一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法
2023-04-29 03:28:56
專利名稱：一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法
技術領域：
本發明屬海洋生物技術領域，涉及一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法。
背景技術：
滷蟲初孵無節幼體是水產苗種生產中極為重要的動物性活餌料，滷蟲成蟲體內內含有較高的蛋白質(50％～60％)、一定量的脂肪和高級不飽和脂肪酸、礦物質和維生素等，是許多水產動物苗種後期幼體和水族寵物的適口餌料，投餵滷蟲後期幼體對提高河蟹育苗成活率、改善水族寵物的體色十分有利。目前，國際上85％的海產經濟動物以滷蟲作為鮮活開口餌料。據有關專家對滷蟲、鮭、對蝦、扇貝等24種主要的水產養殖品種的生長特性、養殖方法、市場價格和市場潛力等14項指標的綜合測評，滷蟲增養殖的可行性評價僅次於鮭魚位居第二。
但是其在水產育苗和水產養殖中的應用還遠遠不能夠滿足要求。這主要是由於成蟲質量不穩定，某些滷蟲品系的孵化率太低而影響了其應用價值。目前在中國和前蘇聯一些國家，低孵化率滷蟲卵(某些品系滷蟲的孵化率只有30-50％)的儲量相當可觀。如果能將這一資源利用在某些品種的水產育苗上，部分或全部替代價格昂貴的高質量滷蟲卵，將在一定程度上緩解滷蟲卵緊張的矛盾，降低育苗成本，避免資源的浪費。但是目前還沒有相關技術能夠解決滷蟲孵化率低這個問題。而滷蟲孵化酶將有助於提高滷蟲的孵化率，解決低孵化率滷蟲卵的品質問題。另外，孵化酶的研究對控制動物的孵化率和孵化進程、進而控制其種苗養成率也具有十分重要的指導價值。進而，孵化率的控制又可為瀕危物種的保護、有益動物的增養殖以及有害動物的數量控制等研究提供一條有廣闊應用前景的技術路線。
發明內容
本發明目的是為克服現有滷蟲孵化技術的不足，提供一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法。
本發明的提取滷蟲孵化酶的方法或工藝先將滷蟲卵培養於海水中，待90％以上的滷蟲完成孵化時，經濾網收集濾液-孵化液；然後將硫酸銨加入其內，並攪拌使硫酸銨的飽和度為50-70％；再放入4℃冰箱中過夜沉澱，進而離心沉澱，並用緩衝液將沉澱完全溶解後，再在4℃下以蒸餾水在透析袋中進行透析脫鹽，將上述透析液進行冷凍乾燥，至樣品達到恆重，將乾粉取出後密封包裝即的得到滷蟲孵化酶粗品。
在此基礎上，為了對滷蟲孵化酶進行更深入的研究，本發明對滷蟲孵化酶粗品作了進一步純化將上述滷蟲孵化酶粗品用緩衝液溶解後上樣於陰離子交換柱層析，進行梯度洗脫，洗脫出的樣品用樣品自動收樣器收集，選取酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品；再將上述陰離子交換柱層析樣品用濃縮離心管進行濃縮，經凝膠過濾柱進行進一步純化。選取酶活性值最高的洗脫樣品即為滷蟲孵化酶純品。為了長期保存滷蟲孵化酶純品，將上述的溶液狀態的滷蟲孵化酶純品進行冷凍乾燥，最將取出密封包裝即獲得滷蟲孵化酶純品。
本發明是以高孵化率品系滷蟲為材料進行孵化酶的提取與純化，其方法及詳細步驟如下1.滷蟲卵的培養和孵化液的收集為了簡化操作流程，在工廠化運作中滷蟲卵通常培養於自然海水中。考慮到天然海水中含有一定量的鈣鎂離子，容易與後續的硫酸銨產生難溶性沉澱，所以在本發明中採用人工海水培養滷蟲卵。人工海水的配方為30g氯化鈉溶解在1000ml的蒸餾水中。將人工配製的海水在室溫下用充氣泵充氣半小時後加入滷蟲卵，在31℃、光照的條件下培養滷蟲卵。培養至90％以上的胚胎完成孵化時(約培養24h)，用濾網將人工海水過濾，得到的濾液即為孵化液。
2.滷蟲孵化酶粗品的製備將上述孵化液中加入固體硫酸銨，使硫酸銨的飽和度為50-70％，在加入硫酸銨的同時攪拌溶液以避免溶液中局部硫酸銨的濃度升高而導致蛋白質變性。然後，將此液體放在4℃冰箱中過夜沉澱，再用冷凍離心機以5000g離心30min(4℃)。將離心管中的上清液輕輕傾掉，離心管底部的沉澱用緩衝液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)完全溶解後，在4℃下以蒸餾水在透析袋中透析12h以脫鹽；將得到的透析液首先在-20℃冷凍後再用冷凍乾燥儀冷凍乾燥，冷凍條件為真空度達到80Pa，進行凍幹，至樣品達到恆重。將乾粉取出後密封包裝即為滷蟲孵化酶粗品。滷蟲孵化酶粗品即可以應用於養殖業以提高低孵化率品系滷蟲的孵化率。
但是，滷蟲孵化酶粗品不能滿足胺基酸序列分析研究內容的要求。因此，本發明對滷蟲孵化酶的粗品進行了進一步的純化，以便進一步為滷蟲孵化酶的深入研究提供基礎。以下步驟在粗酶的基礎上進行了純化。
3.陰離子交換柱層析將滷蟲孵化酶粗品用緩衝液溶解後上樣於陰離子交換柱層析，分別用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl的緩衝液(pH7.5)進行梯度洗脫，洗脫出的樣品用樣品自動收樣器收集，用紫外分光光度計測定在波長280nm處的各洗脫樣品的酶活性，該酶活性的大小用酶裂解酪蛋白而引起的光吸收(簡稱0D280)的大小來表示。具體操作步驟為取20μl酪蛋白溶液(5mg/ml)於1ml離心管中，加入20μl洗脫樣品，於35℃水浴中反應30min後，加入500μl三氯乙酸以終止反應。4℃靜置30min後，用冷凍離心機於4℃、5000g離心30min。吸出上清液用紫外分光光度計測定各洗脫樣品的0D280值，該值為此洗脫樣品的實驗值；對照組僅將上述的各洗脫樣品用50μl上述緩衝液替代，再測定對照組的0D280值，該值為對照值。將每個洗脫樣品的酶活性用「實驗值-對照值」表示；以洗脫樣品的順序為橫坐標，以每個洗脫樣品的酶活性值為縱坐標繪製酶活性曲線，選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品。
4.凝膠過濾柱層析再將上述陰離子交換柱層析樣品用濃縮離心管進行濃縮，經凝膠過濾柱進行進一步純化。將濃縮的陰離子交換柱層析樣品上柱後，用20mmol/LTris-HCl緩衝液(pH7.5)進行洗脫，洗脫出的組分用樣品自動收樣器收集，再用紫外分光光度計測定在280nm處各洗脫樣品的酶活性。具體操作與陰離子交換柱層析中所描述的步驟相同。選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品即為滷蟲孵化酶純品。
為了將滷蟲孵化酶純品長期保存，將上述的溶液狀態的滷蟲孵化酶純品進行冷凍乾燥，冷凍乾燥條件溫度下降到-54℃、真空度達到80Pa，進行冷凍乾燥，至樣品達到恆重，取出密封包裝即為滷蟲孵化酶純品。
上述所選用的滷蟲品系，要求其孵化率在70％-90％的範圍；滷蟲品系的孵化率越高，滷蟲孵化酶的得率越高。
為了進一步說明以上方法，以產地渤海灣的滷蟲品系(孵化率90％以上)作為實施例將人工配製的海水在室溫下用充氣泵充氣半小時後加入50g產地渤海灣的滷蟲卵，在31℃、光照的條件下培養滷蟲卵。培養至90％以上的胚胎完成孵化時，用濾網過濾人工海水，得到的濾液即為孵化液；上述孵化液中加入固體硫酸銨，使硫酸銨的終飽和度為67％，然後，將此液體放在4℃冰箱中過夜沉澱，再用冷凍離心機以5000g離心30min(4℃)，收集沉澱；用緩衝液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.5)完全溶解沉澱後，在4℃下以蒸餾水在透析袋中透析12h以脫鹽，將得到的透析液首先在-20℃冷凍後再用冷凍乾燥儀冷凍乾燥，冷凍條件為真空度達到80Pa，進行凍幹，至樣品達到恆重。將乾粉取出後密封包裝即為滷蟲孵化酶粗品。
將滷蟲孵化酶粗品用pH7.5的20mmol/L Tris-HCl緩衝液溶解後上樣於DEAE-sepharose Fast Flow(1cm×20cm)陰離子交換柱層析，用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl的20mmol/L的緩衝液(pH7.5)進行梯度洗脫，洗脫速度20ml/h，每個洗脫樣品的收集體積為2ml。用紫外分光光度計測定在280nm處各洗脫樣品的酶活性。最後繪製酶活性曲線，選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品。
離子交換柱樣品經過濃縮後上樣於Sephacryl凝膠過濾柱(1cm×50cm)進行進一步純化；用20mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH7.5)進行洗脫，流速為15ml/h，每個洗脫樣品的收集體積為2ml。用紫外分光光度計測定在280nm處的酶活性。繪製酶活性曲線後選取酶活性曲線上酶活性值最高的洗脫樣品作為凝膠過濾柱層析樣品。凝膠過濾柱樣品冷凍乾燥，冷凍乾燥條件真空度達到80Pa時，進行冷凍乾燥，至樣品達到恆重，取出密封包裝即為滷蟲孵化酶純品。
由於本發明採用了孵化率較高的滷蟲品系製備孵化酶，提高了酶的產量，而不同品系滷蟲間孵化酶的同源性很高，從高孵化率滷蟲品系製備的孵化酶完全可以應用於低孵化率滷蟲品系。方法中又以人工海水培養滷蟲，避免了天然海水中鈣鎂等重金屬離子與硫酸鹽產生的沉澱，同時也排除了天然海水中其他不明組分對孵化酶活性的影響。在此基礎上獲得的孵化液中其他蛋白質的種類與含量均極少，因此簡化了孵化酶的提取過程。本方法又採用了冷凍乾燥工藝，使本發明的整個提取工藝簡單規範，可操作性強，得率高，而且能夠長期保存；通過本發明獲得的滷蟲孵化酶可以大大提高低品質滷蟲的孵化率，充分利用滷蟲資源，大幅度降低海水養殖業的育苗成本，緩解生產需求中滷蟲供應的緊張局面。
權利要求
1.一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法，其特徵是先將滷蟲卵培養於海水中，待90％以上的滷蟲完成孵化時，經濾網收集濾液--孵化液；然後將硫酸銨加入其內，並攪拌使硫酸銨的飽和度為50-70％；再放入4℃冰箱中過夜沉澱，進而離心沉澱，並用緩衝液將沉澱完全溶解後，再在4℃下以蒸餾水在透析袋中進行透析脫鹽，將上述透析液進行冷凍乾燥，至樣品達到恆重，將乾粉取出後密封包裝即為滷蟲孵化酶粗品。
2.如權利1要求所述的一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法，其特徵是將上述滷蟲孵化酶粗品用緩衝液溶解後上樣於陰離子交換柱層析，進行梯度洗脫，洗脫出的樣品用樣品自動收樣器收集，選取酶活性值最高的洗脫樣品作為陰離子交換柱層析樣品，再將上述陰離子交換柱層析樣品用濃縮離心管進行濃縮，經凝膠過濾柱進行進一步純化，選取酶活性值最高的洗脫樣品即為滷蟲孵化酶純品。
3.如權利2要求所述的一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法，其特徵是將上述的滷蟲孵化酶純品進行冷凍乾燥，取出密封包裝得到能夠長期保存的滷蟲孵化酶純品。
4.如權利1要求所述的一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法，其特徵是所述海水為人工海水，其NaCl濃度為30‰。
5.如權利要求1所述的一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法，其特徵是所採用的緩衝液為20mmol/L Tris-HCl，pH7.5。
6.如權利3要求所述的一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法，其特徵是冷凍乾燥條件溫度下降到-54℃、真空度達到80Pa，進行冷凍乾燥至樣品達到恆重。
全文摘要
一種用滷蟲孵化液生產滷蟲孵化酶的方法。先將滷蟲卵培養於人工海水中，待90％以上的滷蟲完成孵化時，經濾網收集濾液一孵化液；然後將硫酸銨加入其內，並攪拌使硫酸銨的飽和度為50－70％；再放入4℃冰箱中過夜沉澱，進而離心沉澱，並用緩衝液將沉澱完全溶解後，再在4℃下以蒸餾水在透析袋中進行透析脫鹽，將上述透析液進行冷凍乾燥，至樣品達到恆重，即為滷蟲孵化酶粗品。再經過陰離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析純化得到滷蟲孵化酶純品。該發明採用冷凍乾燥技術，工藝簡單合理，且能充分利用廢棄的滷蟲孵化液為原材料，製成的滷蟲孵化酶可溶性好，成本低，且能夠長期保存，可應用於提高低孵化率滷蟲品系的孵化率，降低海水養殖業的育苗成本。
文檔編號C12N9/00GK1699561SQ20051004346
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月5日 優先權日2005年5月5日
發明者史振平, 叢日山, 樊廷俊 申請人:中國海洋大學