生物傳感電極的製作方法

2023-04-29 06:39:41

本實用新型屬於生物傳感技術領域，涉及一種用於鑑別魚卵、魚苗、成魚、魚肉及其製品的所屬物種的檢測裝置，特別涉及一種生物傳感電極。

背景技術：

根據FISHBASE統計，全球現生魚類物種多達28，872種，約佔已命名脊椎動物物種數目的一半。由於魚類種類繁多，且多個門類中存在不少形態相似的物種，並能夠通過種間雜交，產生新的雜交物種，使得魚類物種的形態學鑑定難度較大，即使是有經驗的分類學者，也時有誤判。

DNA是生物體的遺傳分子，具有高度的物種特異性，基於DNA序列開展物種鑑定，準確程度高，不受個體年齡、發育時期和形態的影響，還能夠用於魚肉、魚子醬及其他加工產品的物種來源檢測，因而在科學研究、環境保護、水產品質量安全檢測中都具有廣泛的應用前景。

目前常見的魚類物種DNA鑑定技術均以聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)為基礎。DNA條形碼技術需要對PCR擴增產物進行測序，成本高且耗時較長；擴增片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等檢測則需要進行電泳，所用試劑對人體健康具有一定的危害性，並可能造成潛在的環境汙染，例如瓊脂糖凝膠電泳使用的DNA指示劑溴化乙錠(ethidium bromide，EB)具有致癌性。

綜上所述，有必要開發新的檢測裝置，實現魚類物種鑑定中對PCR擴增產物的清潔、快速檢測。

技術實現要素：

本實用新型的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，並提供至少後面將說明的優點。

本實用新型還有一個目的是提供一種生物傳感電極。

本實用新型提供的技術方案為：

一種生物傳感電極，包括：

基底層，其上印刷有工作電極、對電極和參比電極；

第一樣品池，其設置於所述基底層的上方，並與所述基底層之間形成有容納液體的第一容置空間，且所述工作電極、對電極和參比電極的工作端位於所述第一容置空間內；

第二樣品池，其也設置於所述基底層的上方，並可拆卸地固定於所述第一樣品池內，當所述第二樣品池固定入所述第一樣品池內時，所述第二樣品池與所述基底層之間形成容納液體的第二容置空間，且所述工作電極的工作端位於所述第二容置空間內。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述基底層上，所述工作電極的印刷漿料為金，且表面修飾有帶負電荷的納米金顆粒和生物素結合分子。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述基底層上，所述對電極的印刷漿料為鉑。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述基底層上，所述參比電極的印刷漿料為銀或氯化銀。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述基底層上，還印刷有與所述工作電極、對電極和參比電極分別連接的導線，所述導線的印刷漿料為銀或銅。

優選的是，所述的生物傳感電極，還包括：

絕緣蓋，其蓋合在所述基底層的上方，第一樣品池形成於所述絕緣蓋上，所述絕緣蓋由絕緣材料製成。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述絕緣蓋的厚度為2-5mm，在豎直方向上，所述第二樣品池的高度高於所述絕緣蓋。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述絕緣蓋和所述第二樣品池均由聚氯乙烯材料製成。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述基底層由絕緣材料製成，所述絕緣材料為聚對苯二甲酸二乙酯。

優選的是，所述的生物傳感電極中，所述生物素結合分子為親和素。

本實用新型至少包括以下有益效果：

本實用新型提供了一種生物傳感電極，能夠捕獲同時帶有電化學活性分子標記和生物素標記的DNA分子，與電壓輸出及信號採集裝置相連接，如電化學工作站，構成電化學生物傳感器，用於物種特異性PCR擴增產物的檢測，目標分子的捕獲和電化學信號檢測可在60min內完成，與測序法相比操作簡單、反應快速。

本實用新型所述生物傳感電極檢測操作中，包括樣品前處理操作，全程不涉及任何有毒有害試劑，不存在人身健康或環境汙染隱患，與電泳法相比安全、清潔。

本實用新型的其它優點、目標和特徵將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本實用新型的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

附圖說明

圖1為本實用新型中生物傳感電極的俯視示意圖；

圖2為本實用新型中生物傳感電極的側視示意圖；

圖3A為本實用新型中基底層的結構示意圖；

圖3B為本實用新型中絕緣蓋的結構示意圖；

圖3C為本實用新型中樣品池轉換扣的結構示意圖；

圖4為本實用新型中生物傳感電極檢測信號DNA的循環伏安曲線，圖中細實線表示存在目標DNA時的樣品曲線，粗虛線表示不存在目標DNA時的樣品曲線。

具體實施方式

下面結合附圖對本實用新型做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

應當理解，本文所使用的諸如「具有」、「包含」以及「包括」術語並不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

如圖1～4所示，本實用新型提供一種生物傳感電極，包括：

基底層1，其上印刷有工作電極4、對電極5和參比電極6；

第一樣品池7，其設置於所述基底層1的上方，與所述工作電極4、對電極5和參比電極6的工作端相通，並與所述基底層1之間形成有容納液體的第一容置空間，三電極系統通過所述第一樣品池7接收電解液和待檢測樣品；

第二樣品池8，其也設置於所述基底層1的上方，並可拆卸地固定於所述第一樣品池7內，當所述第二樣品池8固定入所述第一樣品池7內時，所述第二樣品池8與所述基底層1之間形成容納液體的第二容置空間，且所述工作電極4的工作端位於所述第二容置空間內，所述工作電極4通過所述第二樣品池8接收對其進行修飾。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述基底層1上，所述工作電極4的印刷漿料為金，且表面修飾有帶負電荷的納米金顆粒和生物素結合分子。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述對電極5的印刷漿料為鉑。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述參比電極6的印刷漿料為銀或氯化銀。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述基底層1上，還印刷有與所述工作電極4、對電極5和參比電極6分別連接的導線，所述導線的印刷漿料為銀或銅。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極，還包括：

絕緣蓋2，其蓋合在所述基底層1的上方，第一樣品池7形成於所述絕緣蓋2上，所述絕緣蓋2由絕緣材料製成。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述絕緣蓋2的厚度為2-5mm，在豎直方向上，所述第二樣品池8的高度高於所述絕緣蓋2。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述絕緣蓋2和所述第二樣品池8均由聚氯乙烯材料製成。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述基底層1由絕緣材料製成，所述絕緣材料為聚對苯二甲酸二乙酯。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，該生物傳感電極中，所述生物素結合分子為親和素。

在本實用新型的其中一個實施例中，作為優選，第一樣品池7為長方形，第二樣品池8為圓形。

在本實用新型的其中一個實施例中，該生物傳感電極俯視示意圖如圖1所示，側視示意圖如圖2所示，該電極由基底層1、絕緣蓋2、樣品池轉換扣3組裝(包括第一樣品池7和第二樣品池8)而成。基底層1由絕緣材料表面印刷工作電極4、對電極5、參比電極6和導線構成。絕緣蓋2通過絕緣膠與基底層1緊密粘合，絕緣蓋2上留有長方形的第一樣品池7，在長方形的第一樣品池7中加入支持電解質時，支持電解質能夠與工作電極4、對電極5和參比電極6充分接觸。第二樣品池8嵌入長方形樣品池中，使圓形的第二樣品池8與長方形的第一樣品池7之間能夠互相轉換，在圓形的第二樣品池8中加入用於魚類物種鑑定的PCR擴增產物溶液時，產物溶液能夠與工作電極4充分接觸，並使溶液中同時帶有電化學活性分子標記和生物素標記的擴增產物被工作電極4所捕獲。電極各組件示意圖如圖3A、3B、3C所示。

本實用新型所述生物傳感電極工作時，通過導線連接電化學輸出和檢測設備，構成三電極兩迴路：即工作電極4和參比電極6構成一個迴路，用於測定工作電極4的電位；工作電極4和對電極5構成一個迴路，用於測量外加電壓下的電流大小。

本實用新型所述生物傳感電極出廠前，工作電極4表面預先修飾有帶負電荷的納米金顆粒，以及生物素結合分子，其中優選的是，修飾方法如下：

(1)向圓形的第二樣品池8中加入納米金溶液(Sigma，檸檬酸鈉還原氯金酸法製備，粒徑30nm)，+1.55V電位下沉積15min，靜置5min，吸出納米金溶液，加入滅菌去離子水清洗。

(2)向圓形的第二樣品池8中加入含10mMα-硫辛酸的乙醇溶液，活化電極20min，吸出α-硫辛酸溶液。

(3)向圓形的第二樣品池8中加入濃度為100g/L的EDC/NHS混合液，活化羧基10min，吸出EDC/NHS混合液。

(4)向圓形的第二樣品池8中加入濃度為0.2g/L的親和素，偶聯30min，吸出親和素溶液，加入滅菌去離子水清洗，在超淨臺內風乾。

本實用新型所述生物傳感電極用於魚類物種鑑定時，採用循環伏安法檢測，優選的是，向工作電極4和對電極5間施加0到+600mV三角波電位，掃速50mV/s，記錄3個循環中的第3個。

實施例1鑑定市售冰鮮三文魚刺身是否來源於大西洋鮭(S.salar)

1.基因組DNA提取

取肌肉組織約100mg，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒(天根DP324-03)，按照說明書步驟提取基因組DNA，溶於100μL滅菌去離子水，紫外分光光度計測定濃度。

2.PCR擴增

定製合成大西洋鮭特異性引物(上海生工)，上遊引物鹼基序列為ACTCTCCCCTACTACCCACCT，5』端帶有二茂鐵修飾，下遊引物鹼基序列為TGTCCTATCCCTGTGACCTCT，5』端帶有生物素修飾。

以基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系如下：

PCR程序為

3.PCR擴增產物捕獲

將PCR擴增產物溶液加入圓形的第二樣品池，37℃溫育30min，吸出PCR擴增產物溶液，加入pH 7.0Tris-EDTA緩衝液，洗脫3次，每次5min。

4.電化學信號檢測

取出樣品池轉換扣，向方形樣品池中加入pH7.0磷酸緩衝溶液作為支持電解質，測定生物傳感電極的循環伏安曲線，結果如圖4所示，細實線為大西洋鮭刺身樣品檢測曲線，呈現明顯的氧化還原峰，表明電極表面捕獲了二茂鐵標記的PCR擴增產物，粗虛線為虹鱒(O.mykiss)冒充大西洋鮭的刺身樣品檢測曲線，二茂鐵氧化還原峰不可見，表明電極表面不存在目標PCR擴增產物。

以上結果表明，本實用新型提供的生物傳感電極能夠應用於魚類物種鑑定中的PCR擴增產物檢測。

這裡說明的模塊數量和處理規模是用來簡化本實用新型的說明的。對本實用新型的生物傳感電極的應用、修改和變化對本領域的技術人員來說是顯而易見的。

儘管本實用新型的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本實用新型的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本實用新型並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。