一種布魯氏桿菌核酸疫苗的製作方法

2023-04-29 05:01:11 3

專利名稱：一種布魯氏桿菌核酸疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種布魯氏桿菌核酸疫苗。
背景技術：
布魯氏病是全球範圍的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病，由一種名為布魯氏桿菌的革蘭氏陰性兼性胞內寄生菌所致，在人類，牛，羊，嚙齒類，豬等哺乳動物中有廣泛傳播。在畜牧重要的物種中，此病可極大的導致動物生殖能力的喪失；對於人類，則會出現間斷性的發熱等臨床症狀，故而又被稱為波熱症。疫苗免疫對於防治布魯氏病至關重要。S19減毒活菌疫苗是最早並且最為廣泛的在牛群中應用的一種疫苗。儘管此疫苗能產生一定的保護力，但是它持續的血清學反應致使人們不能區分免疫與感染的牛。另外此疫苗對人類是致病的，且可致使孕期牛流產。類似的疫苗諸如Rev1或RB51都存在穩定性及有效性方面的缺陷。
DNA疫苗可在很多疾病的動物模型上被證實可誘導體液及細胞免疫應答；因此，DNA疫苗在為新的布魯氏桿菌的替代疫苗創造了一個新的機會。目前，人們已研究了一些轉載了編碼L7/L12、SOD、P39或喋啶合成酶等基因的真核表達體系在模式動物中的保護作用。最近，編碼羊布魯氏桿菌31kDa膜蛋白的單價DNA疫苗被證實可激發特異的細胞殺傷作用。然而，以上所述的疫苗中沒有一個保護作用比目前使用的S19或H38疫苗效果更好。

發明內容
本發明的目的是提供一種布魯氏桿菌核酸疫苗。
本發明所提供的布魯氏桿菌核酸疫苗，它的活性成分是下述任一種混合物1)將BCSP31、sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)和L7/L12基因分別克隆到真核細胞表達載體中，得到含有BCSP31基因的重組表達載體、含有sodC基因的重組表達載體和含有L7/L12基因的重組表達載體，將所述至少兩種重組表達載體進行混合得到的混合物；2)將BCSP31、sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)和L7/L12三種基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變後的且可編碼與BCSP31、sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)和L7/L12具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核細胞表達載體中，將得到的至少兩種重組表達載體進行混合得到的混合物。
所述布魯氏桿菌核酸疫苗的活性成分優選為將BCSP31、sodC和L7/L12基因分別克隆到真核細胞表達載體中，得到含有BCSP31基因的重組表達載體、含有sodC基因的重組表達載體和含有L7/L12基因的重組表達載體，將所述三種重組表達載體進行混合得到的混合物。
所述BCSP31的胺基酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC(Copper/Zinc superoxide dismutase)的胺基酸序列如GenBank Accession NumberYP_418725；L7/L12的胺基酸序列如GenBank Accession Number L19101。
所述BCSP31基因的核苷酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC基因的核苷酸序列如GenBank Accession Number NC_007624；L7/L12的核苷酸序列如GenBank Accession Number L19101。
所述三種重組表達載體的重量份數比可為1∶1∶1。
所述真核表達載體可為帶有真核表達啟動子的表達載體，如巨細胞病毒(CMV)早期基因啟動子，老鼠看家基因的啟動子等，優選為哺乳動物細胞表達載體，如pJW4303。
動物表達載體pJW4303，其物理圖譜如圖7所示，其序列如序列表中序列1所示。帶有巨細胞病毒(CMV)早期基因啟動子，是保證目的基因在肌肉細胞中高效轉錄的強啟動子。該載體還帶有組織血纖維蛋白溶酶原激活劑的胞外分泌信號序列，定向克隆在這一信號序列下遊的外源基因產物能被成功地分泌到胞外，增加了抗原與巨噬細胞的接觸機會，加速了依賴於蛋白酶體的內源性合成抗原的降解，導致體內誘導的細胞介導的應答增強。此外，pJW4303含有11個CpG序列，在DNA疫苗誘發機體產生免疫應答中起重要作用，可在無T細胞存在的情況下直接激活B細胞，刺激分泌免疫球蛋白及白細胞介素6，也可直接激活單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞，上調共刺激分子的表達，有利於產生多種Th1型細胞因子，提高了保護性免疫力。
所述哺乳動物細胞表達載體包括質粒載體和病毒載體兩大類。如不帶真核複製起始序列的質粒型表達載體pTK2、pHyg和pRSVneo等，帶真核病毒調控序列元件的質粒表達載體、SV40衍生的表達載體pMSG、pSVT7和pMT2等，牛乳頭瘤病毒(BPV)衍生載體，人皰疹病毒(EBV)衍生的表達載體，人腺病毒衍生的表達載體，反轉錄病毒衍生的表達載體。
所述布魯氏桿菌核酸疫苗的活性成分優選為pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12。
上述布魯氏桿菌核酸疫苗中還含有佐劑IL-12、IL-15、DDA(雙十八烷基二甲基溴化銨)，MPL(單磷醯脂質體A)，Quil-A(皂素的純化物)，RIBI adjuvant(美國RIBI ImmunoChem研究股份有限公司生產)和/或其它佐劑(鋁佐劑，弗氏佐劑等)。該疫苗中，活性成分與DDA或MPL的重量份數比可為5∶6，與其它佐劑的重量份數比可為3∶1；活性成分在saline中的濃度可為1mg/ml。
本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗可用於預防和/或治療動物布魯氏病，特別是預防和/或治療人、牛、羊布魯氏病。使用時，可分三次或更多次免疫，每次免疫劑量可為50-100mg活性成分/50kg體重。
本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗誘導機體產生的BCSP31、sodC和L7/L12的特異性IgG抗體反應水平顯著高於S19疫苗。布魯氏桿菌核酸疫苗免疫過的小鼠能夠產生對布魯氏桿菌有效而長期的免疫性並激發顯著的Th1 cytokine反應。布魯氏桿菌核酸疫苗誘導的BCSP31、sodC、L7/L12及Brucella(Brucella全蛋白提取物)特異性的IFN-γ細胞數量明顯高於S19疫苗。布魯氏桿菌核酸疫苗誘導的T細胞水平較S19疫苗高40％，其中以CD8+T細胞為主。布魯氏桿菌核酸疫苗對小鼠的保護效率明顯高於S19疫苗。表明本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗可以取代傳統的S19疫苗用於布魯氏病的預防。
本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗不僅增強了免疫動物的機體體液應答反應，同時增強了細胞介導的免疫反應，而後者是提高DNA疫苗效率的重要前提條件，更重要的是本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗極大增強了特異殺傷布魯氏桿菌的細胞水平。如果加上佐劑IL-12或IL-15不僅可提高TH1型細胞反應，更可延長核酸疫苗的保護期。
本發明使用編碼BCSP31、sodC、L7/L12的聯合DNA疫苗策略來提高DNA疫苗對布魯氏病的效用。BCSP31蛋白是免疫主導蛋白，而sodC和L7/L12也已被證實可以引起一定的免疫反應。
本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗容易生產，穩定性強，較安全，不會感染人或牛。本發明的布魯氏桿菌疫苗與現有的布魯氏桿菌核酸疫苗的不同之處在於本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗免疫動物後，由於載體高效的表達水平，確保了抗原高效持續表達並分泌到胞外。本發明可使用佐劑DDA等提高疫苗的保護效率。本發明的布魯氏桿菌疫苗目前已在大型動物牛上進行試驗，取得了非常明顯保護效率。如果用該布魯氏桿菌疫苗免疫牛，必將大大減少牛患結核的機率，保證牛肉及牛奶的產量和質量。如果用該布魯氏桿菌核酸疫苗免疫人，不但能讓人體產生對布魯氏桿菌的免疫力，而且不會有被感染可能，增強了疫苗的安全性。總之，本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗對提高動物及人類對布魯氏桿菌的免疫力，更有效地控制布魯氏病的傳播和流行，繁榮畜牧業及增強人類體質具有重要的理論意義和應用價值。


圖1A為RT-PCR鑑定布魯氏桿菌核酸疫苗免疫小鼠中BCSP31、sodC和L7/L12基因的表達結果圖1B為pJBCSP31GFP、pJsodCGFP或pJL7/L12GFP免疫小鼠中BCSP31、sodC和L7/L12的表達結果圖2A為初次免疫後0、3、6和9周的特異性IgG水平圖2B為初次免疫後9周的特異性IgG水平圖2C為初次免疫後9周的特異性IgG1和IgG2a水平圖3為免疫後四周的脾臟細胞培養上清中特異性細胞因子水平柱形4為IFN-γ的ELISPOT分析結果圖5為疫苗誘導產生的免疫小鼠抗原特異性殺傷性T細胞水平的柱形6為免疫小鼠的顆粒酶ELISPOT鑑定結果圖7為動物表達載體pJW4303的物理圖譜具體實施方式
下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規方法。
實施例1、布魯氏桿菌疫苗的製備1、真核表達載體的構建用PCR方法擴增布魯氏桿菌的BCSP31、sodC和L7/L12基因並克隆到真核表達載體pJW4303上用於在真核細胞內表達。GenBank收錄號分別為BCSP31M20404；sodCNC_007624；L7/L12L19101。以常規方法提取的牛布魯氏桿菌(Brucellaabortus 2308)(購自中國藥品生物製品檢定所)基因組DNA為模板，用PCR擴增BCSP31、sodC和L7/L12基因並定向克隆到pJW4303載體上的組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)信號序列下遊，形成融合蛋白。擴增BCSP31所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3』和5』-CGGGATCCTTATTTCAGCACGCCCGCTTCC-3』；擴增sodC所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAAAAACGGCTT-3』和5』-CGGGATCCTTACTTTTTCTTCATATC-3』；擴增L7/L12所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3』和5』-CGGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGC-3』。5』端引物都含Nhe I位點，3』端引物都含有BamH I位點。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後按QIAquick GelExtraction Kit說明書操作回收，得到目的基因。分別用Nhe I和BamH I雙酶切經凝膠純化的目的基因產物及pJW4303載體DNA，用T4DNA連接酶處理16h(16℃)，取5μl連接產物(總體積20μl)轉化感受態大腸桿菌DH5α菌株。挑取轉化菌單菌落抽提質粒，Nhe I和BamH I雙酶切鑑定後進行序列分析以證實插入片段序列是否正確。分別選取3個含有不同目的基因表達載體的菌株進行DNA序列分析，以獲取帶有正確讀碼框的表達載體，把含有BCSP31基因的表達載體命名為pJBCSP31，把含有sodC基因的表達載體命名為pJsodC，把含有L7/L12基因的表達載體命名為pJL7/L12。將pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12轉化到TOP10大腸桿菌中，在含100μg/ml氨苄青黴素(Amp)的LB培養基中再次篩選重組菌株，用QIAGEN PlasmidMaxi Kit和Mega Kit大量製備質粒DNA，用滅菌生理鹽水稀釋成濃度為1-2μg/μl，紫外分光光度計定量。
2、布魯氏桿菌疫苗的製備將pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12等量混勻，用生理鹽水或磷酸緩衝液(PBS)溶解，製成布魯氏桿菌核酸疫苗。
實施例2、布魯氏桿菌核酸疫苗在體內表達的鑑定1、RT-PCR鑑定BCSP31、sodC和L7/L12基因的表達將20隻C57BL/6小鼠均分為2組，分別進行如下處理第一組為非免疫組(對照)，每隻肌肉注射含有150μg pJW4303的150μl生理鹽水；第二組為布魯氏桿菌核酸疫苗組，取實施例1中製備的質粒pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12各50μg，共同溶於150μl生理鹽水中，混勻，得到布魯氏桿菌核酸疫苗。將該布魯氏桿菌核酸疫苗肌肉注射免疫，免疫劑量為150μl/只。免疫完成後四周，每組各取10隻小鼠脾臟，使用Trizol試劑(美國Gibco公司)提取其總RNA。而後反轉錄成cDNA，以此作為模板，使用BCSP31、sodC和L7/L12三種抗原基因的特異性引物進行PCR擴增，以鑑定三種基因是否表達。其中，擴增BCSP31所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3』和5』-CGGGATCCTTATTTCAGCACGCCCGCTTCC-3』；擴增sodC所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAGTCCTTATTT-3』和5』-CGGGATCCTTATTCGATCACGCC-3』；擴增L7/L12所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3』和5』-CGGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGC-3』。
結果表明免疫後4周，所檢測的10隻免疫布魯氏桿菌核酸疫苗的小鼠，在脾臟中均表達BCSP31、sodC和L7/L12基因；而免疫pJW4303的10隻小鼠，在脾臟中無BCSP31、sodC和L7/L12基因的表達(圖1A)。圖1A中，「+R」表示反轉錄後擴增，「-R」表示沒有反轉錄就擴增。
2、體內蛋白表達的鑑定(1)以常規方法提取的牛布魯氏桿菌(Brucella abortus 2308)(購自中國藥品生物製品檢定所)基因組DNA為模板，使用BCSP31、sodC和L7/L12三種抗原基因的特異性引物進行PCR擴增。其中，擴增BCSP31所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3』和5』-CGGGATCCTTATTTCAGCACGCCCGCTTCC-3』；擴增sodC所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAGTCCTTATTT-3』和5』-CGGGATCCTTATTCGATCACGCC-3』；擴增L7/L12所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3』和5』-CGGGATCCTTACTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGC-3』。將PCR得到的BCSP31、sodC和L7/L12三種抗原基因分別克隆到哺乳動物真核表達載體pEGFP-N1中(購自美國Clontech Laboratories公司)的限制性內切酶NheI和BamH I位點間，得到含有GFP蛋白基因與BCSP31融合基因的重組表達載體pJBCSP31GFP、含有GFP蛋白基因與sodC融合基因的重組表達載體pJsodCGFP、含有GFP蛋白基因與L7/L12融合基因的重組表達載體pJL7/L12GFP。
(2)免疫小鼠按照文獻Cai et al.，2005，Vaccine 23，4167-4174中的方法，將50μgpJBCSP31GFP、50μg pJsodCGFP或50μg pJL7/L12GFP分別與150μl印度墨水混合後，分別注射於C57BL/6小鼠小腿中部。同時將50μg pJW4303與150μl印度墨水混合後，注射於C57BL/6小鼠小腿中部，作為對照。每種處理各10隻小鼠。兩周後，將注射部位肌肉分離出來，固定後，切片厚約10μm，於螢光顯微鏡下觀察，結果表明免疫後2周，所檢測的10隻免疫pJBCSP31GFP的小鼠肌肉組織中，均表達BCSP31；所檢測的10隻免疫pJsodCGFP的小鼠肌肉組織中，均表達sodC；所檢測的10隻免疫pJ L7/L12GFP的小鼠肌肉組織中，均表達L7/L12；所檢測的10隻免疫pJW4303的小鼠肌肉組織中，均無BCSP31、sodC和L7/L12表達(圖1B)。圖1B中，DNA表示注射pJBCSP31GFP、pJsodCGFP或pJL7/L12GFP的小鼠肌肉組織，Vector表示注射pJW4303的小鼠肌肉組織。
實施例3、布魯氏桿菌核酸疫苗的免疫效果實驗將60隻C57BL/6小鼠均分為4組，分別進行如下處理第一組為布魯氏桿菌核酸疫苗組，實施例1中製備的質粒pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12各50μg，共同溶於150μl生理鹽水中，混勻，得到布魯氏桿菌核酸疫苗。對小鼠進行三次肌肉注射免疫，免疫劑量為150μl/只/次，時間點為第0周，第3周，第6周。第二組為S19疫苗組，1×109CFU S19凍幹蛋白(購自中國藥品生物製品檢定所，編號040611，批准文號新生藥字(2001)287710)用150μl生理鹽水溶解，得到S19疫苗；對小鼠進行三次肌肉注射免疫，免疫劑量為150μl/只/次，時間點為第0周，第3周，第6周。第三組為空載體組，將50μg pJW4303溶於150μl生理鹽水中，得到空載體疫苗；對小鼠進行三次肌肉注射免疫，免疫劑量為150μl/只/次，時間點為第0周，第3周，第6周。第四組為生理鹽水組，每隻於第0周注射150μl生理鹽水。對這四組免疫處理的小鼠進行如下實驗。
1、免疫後體液免疫反應的鑑定(1)L7/L12、sodC、BCSP31抗原的製備以常規方法提取的牛布魯氏桿菌(Brucella abortus 2308)(購自中國藥品生物製品檢定所)基因組DNA為模板，用PCR擴增BCSP31、sodC和L7/L12基因。其中，擴增BCSP31所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTC-3』和5』-CAGCTCGAGTTTCAGCACGCCCGCTTCCTTGTAAAAGC-3』(XhoI位點)；擴增sodC所用的引物序列如下5』-CAGCTCGAGTTACTTTTTCTTCATATC-3』(XhoI位點)和5』-CGGGATCCTTACTTTTTCTTCATATC-3』；擴增L7/L12所用的引物序列如下5』-GCTAGCCATATGATGGCTGATCTCGCAAAGATCG-3』和5』-CAGCTCGAGCTTGAGTTCAACCTTGGCGCCAGCAGC-3』(Xho I位點)。
將PCR擴增BCSP31、sodC和L7/L12基因分別克隆到pET22b(+)(購自Novagen公司)中的限制性內切酶NdeI和XhoI位點間，得到含有BCSP31的重組載體pET-BCSP31，含有sodC的重組載體pET-sodC，含有L7/L12的重組載體pET-L7/L12。將重組載體pET-BCSP31、pET-sodC或pET-L7/L12轉入大腸桿菌DE3BL21(plySs)後，表達用0.6μM IPTG 37℃誘導4小時。按照pET22b(+)使用說明書純化得到L7/L12、sodC、BCSP31抗原。
(2)免疫後體液免疫反應的鑑定小鼠各次免疫後血清中BCSP31、sodC、L7/L12和布氏桿菌全蛋白特異的IgG及其亞型IgG1、IgG2a的測定，使用間接ELISA的方法進行測定。免疫小鼠的血清分別從1∶100開始2倍系列稀釋後用於檢測，L7/L12、sodC、BCSP31抗原以及PPD抗原(牛布魯氏桿菌(Brucella abortus 2308)的總蛋白)用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩衝液)稀釋至10μg/ml，分別加入96孔酶標板(NUNC)，100μl/每孔，4℃過夜，用洗滌液(PBS/Tween0.05％)洗滌3次。每孔加入200μl封閉液(5％脫脂奶粉PBS-Tween 0.05％)，置37℃恆溫箱封閉60min，按上法洗滌3次。加待測血清，置37℃恆溫箱2h，反覆洗滌3次。加1∶2000稀釋的抗抗體-酶標抗體HRP標記的兔抗鼠IgG，IgG1或IgG2a(購自英國Serotec公司)每孔加100μl，置37℃溫育2h，洗滌3次，用TMB(四甲基聯苯胺二鹽酸)顯色後，測波長450nm吸光度(A)。以正常血清相對應稀釋度作為陰性對照，吸光度值0.05以上、實驗組吸光度A值/第四組樣品吸光度A值≥2.0為陽性。
結果如圖2A、圖2B和圖2C所示，圖2A表明抗原特異性的抗體在布魯氏桿菌核酸疫苗中被誘導，且以初免後9周，抗BCSP31的抗體為最高。圖2A為每組5隻小鼠的平均值，Brucella表示PPD抗原。
圖2B表明，與S19疫苗組比較，三種抗原的特異抗體均存在顯著到極顯著水平的差異。圖2B為每組5隻小鼠的平均值，五個實心圓點表示該5隻小鼠，Brucella表示PPD抗原。
圖2C表明，布魯氏桿菌核酸疫苗組誘導了高水平的IgG2a，其與IgG1的平均抗體滴度比值達8倍，使得小鼠體內免疫反應具有明顯的TH1型傾向性。圖2C為每組5隻小鼠的平均值，五個實心圓點表示該5隻小鼠，Brucella表示PPD抗原。
2、免疫後各種細胞因子的鑑定末次免疫後四周，每組取5隻小鼠脾臟細胞，用5μg/ml的L7/L12、sodC或BCSP31抗原來刺激，同時以108CFU/ml的HKBA(熱滅活的牛布魯氏桿菌(Brucella abortus 2308)作為陽性對照來刺激。刺激後孵育3天。取細胞培養上清，用TH1/TH2型細胞因子磁珠試劑盒(CBA，美國BD公司)來測定包括IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-2及TNF-α在內的五種細胞因子。該檢測方法的靈敏度為7μg/ml。另外IL-10的測定則以anti-mouse IL-10為抗體(美國eBioscience公司)使用夾心ELISA方法進行。
結果如圖3中A至D所示，表明布魯氏桿菌核酸疫苗組誘導了高水平的IFN-γ，IL-2和TNF-α，這些作為TH1型免疫反應的細胞因子都達到了納克級水平，顯著高於其他免疫組；而TH2型的細胞因子如IL-4和IL-10則只在100pg左右，與生理鹽水及空載體組沒有明顯差異。圖3中，A為BCSP31刺激的脾臟細胞培養上清中特異性細胞因子水平柱形圖，B為sodC刺激的脾臟細胞培養上清中特異性細胞因子水平柱形圖，C為L7/L12刺激的脾臟細胞培養上清中特異性細胞因子水平柱形圖，D為HKBA刺激的脾臟細胞培養上清中特異性細胞因子水平柱形圖；Saline表示生理鹽水組，Vector DNA表示空載體組，S19 Vaccine表示S19疫苗組，DNA Vaccine表示布魯氏桿菌核酸疫苗組。
3、IFN-γ的ELISPOT分析將步驟2中分離出來的部分脾細胞鋪布於ELISPOT板上，用特異性的抗原L7/L12、sodC或BCSP31(終濃度5μg/ml)或HKBA(108CFU/ml)刺激細胞後，於37℃孵育48小時，去除反應的細胞後，用生物素偶聯的IFN-γ抗體(購自美國eBioscience公司)結合併進一步顯色。孔中點數即為所鋪布脾細胞中分泌幹擾素細胞的頻率。結果如圖4所示，布魯氏桿菌核酸疫苗組誘導了BCSP31、sodC、L7/L12及Brucella全蛋白(牛布魯氏桿菌(Brucella abortus2308)超聲破碎後，所提的總蛋白)特異性的IFN-γ細胞，實驗測得其斑點量一般在90個左右/2×105個脾細胞。而S19疫苗組則一般在40個左右，顯著低於布魯氏桿菌核酸疫苗組。圖4中，數值為2×105個脾細胞中的斑點數，單位是個；rBCSP31表示BCSP31刺激的結果、rSOD表示sodC刺激的結果、rL7/L12表示L7/L12刺激的結果、HKBA表示HKBA刺激的結果；Medium表示不加抗原僅用培養基刺激的結果，作為陰性對照。
4、淋巴細胞亞型的鑑定在末免疫後的6周時間內，外周血單核細胞用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法進行分離，而後使用含有5μg/ml的BCSP31、5μg/mlsodC和5μg/ml L7/L12的抗原溶液來刺激這些細胞。從白細胞中分離的淋巴細胞與大鼠抗小鼠CD3-RPE、CD19-FITC、CD4-FITC、CD8-RPE(購自美國eBioscience公司)共同孵育後，在流式細胞儀上測定，從而分別各種細胞亞型在免疫後的變化情況。
結果如圖5所示，A中顯示其以CD3和CD19為標記的T和B細胞亞群在免疫後六周中的變化情況及其在第四周時的相對比例(小圖)。B中則顯示以CD4和CD8為表面分子標記的T4和T8細胞亞群的比例在免疫後六周中的變化。總體看來，免疫後，布魯氏桿菌核酸疫苗組組誘導了更為強烈的T細胞水平，總體較S19疫苗組高40％，其中以CD8+T細胞為主，布魯氏桿菌核酸疫苗誘導了此類殺傷性細胞的顯著升高。圖5為每組5隻小鼠的平均結果。
5、顆粒酶ELISPOT鑑定顆粒酶ELISPOT的鑑定用美國Millipore公司的RD公司的小鼠顆粒酶ELISPOT檢測試劑盒來鑑定。先將特異針對顆粒酶B的單克隆抗體(美國Millipore公司的RD公司的小鼠顆粒酶ELISPOT檢測試劑盒自帶)包被到PVDF膜上。
在末次免疫後的第6周，各組小鼠外周血單核細胞用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法進行分離，而後分別用5μg/ml的BCSP31、5μg/ml sodC或5μg/ml L7/L12的抗原溶液來刺激這些細胞。刺激後與大鼠抗小鼠CD8-RPE(購自美國eBioscience公司)共同孵育後，用流式細胞儀分離CD8+細胞。
將分離的各組CD8+細胞和預先轉染了pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12的EL4細胞(美國sigma-aldrich公司，產品編號85023105)一起孵育20h。用沒有轉染的EL4細胞作為空白對照。靶細胞和EL4相互作用後，會產生顆粒酶，進而與膜上抗體反應，用顯色劑顯色後即可見其在膜上留下斑點。
結果如圖6所示，免疫S19疫苗的小鼠有較為微弱的斑點顯示，約40個/2×104個CD8+細胞，相比免疫了本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗的小鼠所產生的100個左右/2×104個CD8+細胞的斑點來講具有顯著的差異。該實驗也驗證了細胞殺傷作用是細胞清除布魯氏桿菌的一個重要途徑。圖6中，rBCSP31表示BCSP31刺激的結果、rSOD表示sodC刺激的結果、rL7/L12表示L7/L12刺激的結果、Medium表示沒有轉染的EL4細胞，作為陰性對照。圖6為每組5隻小鼠的平均實驗結果。
6、攻毒實驗末次免疫後第六周，以5×106CFU牛布魯氏桿菌(Brucella abortus 2308)/只的劑量對各免疫組小鼠實施靜脈攻毒，感染後四周小鼠麻醉處死，取脾臟，研磨後塗布於培養基上，37度培養三天後，細菌計數。
結果如表1所示，表明本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗對小鼠取得了高達3.58個單位的保護，明顯高於生理鹽水及空載體組。而S19疫苗組中S19疫苗對小鼠的保護則只有2.87個單位，明顯低於布魯氏桿菌核酸疫苗組。也就是說，布魯氏桿菌核酸疫苗組的減菌量是S19疫苗組的5倍，對小鼠有明顯的保護作用。
表1.布魯氏桿菌核酸疫苗對C57BL/6小鼠感染布魯氏桿菌後的保護作用。

表1中數據由各組10隻小鼠平均後取方差而得，實驗重複兩次進行。
*P＜0.01，**P＜0.001，差異顯著性統計依據one-way ANOVA方法，繼之以Tukey’s檢驗進行比較。
序列表160121012115130212DNA213人工序列220
223
4001gacgtcgcgg ccgctctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag 60aggccgaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tgcatggggc 120ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact 180atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg 240gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 300ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat tccacagaat taattcccgg 360ggatcgatcc ggtcgacaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat ctatatcata 420atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttgacat tgattattga 480ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 540gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctcgtgaccg cccaacgacc cccgcccatt 600gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 660atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 720aagtccggcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 780acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 840ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 900gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 960gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg1020
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權利要求
1.一種布魯氏桿菌核酸疫苗，它的活性成分是下述任一種混合物1)將BCSP31、sodC和L7/L12基因分別克隆到真核細胞表達載體中，得到含有BCSP31基因的重組表達載體、含有sodC基因的重組表達載體和含有L7/L12基因的重組表達載體，將所述至少兩種重組表達載體進行混合得到的混合物；2)將BCSP31、sodC和L7/L12三種基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變後的且可編碼與BCSP31、sodC和L7/L12具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核細胞表達載體中，將得到的至少兩種重組表達載體進行混合得到的混合物。
2.根據權利要求1所述的核酸疫苗，其特徵在於所述布魯氏桿菌核酸疫苗的活性成分是將BCSP31、sodC和L7/L12基因分別克隆到真核細胞表達載體中，得到含有BCSP31基因的重組表達載體、含有sodC基因的重組表達載體和含有L7/L12基因的重組表達載體，將所述三種重組表達載體進行混合得到的混合物。
3.根據權利要求1所述的核酸疫苗，其特徵在於所述BCSP31的胺基酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC的胺基酸序列如YP_418725；L7/L12的胺基酸序列如GenBank Accession Number L19101。
4.根據權利要求3所述的核酸疫苗，其特徵在於所述BCSP31基因的核苷酸序列如GenBank Accession Number M20404；sodC基因的核苷酸序列如NC_007624；L7/L12的核苷酸序列如GenBank Accession Number L19101。
5.根據權利要求2所述的核酸疫苗，其特徵在於所述三種重組表達載體的重量份數比為1∶1∶1。
6.根據權利要求2所述的核酸疫苗，其特徵在於所述真核細胞表達載體為哺乳動物細胞表達載體。
7.根據權利要求6所述的核酸疫苗，其特徵在於所述哺乳動物細胞表達載體為pJW4303。
8.根據權利要求7所述的核酸疫苗，其特徵在於所述布魯氏桿菌核酸疫苗的活性成分是pJBCSP31、pJsodC和pJL7/L12。
9.根據權利要求1所述的核酸疫苗，其特徵在於所述布魯氏桿菌核酸疫苗中還含有佐劑IL-12、IL-15、DDA、MPL、Quil-A、RIBI adjuvant、鋁佐劑、和/或弗氏佐劑。
10.根據權利要求9所述的核酸疫苗，其特徵在於所述布魯氏桿菌核酸疫苗中，所述活性成分與DDA或MPL的重量份數比為5∶6，所述活性成分與IL-2、IFN-γ、IL-12或IL-15的重量份數比為3∶1。
全文摘要
本發明公開了一種布魯氏桿菌核酸疫苗。該布魯氏桿菌核酸疫苗，它的活性成分是下述任一種混合物1)將BCSP31、sodC和L7/L12基因分別克隆到真核細胞表達載體中，得到含有BCSP31基因的重組表達載體、含有sodC基因的重組表達載體和含有L7/L12基因的重組表達載體，將所述至少兩種重組表達載體進行混合得到的混合物；2)將BCSP31、sodC和L7/L12三種基因分別與其它核酸序列融合或缺失部分序列或部分核苷酸突變後的且可編碼與BCSP31、sodC和L7/L12具有相同活性蛋白的核苷酸序列，分別克隆到真核細胞表達載體中，將得到的至少兩種重組表達載體進行混合得到的混合物。本發明的布魯氏桿菌核酸疫苗可用於人畜布魯氏病的預防。
文檔編號C12N15/79GK101020064SQ20071006481
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月27日 優先權日2007年3月27日
發明者蔡宏, 朱玉賢 申請人:北京大學