985；等等)。
抗體片段的應用和產生也是熟知的。如Fab片段(Tijssen，酶免疫檢測的實踐與理論，Elsevier，Amsterdam，1985)和Fv片段(Hochman等人，生物化學(Biochemistry)，121130-1135，1973；Sharon等人，生物化學，151591-1594，1976；Ehrlich等人，美國專利4470925)。此外，可藉助已知技術用本發明的這些化合物和組合物構建雙特異性抗體，如通過雜交瘤的進一步融合(即形成所謂四重雜交瘤)(Quadromas)(Reading，美國專利4474493)或半分子的化學再連接(Brennan等人，科學(Science)，22981-83，1985)。
還可用重組方法製得本發明雜交瘤特有的抗體和抗體片段。利用本領域熟知的方法可方便地從本發明雜交瘤中獲得編碼本發明單克隆抗體的編碼序列，尤其是重鏈的可變區序列和輕鏈的可變區序列。本領域內熟練的技術人員可方便地利用這些編碼序列分析出對於單克隆抗體結合特異性重要的胺基酸區域，如存在於抗體基因輕鏈和重鏈可變區的決定簇互補區域(CDR)CDR1、CDR2和CDR3，其相應的胺基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區域。利用這些胺基酸序列，用重組方法可製得具有與單克隆抗體相同或相似特異結合能力的多肽，如將抗體重鏈可變區基因與輕鏈可變區基因順序連接表達而成的單鏈抗體(ScFv)；將抗體重鏈可變區基因與輕鏈可變區基因或CDRs基因置換到人類抗體的相應位置，表達出更接近於人類抗體而又具有原單克隆抗體結合特異性的人源單克隆抗體；等等。
根據上述方法，本發明人利用戊型肝炎病毒ORF2免疫小鼠，製備單克隆抗體。根據布達佩斯條約，本發明人已於2005年12月30日將分泌本發明所述單克隆抗體的雜交瘤細胞系保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢，武漢大學)，分別為保藏號為CCTCC-C0200519的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP04、保藏號為CCTCC-C0200520的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP07和保藏號為CCTCC-C0200521的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP58。
根據本發明製備的各個單克隆抗體及其結合活性片段，本領域技術人員可獲得編碼所述單克隆抗體或其結合活性片段的核苷酸序列，以及根據遺傳密碼子的簡併性產生的不同變體。根據本發明公開的內容，本領域技術人員可用多種方法製備包含上述核苷酸序列之重組表達載體，以及由所得重組表達載體轉化的宿主細胞。宿主細胞的選擇和轉化為本領域技術人員周知，只要其能夠表達本發明所述的單克隆抗體或其結合活性片段。
本發明的另一方面還涉及使用競爭ELISA與本發明所述單克隆抗體的抑制率小於50％，優選的小於25％的單克隆抗體。。所述單克隆抗體即為與本發明上述雜交瘤細胞系所分泌的單克隆抗體識別相同或相似表位的單克隆抗體。
本領域普通技術人員知曉，可通過選擇性標記，並對標記後抗體滴定，競爭ELISA測定對位點的識別。在本發明的一個實施方案中，本發明人通過改良過碘酸鈉方法對抗體進行選擇性HRP標記。標記後的抗體濃度稀釋至50μg/ml，使用免疫原包被的ELISA板進行滴定，滴定過程中對標記的抗體進行倍比稀釋。根據單克隆抗體的分組和標記抗體情況，對分組後抗體做競爭ELISA檢測，相似單克隆抗體是否識別相同或相似的抗原表位。與競爭抗體濃度相同的無關單克隆抗體作為陰性對照，與競爭抗體濃度相同與標記抗體同株的未標記抗體作為陽性對照。37℃孵育1小時後，洗板，TMB顯色，450nm處讀取A值，計算競爭抗體對標記抗體的抑制率。公式如下抑制率＝(A競爭-A陽性/A陰性-A陽性)×100％如抑制率≥75％為兩株單克隆抗體所識別位點完全不相關；≥50％＜75％為不完全相關；≥25％＜50％為相關；＜25％為完全相關。
本發明的另一方面，還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種由保藏號為CCTCC-C0200519的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP04、保藏號為CCTCC-C0200520的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP07和保藏號為CCTCC-C0200521的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP58所分泌的單克隆抗體。在本發明的一個具體實施方案中，所述抗體組合物同時含有為CCTCC-C0200519的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP04、保藏號為CCTCC-C0200520的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP07和保藏號為CCTCC-C0200521的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP58所分泌的單克隆抗體，優選的所述抗體的比例為2∶5∶2。
本發明的再一方面，涉及一種用於雙抗體夾心ELISA方法檢測HEV抗原的試劑盒，所述試劑盒中包含診斷有效量的至少一種本發明的單克隆抗體或其結合活性片段，或本發明前述的抗體組合物。本領域技術人員知曉，適當地，該試劑盒中還應當包括適當的載體，緩衝劑/液，和用於檢測所產生信號的試劑如市售的第二抗體，及使用說明書。
本領域技術人員知曉，對於固相反應檢測而言，可以將本發明所述單克隆抗體固定於固相載體，也可以將待測樣品固定於固相載體上。反應通常在室溫下進行一段時間，檢測過程中需要洗滌不與本發明所述單克隆抗體結合的樣品的步驟。
對於液相反應而言，通常可以向處在特定緩衝體系中的待測樣品直接加入本發明所述單克隆抗體，然後在適於抗原抗體發生相互作用的溫度下，例如室溫下，反應一段時間。
本發明組合物中所涉及的第二抗體的選擇取決於本發明單克隆抗體的來源。本領域技術人員知曉，如何根據單克隆抗體的來源選擇相應的第二抗體。本發明所述第二抗體可以是放射性同位素標記的，包括但不限於使用選自32P、125I、S、2H等；也可以是非放射性同位素標記的，包括但不限於使用選自辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、生物素、鏈黴親和素等標記。本發明所述檢測方法中使用的檢測劑，取決於檢測過程使用的第二抗體的標記物。本領域技術人員知曉如何選擇合適的檢測試劑。
本發明的又一方面，涉及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測樣品中HEV抗原的體外方法。在本發明的一個實施方案中，所述方法包括如下步驟1)採用同時含有CCTCC-C0200519的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP04、保藏號為CCTCC-C0200520的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP07和保藏號為CCTCC-C0200521的雜交瘤細胞系HEV-NICPBP58所分泌的單克隆抗體，優選的，所述抗體的比例為2∶5∶2，的抗體組合物，作為捕獲抗體包被酶標板；2)向包被有捕獲抗體的酶標板條中加入使用含5％牛血清PBST10倍稀釋的待測血清，孵育，洗滌；3)加入羊抗HEV多抗，孵育，洗滌；4)然後加入生物素標記兔抗羊IgG抗體，孵育，洗滌；5)再加入HRP標記親和素，孵育，洗滌；6)加入底物顯色。
本發明還涉及所述抗體組合物用於檢測HEV抗原的用途。
下面結合實施例對本發明進一步加以說明。
實施例1 雜交瘤細胞系的產生取6～8周齡雌性Balb/c小鼠，初次免疫每隻小鼠肌肉注射用福氏完全佐劑乳化的5μg抗原(總體積50μl)。15天後進行二次基礎免疫，方法為取相同量的抗原用福氏不完全佐劑乳化，肌肉注射。30天後，尾靜脈加強注射5μg不加佐劑的抗原，並於加強免疫後72小時，殺死小鼠，收集血液，取脾製備脾細胞懸液(懸於RPMI1640培養基中)，細胞計數板細胞計數。按1/6於脾細胞的數量取培養的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞，混合後離心，利用聚乙二醇(PEG 1500)使脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合。將細胞懸液與等體積的飼養細胞混合後，分置於96孔細胞培養板中(200μl/孔)於5％二氧化碳培養箱(ESPEC BNA-311)37℃培養。3天後，用HT培養基(黃嘌呤(hypoxanthn，H)1.361mg+胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)0.388mg，加RPMI1640(GIBCO公司)培養基至100mL。45～50℃條件下溶解後，過濾除菌。)半保留換液。7天後，用NE2重組抗原包被板，利用如下述酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測96孔細胞培養板中所得雜交瘤細胞上清培養液。對於ELISA檢測為陽性的細胞克隆，利用有限稀釋法進行克隆化。
ELISA檢測法經HPLC純化的抗原，溶解於0.05mol/L碳酸包被緩衝液(20.02gNa2CO3，2.52g NaHCO3加去離子水至1升，pH為9.5)中，濃度約為0.3μg/ml，在96孔聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小時(37℃)，再置於4℃過夜。用PBS-吐溫洗滌液(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5ml吐溫20，加去離子水至1升，pH為7.4)洗滌滴定板以除去未結合的抗原蛋白。然後用200μl/孔的封閉液(1×PBS溶液，組成同前)中加入2％明膠、0.2％酪蛋白和2％蔗糖)37℃封閉2小時。甩淨、拍幹後真空封閉，4℃保存。
檢測時，於每孔中加入100μl細胞培養液上清；每塊96孔微量滴定板設一陽性對照，加入100μl小鼠多抗血清(1∶100稀釋使用)；另設一陰性對照，加入100μlHT細胞培養液。37℃溫浴30分鐘，用PBS-吐溫洗滌液洗5遍，拍幹後加入過氧化物酶結合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM Ig，DAKO公司)，37℃溫浴30分鐘，取出後用PBS-吐溫洗滌液洗5遍，拍幹後先後加入底物液A、B各50μl(底物液A成分為顯色液A成分為13.42g Na2HPO4·12H2O、4.2g檸檬酸·H2O和0.3g過氧化氫，用去離子水中調節體積為700ml；顯色液B成分為0.2g四甲基聯苯胺、20ml二甲基甲醯胺用去離子水中調節體積為700ml)，37℃顯色10分鐘，加入50μl終止液(2M H2SO4)終止反應，並於酶標儀上檢測各孔的OD450值，通常以OD450值高於陰性對照2倍以上者視為陽性。
單克隆抗體腹水的獲得及純化取10周齡的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐劑，每隻0.5ml。2～7天後，收集克隆化的雜交瘤細胞，離心去上清，加入不含血清的培養基，調節細胞密度至2×105～2×106個/ml，每隻小鼠注射0.5ml。7～10天後小鼠腹部增大，開始收集腹水。3000rpm離心15分鐘，吸取中間澄清部分的液體，0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝後-20℃保存。
將處理好的腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa2HPO4，19ml 0.2mol/L NaH2PO4，加生理鹽水至100ml)對倍稀釋，攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉澱溶於原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達到33％飽和度，4℃靜置過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉澱溶於原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，(濃度達到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清。將沉澱溶於適量的PBS中，裝入透析帶中，放入50～100倍含20mmol/L NaCl，pH7.8的120mmol/L Tris-HCl緩衝液中4℃攪拌下脫鹽12小時左右，期間更換3次以上透析液。取出後分裝-20℃保存。
以上述方法，篩選出了24株分泌抗HEV-ORF2單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
實施例2單克隆抗體的製備、純化、純度鑑定小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/只，一周後，預處理小鼠腹腔注射雜交瘤細胞106/只，誘生腹水，一周後抽取含單克隆抗體的腹水，收集腹水3000g離心30分鐘，吸取上清，-70℃凍存備用。
採集的腹水採用辛酸-飽和硫酸胺沉澱法純化單克隆抗體，純化後採用紫外分光光度法測定單克隆抗體濃度，並採用SDS-PAGE電泳分析純化單克隆抗體純度。
實施例3抗原和抗體包被及封閉使用96孔聚苯乙烯板(Polystyrene microtiter plates，Maxisorp F96，Nunk Laboratories，Glostrup，Denmark)進行包被，使用0.05M NaHCO3緩衝液(pH9.6)將抗體稀釋至合適濃度，抗原稀釋為2.5μg/ml，每孔加入100μl，37℃2小時，用pH7.4的含0.1％Tween PBS(PBST)洗滌3遍後，每孔加入含20％牛血清的包被緩衝液200μl，37℃封閉2小時，PBST洗滌3遍後，保存於4℃備用。
間接ELISA間接ELISA中，使用含5％牛血清的PBST將待檢抗體稀釋至合適濃度，加入包被有抗原的微孔板中，100μl/孔，37℃孵育1小時，PBST洗滌5遍。然後每孔加入100μl使用含5％牛血清PBST15000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG抗體，37℃孵育30分鐘後，PBST洗滌五遍，加入TMB底物，37℃顯色15分鐘。在波長450nm處讀取各孔A值。
ELISA板使用2.5μg/ml免疫原包被，二抗採用HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，使用間接法對純化的單克隆抗體進行親和力粗測，純化單克隆抗體均稀釋至濃度為10μg/ml，向下倍比稀釋至0.3ng/ml，平行雙孔，每板設陰性對照兩孔，使用無關鼠源單克隆抗體作為陰性對照。TMB顯色後，450nm讀取A值。繪製同一單克隆抗體不同濃度下A值與濃度的折線圖，並計算四參數曲線，由四參數曲線計算A50時單克隆抗體濃度，以A50濃度代表該株單克隆抗體的親和力。結果見表1表1單克隆抗體對抗原的親和力測定

實施例4採用競爭ELISA測定所述單克隆抗體的識別表位競爭ELISA根據標記抗體的滴定結果，將標記抗體濃度稀釋至A值約為2.00左右，同時將競爭抗體濃度稀釋為標記抗體現濃度的10倍。競爭抗體和標記抗體各50ul加入微孔板中，平行雙孔測定。與競爭抗體濃度相同的無關單抗作為陰性對照，與競爭抗體濃度相同與標記抗體同株的未標記抗體作為陽性對照。37℃孵育1小時，PBST洗滌5次，加入TMB底物緩衝液顯色，波長450nm，讀取A值，計算競爭抗體對標記抗體的抑制率。
抑制率＝(A競爭-A陽性/A陰性-A陽性)×100％改良過碘酸鈉方法對本發明所述單克隆抗體進行選擇性HRP標記，分別標記4、7、8、15、26、27、29、34、40、44、52、56、58、72、80和97號抗體。標記後的抗體濃度稀釋至50μg/ml，使用免疫原包被的ELISA板進行滴定，滴定過程中對標記的抗體進行倍比稀釋。根據單克隆抗體的分組和標記抗體情況，對分組後抗體做競爭ELISA檢測相似單克隆抗體是否識別相同或相似抗原表位。計算競爭抗體對標記抗體的抑制率
抑制率＝(A競爭-A陽性/A陰性-A陽性)×100％如抑制率≥75％為兩株單克隆抗體所識別位點完全不相關；≥50％＜75％為不完全相關；≥25％＜50％為相關；＜25％為完全相關。表2競爭ELISA結果

注配對中後面一個抗體為標記抗體根據競爭抑制結果和分組的情況23株單克隆抗體中識別位點完全相關的為3-50-72-80；40-44；56-90-97；26-67；17-52；34-58；8-20識別位點相關的為2-29；40-44-29識別位點不完全相關的為40-44-29；8-7；20-7實施例5使用HEV1型、4型和豬源HEV攻毒後2周的猴血清選擇適宜的包被抗體LAB間接夾心法ELISA包被有單克隆抗體的酶標板條中加入使用含5％牛血清PBST 10倍稀釋的待測血清，37℃孵育2小時，PBST洗滌3遍。加入羊抗HEV多抗，37℃孵育1小時，PBST洗滌5遍，加入生物素標記兔抗羊IgG抗體，37℃孵育30分鐘後，PBST洗滌5遍，再加入HRP標記親和素，37℃孵育30分鐘後，PBST洗滌5遍，加入TMB底物，37℃顯色15分鐘。在波長450nm處讀取各孔A值。
為了確定適於包被的單克隆抗體，分別使用10μg/ml的單克隆抗體包被EILSA板，採用LAB間接夾心法ELISA對20倍稀釋的HEV1型，4型和豬源HEV攻毒後2周的猴血清進行檢測，選取能夠同時檢出3種不同HEV的11株抗體進行進一步的篩選。
表3不同單克隆抗體作為包被抗體時對1、4和豬型HEV攻毒後猴血清檢測的S/Co值

實施例6.最適包被抗體-單克隆抗體的篩選使用佑安醫院收集的抗HEV IgG和IgM雙陽血清27份，對選擇的11株單克隆抗體進行進一步的篩選。，最終確定5株適於包被的單克隆抗體分別為4、7、15、34、58號。結果見表4
表4不同單克隆抗體作為包被抗體時對佑安醫院收集的27份抗HEVIgG和IgM雙陽血清檢測的S/Co值 實施例7.包被抗體組合物的選擇選擇合適的單克隆抗體進行了包被單克隆抗體的搭配選擇，對不同單克隆抗體的搭配比例進行摸索，對單克隆抗體的包被濃度進行摸索，對27份臨床樣本進行重新測定。
根據以上單克隆抗體對27份血清的反應性確定了6個組合，使用總濃度為10μg/ml的以上單克隆抗體組合的等濃度混合物包被ELISA板，LAB間接夾心法檢測上述27份臨床血清，根據檢測結果，確定58-4-7組合最檢出率最高。結果見表5。
表5不同抗體組合對佑安醫院收集的27份抗HEV IgG和IgM雙陽血清檢測的S/Co值
實施例8.包被抗體組合物最佳配比的選擇對58-4-7組合中各個單克隆抗體比例進行摸索，總濃度為10μg/ml，將總濃度分為9份，分別檢測58-4-7不同搭配比例情況下對佑安醫院收集的27份抗HEV IgG和IgM雙陽血清中的7份具有代表性血清的檢測效果。最終確定58-4-7搭配比例為2∶5∶2。結果見表6。
表6.58-4-7抗體組合物中不同搭配比例情況下對7份代表性血清檢測的S/Co值

實施例9.最適包被濃度的確定按照單克隆抗體58-4-7比例為2∶5∶2包被ELISA板，包被濃度分別為20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml和1.25μg/ml，對30份血清進行重新測定，根據陽性樣品檢出率和陰性A值，確定最合適的包被濃度為5μg/ml。
權利要求
1.一種針對HEV ORF2抗原的單克隆抗體，其為1)HEV-NICPBP04，由保藏號為CCTCC-C200519的雜交瘤分泌；2)HEV-NICPBP07，由保藏號為CCTCC-C200520的雜交瘤分泌；和3)HEV-NICPBP58，其特徵在於由保藏號為CCTCC-C200521的雜交瘤分泌。
2.一種針對HEV ORF2抗原的單克隆抗體，其特徵在於所述單克隆抗體與權利要求1的單克隆抗體的競爭性ELISA抑制率小於50％，優選的小於25％。
3.一種抗體組合物，其中含有至少一種權利要求1或2中的單克隆抗體。
4.權利要求3的抗體組合物，其由權利要求1中所述的單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58組成。
5.權利要求4的抗體組合物，其中單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58的比例為2∶5∶2。
6.一種用於雙抗體夾心ELISA方法檢測HEV抗原的試劑盒，其特徵在於含有權利要求3的抗體組合物。
7.一種利用雙抗體夾心ELISA方法檢測樣品中HEV抗原的體外方法。
8.權利要求7的方法，其中所述抗體組合物由單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58組成。
9.權利要求7的方法，其中所述抗體組合物中單克隆抗體HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58的比例為2∶5∶2。
10.權利要求3的抗體組合物用於檢測HEV抗原的用途。
全文摘要
本發明涉及一種針對HEV ORF2抗原的單克隆抗體，以及使用競爭ELISA與所述單克隆抗體的抑制率小於50％，優選的小於25％的單克隆抗體。本發明還涉及一種抗體組合物，其中含有至少一種前述單克隆抗體；一種使用雙抗體夾心ELISA方法檢測HEV抗原的試劑盒，其含有前述抗體組合物；以及利用前述抗體組合物通過雙抗體夾心ELISA方法檢測樣品中HEV抗原的體外方法。本發明還涉及所述抗體組合物用於檢測HEV抗原的用途。
文檔編號G01N33/576GK101034090SQ200610056960
公開日2007年9月12日 申請日期2006年3月8日 優先權日2006年3月8日
發明者王佑春, 李秀華, 張峰, 喬杉 申請人:中國藥品生物製品檢定所, 北京萬泰生物藥業有限公司