作用層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑的低分子量肽衍生物的製作方法

2023-04-29 10:51:21

專利名稱：作用層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑的低分子量肽衍生物的製作方法
技術領域：
本發明的目的是能起層粘連蛋白與巢蛋白之間相互作用(層粘連蛋白/巢蛋白相互作用)抑制劑作用的低分子量肽衍生物，其製備方法，由其製備的藥物組合物，以及所述肽衍生物在製備藥物和鑑定層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑中的應用。
層粘連蛋白(一種800kDa糖蛋白)與巢蛋白(一種160kDa糖蛋白)之間的相互作用被認為是基底膜合成與穩定中的決定性生物分子機制(Mayer，U.和Timpl，R.(1994)分子外基質裝配和結構(Extracellular Matrix Assembly and Structure)(P.D.Yurchenco，D.Birk and R.P.Mecham，Ed.)S.389-416，Academic Press，Orlando，FL)。巢蛋白與基底膜的所有主要成分例如含有γ1的層粘連蛋白同種型(關於命名參見Burgeson，R.E.；Chiquet，M.；Deutzmann，R.；Ekblom，P.；Engel，J.；Kleinmann，H.；Martin，G.R.；Meneguzzi，G.；Paulsson M.；Sanes，J.；Timpl，R.；Tryggvasson，K.；Yamada，Y.；Yurchenco，P.D.(1994)Matrix Biology 14；209-211)、膠原IV、基底膜聚糖和fibulin、以及它們各自的相關結構形成三元複合物的能力意謂著其承擔著聯繫、空間組織和穩定獨立的宏觀結構的功能(Fox，J.W.；Mayer，U.；Nischt，R.；Aumailley，M.；Reinhardt，D.；Wiedemann，H.；Mann，K.；Timpl，R.；Krieg，T.；Engel，J.；和Chu，M.-L.(1991)EMBO J.10，3137-3146)。
基底膜是高度特化的細胞外結構，其在控制細胞和組織功能、組織體系結構、組織相互作用、細胞生長、細胞轉化、細胞遷移以及組織特異性基因表達中行使重要功能(Adams，J.C.和Watt，F.M.(1993)Development 117，1183-1198)。用多克隆抗層粘連蛋白抗體進行的實驗已清楚地證明了層粘連蛋白/巢蛋白相互作用在功能性基底膜合成中的至關重要作用。所述抗體是通過用層粘連蛋白p1或重組製得的層粘連蛋白的巢蛋白結合結構域(γ1 III3-5)給兔子免疫接種而獲得的。通過使用層粘連蛋白P1或層粘連蛋白γ1 III3-5基質的親和色譜濃縮的抗體在抑制測定中顯示層粘連蛋白/巢蛋白相互作用的完全抑制。然而，這是基於抗體空間阻斷巢蛋白接近層粘連蛋白，所述抗體的結合區域位於層粘連蛋白的巢蛋白結合序列附近(Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885)。
在胚胎器官培養物中，所述抗體既抑制腎小管的發育、肺泡的形成，又抑制胚胎唾液腺的形態形成。這三個模型是依賴新基底膜無阻合成的代表性個體發育模型(Ekblom，P.；Ekblom，M.；Fecker，L.；Klein，G.；Zhang，H.-Y.；Kadoya，Y.；Chu，M.-L.；Mayer，U.；Timpl，R.(1994)Development 120；2003-2014)。
直接抗層粘連蛋白γ1鏈序列區域(與巢蛋白結合所必需的)的抗體也能夠抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用。然而，與上述抗層粘連蛋白抗體不同，該抑制是競爭性的，這是因為它們直接與巢蛋白競爭層粘連蛋白上的結合位點(WO98/31709)。
IgM亞類的單克隆抗體(抗層粘連蛋白P1 A6/2/4-DSM ACC2327；參見WO98/31709)在體外抑制粘連蛋白/巢蛋白相互作用，IC50為30nM。象上述多克隆抗層粘連蛋白抗體一樣，其在器官培養物中阻止了胚胎唾液腺的形態形成。這強調了粘連蛋白/巢蛋白相互作用的特異性、LE-4組件的重要性、以及層粘連蛋白γ1 III4結構域中鑑定出的序列區域在該相互作用中的重要性。
已經對層粘連蛋白的巢蛋白結合結構域進行了清楚的鑑定，並且在其位置、序列及其空間結構方面作了特徵描繪(X-射線晶體結構和NMR結構)(Gerl，M.；Mann，K.；Aumailley，M.；Timpl，R.(1991)Eur.J.Biochem.202；167-174.Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668.Stetefeld，J.；Mayer，U.；Timpl，R.；Huber，R.(1996)J.Mol.Biol.257；644-657)。其位於結構域γ1 III 4中層粘連蛋白γ1鏈短臂的″LE組件″(層粘連蛋白型表皮生長因子樣)內。″LE組件″是具有類似於EGF的複雜摺疊模式的50-60胺基酸結構基元，其具有4個二硫鍵連接(Bairoch，A.；(1995)細胞外結構域命名(Nomenclature ofextracellular domains).The SWISS-PROT Protein sequencedata bank.release 310.Engel，J.(1989)FEBS Letters 251；1-7)。
已經用得自小鼠EHS腫瘤的層粘連蛋白P1、得自人胎盤的層粘連蛋白2和層粘連蛋白4、以及得自果蠅的層粘連蛋白測定了巢蛋白對互補層粘連蛋白結構域的高親和力。該種屬重疊結合特異性的原因是，對於所研究的種屬，在γ1 III4結構域中存在非常高的序列同源性。當考慮整個結構域時，在人和小鼠之間存在97％同源性，在小鼠和果蠅之間存在61％同源性，在小鼠和Caenorhabditis elegans之間存在51％同源性(Pikkarinen，T.；Kallunki，T.；Tryggvasson，K.(1987)J.Biol.Chem.263；6751-6758.Chi，H.-C.；Hui，C.-F.(1989)J.Biol.Chem.264；1543-1550.Wilson，R.等人.(1994)Nature 36832-38.Pschl，E.；Mayer，U.；Stetefeld，J.；Baumgartner，R.；Holak，T.A.；Huber，R.；Timpl，R.(1996)EMBO J.155154-5159)。
除了對結合在完整三維結構上的巢蛋白的依賴性以外，還鑑定了位於結構域γ1 III4的S-S穩定環a和c中的明確序列區域。已鑑定出了5個必需胺基酸，其中4個位於環a的7胺基酸部分中，另一個是在環c中的酪氨酸側鏈(Mann，K.；Deutzmann，R.；Timpl，R.(1988)Eur.J.Biochem.178；71-80)。
J.W.Fox和R.Timpl(US5,493,008)公開了可衍生自γ1 III4結構域的適當區域、並且在特異性結合測定中完全抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合的合成肽。
據信，對巢蛋白的層粘連蛋白結合位點的高親和力結合需要與實際結合序列鄰近的環(環c)中的酪氨酸或組氨酸的相互作用。據假定該芳族相互作用是下述抑制作用和結果的先決條件即基於層粘連蛋白γ1 III3-5的3D結構IC50＜500nM的抑制作用，和在US專利5,493,008中描述的結構/功能關係結果。然而，對於環c是否與巢蛋白直接相互作用，或者其是否有助於穩定NIDPNAV序列區域的適當空間結構的疑問仍然不清楚(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668.Stetefeld，J.；Mayer，U.；Timpl，R.；Huber，R.(1996)J.Mol.Biol.257；644-657)。
層粘連蛋白/巢蛋白相互作用受強構象成分的影響(Mayer，U.；Nischt，R.；Pschl，E.；Mann，K.；Fukuda，K.；Gerl，M.；Yamada，Y.；Timpl，R.(1993)EMBO J.12；1879-1885.Mann，K.；Deutzmann，R.；Timpl，R.(1988)Eur.J.Biochem.178；71-80)。可衍生自層粘連蛋白的巢蛋白結合位點的合成肽不能形成如在LE組件中存在的二硫鍵合模式，但是它們在抑制測定中顯示出比完整層粘連蛋白P1或層粘連蛋白γ1 III3-5弱約400-10,000倍的活性(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.J.W. Fox和R.Timpl；US5,493,008)。這種活性降低是不尋常的，因為已知肽在水溶液中可呈現無數種不同構象，並且發現只有一定百分比的肽呈生物活性構象。迄今為止所描述的最有活性的肽(IC50為22nM)具有約2700Da的分子量(＝LE組件的約50％)。其包含完整的S-S環，據假定該環穩定必需的NIDPNAV序列區域的結構(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.J.W.Fox and R.Timpl；US5,493,008)。
序列NIDPNAV(Asn-Ile-Asp-Pro-Asn-Ala-Val)的化學式如下所示 層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑適於製備用於治療與基底膜的增加或不良合成有關的疾病的藥物。
這樣的疾病是例如伴有基底膜增厚(尤其是在腎、眼睛、血管系統中)的所有類型的糖尿病晚期併發症，特徵是竇狀隙中持續基底膜合成的肝臟纖維變性、尤其是酒精中毒性肝臟纖維變性和由其引起的毛細管化，其中可觀察到基底膜或基底膜成分合成增加的所有纖維組織形成(慢性或醫原性)(腎、肺、皮膚)，特徵是脂質代謝的調控受限制的動脈粥樣硬化，這可能特別是由於經由部分毛細管化的肝臟竇狀隙引起的脂蛋白受損滲入引起的(可在動脈粥樣硬化中觀察到的該血管系統病變還可能部分由於血管基底膜的組成和結構發生改變所致)，其中血管生成導致臨床圖像變質的疾病，例如其中腫瘤生長需要新血管生成的癌症，糖尿病性視網膜病、晶狀體後纖維組織形成、具有強炎性成分的疾病(例如類風溼性關節炎、骨關節炎、結節性脈管炎)、血管瘤、牛皮癬、以及其它疾病。
然而，象在US5,493,008中描述的,肽作為藥物的應用非常有限，因為它們具有構象柔性、對蛋白酶不穩定、並且生物利用度和藥效學特性不佳(Milner-White，E.J.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10；70-74.Verber，D.F.；Freidinger，R.M.；(1985)Trends Neurosci.8；392-396.Hruby，V.J.(1994)inPeptides，Proc.Thirteenth American Peptide Symposium；(Hodges，R.S.；Smith，J.A.；Ed.)S.3-17；ESCOMLeiden，Nether lands)。
因此，本申請的目的是發現低分子量肽衍生物，它們能特異性地與巢蛋白的層粘連蛋白結合位點相互作用，並以低濃度競爭性地抑制層粘連蛋白與巢蛋白的結合。
因此，本發明的目的是式I化合物 其中R1是其中一個下式所示基團其中R4表示-A、-NH2、-NHR、-NR2、A2、-NHR1、 且R5表示-(CH2)1COOA、-(CH2)1CONH2、-(CH2)1NH2或-(CH2)1-SO3H、 且X是其中一個下式所示基團 其中Y表示O、S、-N(A)-CO-或-(CH2)r-，D表示(CH2)r、O、S、NH、NR、(CH2)r-O、(CH2)r-S、(CH2)r-NH或(CH2)rNR，且R2表示-A、-E-OH、-E-COOH或-E-CONH2，其中E表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基鏈，該烷基鏈未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，或者E表示C5-C10-環烷基，該環烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，且R3是其中一個下式所示基團 其中R6表示-H、-COOH、-CONH2、-CONHR、-CONR2、-CH2OH或 其中R7表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基，該烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，或者R7表示C5-C10-環烷基，該環烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，且R表示直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環烷基、Het或Ar，所述基團可任選被一個或多個滷素、C1-C6-烷氧基、直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環烷基或-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代，其中Het表示單環或二環5元-10元芳族或非芳族環，該環包含1或2個相同或不同的選自氮、氧和硫的雜原子作為所述環的成員，並且未取代或者被一個或多個羥基或羧基取代，Ar表示單環或二環5元-10元芳環，該環未取代或者被一個或多個羥基或羧基取代，Z表示(CH2)m、O、S、NH、NR、N-C(O)-R或NSO2R，A表示H或C1-C4-烷基，l、m和r是0-3的整數，n和k是1-2的整數，p是0-1的整數，q是1-3的整數，其中所述化合物是所有其立體異構體和所有比例的立體異構體混合物，並包括它們的所有生理可耐受鹽。
生理可耐受鹽是例如無機酸和有機酸的鹽，例如鹽酸、硫酸、乙酸、檸檬酸、或對甲苯磺酸的鹽，或無機鹼和有機鹼的鹽，例如NH4OH、NaOH、KOH、Ca(OH)2、Mg(OH)2、二乙醇胺或乙二胺的鹽，或胺基酸的鹽，例如精氨酸、賴氨酸、賴氨醯賴氨酸或穀氨酸的鹽。
本發明的一個優選實施方案是其中n為1的式I化合物。
進一步優選的實施方案是這樣的式I化合物，其中基團X中的R表示Het或Ar，所述Het或Ar可任選被-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代。基團X中的R更優選為Het。例如，Het表示 本發明優選的實施方案還是這樣的式I化合物，其中基團X中的R表示Ar，所述Ar可任選被-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Ar或Ar取代。基團X中的R優選表示Ar。
例如Ar表示 優選的實施方案還是這樣的式I化合物，其中基團X中的R表示 在式I化合物中，X優選為下式所示基團 Y優選為-(CH2)r，其中r優選為0或1，且k優選為1或2。
本發明進一步優選的實施方案是這樣的式I化合物，其中基團X是下式所示基團 其中D優選為-(CH2)r-，其中r優選為0或1。
還優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R是下式所示基團 其中Z優選表示(CH2)m，且m是0或1。 R5優選表示-(CH2)1-COOA，其中A優選表示H，或者R5表示-(CH2)1-COONH2，其中l是0。R4優選表示-NH2或-A，其中A優選表示H，或者R4優選表示-NHR1，其中-NHR1優選表示 且其中-NHR1的R5優選表示 且1優選為0，或者-NHR1的R5優選表示 且1優選為0，或者-NHR1的R5優選表示(CH2)1-NH2，且l優選為0。
進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R1是下式所示基團 其中Z優選表示-(CH2)m-，且m優選為1，R4優選表示-NH2，且R5優選表示-(CH2)1-COOA，其中l優選為0，且其中A優選表示H。
進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R1是下式所示基團 其中R5優選表示-(CH2)1-COOA，其中l優選為0，且其中A優選表示H。
進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R2表示A，且A優選表示-CH3，或者其中R2表示-E-COOH，優選為-CH2-COOH，或者其中R2表示-E-OH，優選為-CH2-OH。
進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團 其中k優選為2。
進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團 進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團 其中R7優選為支鏈C1-C10-烷基，優選為-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CH(CH3)CH2-CH3或-CH2-CH(CH3)2，且其中R6優選表示-H、-COOH、-CONH2、-CH2OH、-CON(CH3)2，或者R更優選表示 其中q優選為2。
進一步優選的本發明實施方案是這樣的式I化合物，其中R3是下式所示基團表示 其中R7優選-CH(CH(CH3)2)2或-CH2C(CH3)3。
本發明化合物是非天然(即不是天然生成的)、低分子量肽衍生物，其能在nM濃度範圍內抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用。令人驚奇的是，已經發現，這些低分子量結構能以高親和力結合到巢蛋白的層粘連蛋白結合位點上，同時不需要與實際結合序列鄰近的環(環c)中的酪氨酸或組氨酸相互作用。
更令人驚奇的是，在本發明中描述的分子量為550-800Da的低分子量肽衍生物表現出與下述迄今為止所描述的最有活性的肽(IC50為22nM)相同數量級的抑制作用具有約2700Da的分子量(＝LE組件的約50％)，包含完整的S-S環，據假定該環穩定必需NIDPNAV序列區域的結構(J.W.Fox and R.Timpl；US5,493,008)。
根據巢蛋白結合位點的結構/功能關係和公開的三維結構，通過在樹脂載體上特定合成肽衍生物實現了本發明目的。用於肽合成的構件隨合適標準而變，以保證非天然構件的廣泛結構多樣性和集成。使用合適的靈敏篩選測定來測定和比較從樹脂載體上分離下來的所得肽衍生物的抑制活性。
本發明化合物可用於製備用於治療與基底膜的增加或不良合成有關的疾病的藥物。
因此，本發明肽衍生物和/或其生理可耐受鹽的可能治療應用領域是1.伴有基底膜增厚(尤其是在腎、眼睛、血管系統中)的所有類型的糖尿病晚期併發症。2.特徵是竇狀隙中持續基底膜合成的肝臟纖維變性，尤其是酒精中毒性肝臟纖維變性，和由其引起的毛細管化。3.其中可觀察到基底膜或基底膜成分合成增加的所有纖維組織形成(慢性或醫原性)(腎、肺、皮膚)。4.特徵是脂質代謝的調控受限制的動脈粥樣硬化，這可能特別是由於經由部分毛細管化的肝臟竇狀隙引起的脂蛋白受損滲入引起的。可在動脈粥樣硬化中觀察到的該血管系統病變還可能部分由於血管基底膜的組成和結構發生改變所致。5.其中血管生成導致臨床圖像變質的疾病，例如其中腫瘤生長需要新血管生成的癌症、糖尿病性視網膜病、晶狀體後纖維組織形成、具有強炎性成分的疾病(例如類風溼性關節炎、骨關節炎、結節性脈管炎)、血管瘤、牛皮癬、以及其它疾病。
因此，本發明化合物和/或其生理可耐受鹽適於用作藥物。所以本發明的進一步目的是含有至少一種本發明肽衍生物和/或其生理可耐受鹽的藥物組合物。
可依據本發明將式I化合物和/或其生理可耐受鹽可作為治療或預防藥物施用給動物優選哺乳動物，特別是人。它們可以以自身的形式給藥，在彼此混合物中給藥，或者以經腸或非胃腸道給藥用藥物製劑的形式給藥，所述製劑包含有效劑量的至少一種式I化合物和/或其生理可耐受鹽以及衍生物作為活性成分和常規可藥用無毒賦形劑和/或添加劑。
藥物可系統或局部施用。藥物可以以例如丸劑、片劑、膜包衣片劑、糖包衣片劑、粒劑、硬和軟明膠膠囊劑、粉劑、溶液、糖漿劑、乳劑、懸浮劑或其它藥物劑型的形式給藥。然而，給藥還可以經陰道或直腸進行，例如以栓劑的形式陰道或直腸給藥，或者以例如注射液或輸液、微膠囊或貯藥柱的形式非胃腸道給藥或植入給藥，或者以例如軟膏劑、溶液或酊劑的形式局部給藥或經皮給藥，或者以其它途徑給藥，例如以鼻用噴霧劑或氣霧劑混合物的形式給藥，或作為可吸入乾粉製劑給藥。如果溶液是非胃腸道給藥的，它們可通過例如靜脈內、肌內、皮下、關節內、滑膜內或其它方式例如吸入溼氣霧劑或乾粉製劑給藥。
本發明藥物製劑可按照其自身已知的方法製備，除了式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物以外，還可以使用藥物惰性無機和/或有機賦形劑。為了製備丸劑、片劑、糖包衣片劑和硬明膠膠囊，可使用例如乳糖、玉米澱粉或其衍生物、滑石粉、硬脂酸或其鹽等。軟明膠膠囊劑和栓劑的賦形劑有例如脂肪、蠟、半固體和液體多元醇、聚乙二醇，天然或硬化油等。為了製備溶液例如注射液、或乳劑或糖漿劑，合適的賦形劑是例如水、醇、甘油、二醇、多元醇、蔗糖、轉化糖、葡萄糖、植物油等。對於微膠囊、植入物或貯藥柱，合適的賦形劑是例如乙醇酸與乳酸的共聚物。藥物賦形劑通常含有大約0.5-90％的式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物。
除了活性化合物和賦形劑以外，本發明藥物製劑還可以含有輔料或添加劑，例如填充劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、潤溼劑、穩定劑、乳化劑、防腐劑、甜料、著色劑、矯味劑或香料、增稠劑、稀釋劑、緩衝物質、溶劑或助溶劑、獲得貯藥效果的裝置、改變滲透壓的鹽、包衣劑或抗氧化劑。本發明藥物製劑還可以含有兩種或兩種以上的式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物。此外，除了至少一種式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物以外，本發明藥物製劑還可以含有其它治療或預防活性物質。本發明藥物製劑通常每劑含有0.2-500mg、優選1-100mg式I化合物和/或其生理可耐受鹽和衍生物。
如果式I化合物或含有它們的藥物製劑是作為氣霧劑例如鼻用氣霧劑給藥，或通過溼氣霧劑或乾粉吸入給藥，可分別使用噴霧器、霧化器、泵式噴灑器、吸入裝置、計量吸入器或乾粉吸入器給藥。用於將式I化合物作為氣霧劑給藥的藥物劑型可通過本領域技術人員眾所周知的方法製備。對於其製備，例如在使用常規添加劑例如苯甲醇或其它合適防腐劑、提高生物利用度的吸收增強劑、助溶劑、分散劑等、和如果適當的話常規推進劑例如氯氟烴和/或氟烴的式I化合物在水、水-醇混合物或適當鹽水溶液中的溶液或分散液是合適的，而式I化合物和/或其生理可耐受鹽的乾粉製劑可通過將式I化合物和/或其生理可耐受鹽與合適水溶性添加劑例如糖或糖衍生物和胺基酸的水溶液冷凍乾燥或優選噴霧乾燥而製得。
當使用式I化合物時，劑量可在寬的限度內變化，並且如醫師所知道的那樣，通常在每一個體病例中對於具體病症使用特定劑量。劑量取決於所治療疾病的性質和嚴重程度、所用的化合物、或者所治療或預防的是急性還是慢性疾病、或者除了式I化合物以外是否還施用其它活性化合物。通常，對於口服給藥，為了獲得有效結果，在成人中約0.01-100mg/kg、優選0.1-10mg/kg、特別是0.3 to 2mg/kg(每kg體重)的日劑量是適當的。對於靜脈內給藥，日劑量為約0.01-50mg/kg、優選0.01-10mg/kg體重。特別是當使用較大劑量時，日劑量可分多次，例如2、3或4次施用。如果適當的話，根據個體特性，可能需要超出所指出日劑量範圍的上限和下限。
此外，本發明式I化合物及其鹽可用作製備可由式I化合物製得的其它化合物、特別是其它藥物活性化合物的中間體，例如，所述其它化合物可通過例如將官能團酯化、還原、氧化或其它轉化，修改或引入基團或功能基，由式I化合物製得。
因此，一方面，本發明肽衍生物可直接用作治療劑，但是它們也可形成適於用作治療與基底膜的增加或不良合成有關的疾病的治療劑的相關結構的基礎。
本發明的另一目的是鑑定抑制層粘連蛋白與巢蛋白相互作用的化合物的方法，其中使用本發明化合物作為競爭性抑制劑。該方法還包括以可藥用形式鑑定的化合物的製劑。
本發明的目的還是，提供製備包含經鑑定能抑制層粘連蛋白與巢蛋白相互作用的化合物的藥物組合物的方法，其中使用本發明化合物作為競爭性抑制劑，並將所鑑定的化合物和/或其生理可耐受鹽與可藥用載體混合。
本發明的目的還是提供製備本發明式I化合物的方法。
本發明式I化合物 是通過將式II化合物 與III化合物進行片段縮合而製得的 其中變量R1、X、n、R2和R3具有上述含義，並且可通過肽化學中的已知常用保護基將式II和III化合物在如上所定義的官能團上保護(參見例如Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie，vol.15/1和15/2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。合適的縮合方法是本領域眾所周知的(Houben-Weyl，Methoden der OrganischenChemie，vol.15/1和15/2，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)。合適的縮合劑或偶合劑有例如羰基二咪唑、碳二亞胺例如二環己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺、或O-((氰基(乙氧基羰基)亞甲基)氨基)-N，N，N』，N』-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)或焦磷酸酐(PPA)。該縮合反應可在標準條件下進行。在肽縮合期間，通常用易於在不同於偶合條件的條件下除去的保護基將不打算參與偶合反應的氨基保護。這同樣適用於不打算參與偶合反應的羧基，優選在偶合反應期間將羧基作為C1-C6-烷基酯、苄基酯或叔丁基酯保護。對於仍然以氨基前體例如硝基或氰基形式存在的氨基，無需將該氨基保護。縮合反應後，通過水合步驟形成氨基。縮合步驟後，通過已知的合適方法除去保護基，例如苄氧基羰基和苄基可通過在苄基酯中水合來除去；叔丁基酯的保護基一般是在酸性條件下除去；9-芴基甲氧基羰基殘基是通過仲胺除去。
本發明式I化合物的製備還可以通過各成分例如天然、非天然胺基酸及其衍生物在固相上的分步加成來進行，這樣各成分可以以多種不同順序加上。
為了製備式I化合物，還有利的是，不通過片段縮合將式I和II化合物直接偶合，而是偶合它們各自適當的前體，以獲得可通過例如衍生化轉化成式I化合物的中間體。
不是直接，而是通過其各自前體將官能團引入到分子中，以獲得可易於在縮合反應後通過將前體基團轉化成各自的官能團來製得終產物的中間體的上述方法也可用於製備式I化合物分子的不同部分，例如式I化合物的R1-或R1-X-側鏈。
實施例縮寫具有下述含義試劑和溶劑AcOH乙酸aq 含水BSA 牛血清白蛋白DCC N，N』-二環己基碳二亞胺DCM 二氯甲烷DIPEA N，N-二異丙基乙胺DMAP4-二甲基氨基吡啶DMF N，N-二甲基甲醯胺DMSO二甲亞碸Et2O 乙醚EtOAc醋酸乙酯(乙酸乙酯)EtOH 乙醇Fmoc-OSucc Fmoc-O-琥珀醯亞胺HOBT 1-羥基苯並三唑KHMDS六甲基二矽氮烷基鉀n-Buli 正丁基鋰MeOH 甲醇MTBE 甲基叔丁基醚TEA 三乙胺TFA 三氟乙酸THF 氫呋喃TMEDA甲基乙二胺TMSCI三甲基甲矽烷基氯TOTU O-((氰基(乙氧基羰基)亞甲基)氨基)-N，N，N』，N』-四甲基脲四氟硼酸鹽TrisN3三甲矽烷基疊氮化物化學基團Me 甲基 CH3-Et 乙基 CH3-CH2-nPr 丙基 CH3CH2CH2-iPr 異丙基 (CH3)2CH-nBu 正丁基 CH3CH2CH2CH2-iBu 異丁基 (CH3)2CHCH2-tBu 叔丁基 (CH3)3C-Ph 苯基 C6H5-Fmoc 9-芴基甲氧基羰基Z苄氧基羰基 C6H5-CH2-O-CO-BOC 叔丁氧基羰基 (CH3)3C-O-CO-1.篩選層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑的庫設計庫來找到更小的、效力更強的、且代謝更穩定的與現有技術已知的庚肽NIDPNAV有關的肽(Pschl，E.；Fox，J.W.；Block，D.；Mayer，U.；Timpl，R，(1994)EMBO J.13；3741-3747.Pschl，E.；Mayer，U.；Stetefeld，J.；Baumgartner，R.；Holak，T.A.；Huber，R.；Timpl，R.(1996)EMBO J.155154-5159.Baumgartner，R.；Czisch，M.；Mayer，U.；Pschl，E.；Huber，R.；Timpl，R.；Holak，T.A.(1996)J.Mol.Biol.257；658-668)。將庫作為三個子庫來合成和篩選；五聚物、六聚物和七聚物。下面描述五聚物子庫的篩選策略。該方法代表了篩選其它兩個子庫所用的方法，只是在第一個步驟中，以約50個珠子/孔篩選六聚物，以約100個珠子/孔篩選七聚物。1.1篩選五聚物庫該五聚物庫含有2,160種不同化合物。1)將約8,800個珠子懸浮在0.1％HCl中，並以大約14個珠子/孔分配到7個濾底96孔微量滴定板內。2)將珠子用200μl去離子水洗滌2次，然後加入50μl 500mMHEPES，pH7.0。當pH增加至7.0時，在該庫中使用的接頭釋放1等分試樣的化合物，過夜進行該分裂步驟。3)將平板堆積在U-底濾板的頂部並離心。從珠子上釋放下來的化合物的混合物收集在底部板上，而相應的珠子保留在最初的濾板中。4)每孔中向珠子加入25μl DMSO以將剩餘化合物從珠子上洗下來，並將平板再次離心以將溶液中的化合物與珠子分離開。所得貯備液大概在333mM HEPES，33％DMSO中含有27μM化合物。5)將化合物貯備液與巢蛋白一起預培養(10μl化合物貯備液/90μl巢蛋白溶液)，進行在附加方案中描述的測定，獲得2.7μM化合物的最終篩選濃度。6)在其中可重複抑制≥62％的25個測定孔中，將得自最初濾板的相應珠子懸浮在0.05％HCl，0.1％吐溫20中，並以1個珠子/孔吸移到5個新的濾板中。向每個板中加入兩個在相同接頭上有母化合物的對照珠子以用作對照。7)將珠子用200μl去離子水洗滌2次，然後向每個孔中加入25μl50mM NaOH。當pH從7.0增加至10.0或更高時，在該庫中使用的接頭釋放第二份等摩爾等分試樣的化合物，該分裂步驟進行3小時。8)將平板堆積在U-底濾板的頂部並離心。從珠子上釋放下來的化合物的混合物收集在底部板上，而相應的珠子保留在最初的濾板中。9)將珠子用20μl加入50mM HCl的50mM HEPES(最初pH7.0)洗滌，將該溶液離心到下層板中，並與第一次的釋放物合併。10)將珠子用25μl DMSO進行第3次洗滌，其中是將DMSO與珠子平衡10分鐘，然後離心。11)如步驟#5所述，以1/10的體積測定所得釋放物。12)抑制作用與對照珠子(約50％抑制)一樣好或者更好的溶液認為是hit。收集到了23個hit珠子，其它2個潛在的hit孔可通過在單個孔中添加的弱抑制劑來解釋。13)將Hit溶液進行質譜分析，以測定分子量。14)將相應的各hit珠子進行Edman降解以測定肽序列。15)分析合併的MS和Edman數據以鑑定hit化合物結構。
其結構和回收頻率如下所示。G-Hopa＝甘氨酸羥基丙基醯胺，剩餘接頭頻率 IC50，μM6 DNal2 N D VG-Hopa 0.434 DNal2 N A VG-Hopa 0.374 DNal2 N D IG-Hopa 0.644 DNal2 N S VG-Hopa 0.493 DNal2 N S IG-Hopa 0.812 DNal2 N A IG-Hopa 0.47圖例文字Nal2＝L-3-(2-萘基)丙氨醯基 G-Hopa＝甘氨酸-3-羥基丙基醯胺 D＝Asp(天冬氨醯基)，P＝Pro(脯氨醯基)，N＝Asn(天冬醯胺醯基)，A＝Ala(丙氨醯基)，V＝Val(纈氨醯基)，S＝Ser(絲氨醯基)，I＝Ile(異亮氨醯基).1.2方法製備肽庫使用標準固相肽Fmoc化學(Stewart，J.M.，and Young，J.D.(1984)Solid Phase Peptide Synthesis.Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.；Atherton，E.，and Sheppard，R.C.(1989)Solid Phase Peptide Synthesis.IRL Press Oxford)，通過分裂/混合合成方法合成肽庫(Lam，K.S.，Salmon，S.E.，Hersh，E.M.，Hruby，V.J.，Kazmierski，W.M.，and Knapp，R.J.(1991)Nature 354，82；Furka，A.，Sebestyen，F.，Asgedom，M.，andDibo，G.(1991)Int.J.Pept.Protein Res.37，487)。在每一偶合循環中，將每個樹脂珠子僅暴露於一種活化的胺基酸。因此，在庫合成完成時，每個樹脂珠子僅表達一個肽實體。因為不能單獨測定所有化合物，我們通過差別可分裂接頭在每個樹脂珠子上以一式兩份構建相同結構，fig.1(Kocis，P.，Krchnak，V.，和Lebl，M.(1993)Tetr.Lett.34，7251；Lebl，M.，Krchnak，V.，Salmon，S.E.，和Lam，K.S.(1994)A Companion to Methods inEnzymolog 6，381)。然後可用不同分裂機制在順序步驟中將肽從樹脂珠子上釋放下來。在pH7-9的緩衝液中將第一部分肽作為羥基丙基醯胺釋放下來。使用更高pH將第二部分肽釋放下來(合成方案1)。
在肽庫中，使用聚乙二醇接枝的聚苯乙烯珠子或TentaGelSNH2。實際上，在含水條件下與肽合成和篩選相容的所有樹脂珠子都是適用的。
用一個固定位置(L-天冬醯胺)製備五聚物、六聚物、和七聚物庫。在C-末端上的甘氨酸羥基丙基醯胺是接頭的一部分。H-X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(2,160個肽)H-X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(25,920個肽)H-X6X5X4X3-Asn-X2X1-Gly-NH(CH2)3OH(311,040個肽)X1在第一個隨機化中使用的N-Fmoc-L-胺基酸(9)纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、β(2-萘基)丙氨酸、2-氮雜環丁烷甲酸、脯氨酸、環己基甘氨酸、苯基甘氨酸。X2在第二個隨機化中使用的N-Fmoc-L-胺基酸(4)丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸。X3＝X5＝X6在第三、五和六個隨機化中使用的N-Fmoc-L-胺基酸(12)2-哌啶酸、β(2-萘基)丙氨酸、穀氨酸、賴氨酸、2-氮雜環丁烷甲酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬醯胺、異亮氨酸、3，5-二碘酪氨酸、瓜氨酸、精氨酸。X4在第四個隨機化中使用的N-Fmoc-L-胺基酸(5)天冬氨酸、穀氨酸、2-氨基己二酸、O-硫酸酪氨酸、γ-羧基穀氨酸。
將樹脂(PEG-PS.HCl，Mill ipore，20g，裝載0.58mmol/g，平均粒徑220μm)在N，N-二甲基甲醯胺中膨脹2小時，然後用10％N，N-二異丙基乙胺在二氯甲烷中的溶液中和。用二氯甲烷和N，N-二甲基甲醯胺洗滌樹脂。用1，3-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯並三唑(各3eq)將接頭(Fig.1，3eq)在N，N-二甲基甲醯胺中於室溫偶合12小時。通過溴酚藍方法監測反應(Krchnak，V.，Vagner，J.，Safar，P.，和Lebl，M.(1988)Collec.Czech.Cem.Commun.53，2542)。通過茚三酮測試確定偶合完全(Kaiser，E.，Colescott，R.L.，Bossinger，C.D.，和Cook，P.I.(1969)Anal.Biochem.34，595)。用N，N-二甲基甲醯胺洗滌後，用50％哌啶在N，N-二甲基甲醯胺中的溶液處理15分鐘來除去Fmoc保護基。然後用N，N-二甲基甲醯胺洗滌樹脂，通過UV光譜測定法(302 nm)定量測定所釋放的富烯-哌啶加成物的量。在整個庫合成中，以該方法測定的穩定水平的樹脂裝載(mmol/g)用作一個質量控制標準。
將樹脂分成9個等份。然後將9份Fmoc-保護的胺基酸(X1)獨立地加到各樹脂等分試樣中，並通過所述方法偶合2小時。然後將樹脂匯集在在底部裝配有玻璃料的圓柱形玻璃容器中。通入乾燥氮氣以將樹脂混合。如上所述除去Fmoc保護基。
將樹脂分成4個等份。然後將4份Fmoc-保護的胺基酸(X2)獨立地加到各樹脂等分試樣中，並用相同偶合方法進行偶合。除去Fmoc保護基，並測定樹脂裝載。在下一循環中，通過所述方法偶合L-天冬醯胺。然後將樹脂分成等分試樣以進行另一偶合循環。所有隨機化步驟完成後，除去Fmoc，用三氟乙酸(82.5％)、茴香醚(5％)、水(5％)、茴香硫醚(5％)、乙二硫醇(2.5％)的混合物經由2.5小時裂解掉側鏈保護基。然後用三氟乙酸、二氯甲烷、N，N-二甲基甲醯胺和甲醇洗滌樹脂。將所得庫在4℃乾燥貯存。
為了檢查庫的質量，隨機選擇幾個珠子，通過Edman降解和質譜技術定序。 合成方案11.3結果(還參見附圖
2-12) 2.大規模合成2.1合成N-Fmoc-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸(A8)概述分10步製備N-Fmoc-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸(A8) 2.1.1反式-3-(2』-萘基)-丙烯酸乙酯(A1)向2-萘甲醛(7.8g，50mmol)在50mL乙醇內的溶液中加入(乙氧羰基亞甲基)三苯基正膦(18.3g，52.5mmol)。觀察到有輕微放熱。有沉澱形成，同時將該混合物攪拌過夜。將該反應混合物用Et2O(500mL)稀釋，並用1M H3PO4(2×100mL)、飽和NaHCO3(1×100mL)、水(100mL)、和鹽水(100mL)洗滌。將有機部分乾燥(MgSO4)，並減壓濃縮。將殘餘物過SiO2塞，用9∶1己烷EtOAc洗脫。真空濃縮後，以接近定量的收率收集到了產物，為85∶15的幾何異構體混合物(反式佔優勢，nmr)。將產物從己烷/EtOAc(己烷佔大部分)中重結晶，收集到了4.5g所需產物，為97∶3的異構體混合物(nmr)。將母液濃縮，並如前所述重結晶，又收集到了2.9g(總共7.4g，33mmol，收率65％)。NMR(CDCl3)δ7.93(s，1H)；7.88-7.83(c，4H)；7.67(dd，1H，J＝1.6，8.6Hz)；7.53-7.50(c，2H)；6.55(d，1H，J＝16.0Hz)；4.30(q，2H，J＝7.1Hz)；1.42(t，3H，J＝7.1Hz).2.1.2反式-3-(2』-萘基)-丙烯酸(A2)向酯A1(4.24g，18.8mmol)在THF(75mL)內的溶液中加入在水(19mL)中的LiOH.H2O(2.36g，56.3mmol)。將開始時呈多相的該混合物劇烈攪拌過夜，該混合物變均勻。用濃鹽酸將該反應混合物酸化(pH約為2)，形成了沉澱。將該多相混合物轉移到分液漏鬥中，並用EtOAc(3×150mL)萃取。將合併的萃取液乾燥(MgSO4)，並真空濃縮，收集到了該羧酸，為白色固體(3.66g，收率98％)。NMR(CDCl3)δ7.97(d，1H，J＝15.7Hz)；7.90(d，1H，J＝15.3Hz)；7.90-7.83(c，3H)；7.70(dd，1H，J＝1.6，8.6Hz)；7.57-7.50(c，2H)；6.58(d，1H，J＝16.0Hz)。2.1.3反式-(4S)-3-(3』-(2″-萘基)-丙烯醯基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A3)
將羧酸A2(3.66g，18.5mmol)和三乙胺(1.87g，2.56mL，18.5mmol)在無水THF(74mL)中的溶液冷卻至-78℃。用2分鐘加入新戊醯氯(2.35g，2.40mL，19.4mmol)，期間形成了白色沉澱。10分鐘後，將燒瓶置於0℃浴中放置10分鐘，然後將燒瓶再冷卻至-78℃，並保持1.5h小時。在一個單獨燒瓶中，將衍生自L-苯基甘氨醇的噁唑烷酮(3.31g，20.3mmol)在無水THF(74mL)中的溶液冷卻至-78℃。加入n-BuLi溶液(1.6M的己烷溶液，11.6mL，18.5mmol)，並繼續攪拌約1小時，從該THF/溶液中沉澱出了金屬化的噁唑烷酮。通過插管將該混合酸酐加到金屬化的噁唑烷酮中，並將該反應混合物置於0℃浴中。1小時後，移去該浴，將該混合物溫熱至室溫並保持過夜。用50mL飽和NH4Cl中止該反應。將THF減壓除去，轉移到分液漏鬥中，然後用CH2Cl2(3×75mL)萃取。將合併的有機部分用1MNaOH(2×50mL)洗滌，乾燥(MgSO4)並濃縮。將殘餘物從EtOAc/己烷中重結晶，收集到了白色固體(3.87g，11.2mmol，收率61％)。NMR(CDCl3)δ8.05(d，1H，J＝15.7Hz)；7.94(d，1H，J＝15.4Hz)；7.87-7.81(c，3H)；7.76(dd，1H，J＝1.5，8.6Hz)；7.53-7.47(c，2H)；7.41-7.34(c，5H)；5.58(dd，1H，J＝8.7，3.9Hz)；4.76(t，1H，J＝8.7Hz)；4.33(dd，1H，J＝8.8，3.9Hz)。2.1.4(3』R4S)-3-(3』-(2″-萘基)-4』-戊烯醯基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A4)在-78℃，向CuI(3.96g，20.9mmol)和TMEDA(2.66g，3.46mL，22.9mmol)在無水THF(92mL)內的溶液中加入溴化乙烯基鎂(1.0M的THF溶液，20.9mL，20.9mmol)。將該混合物攪拌15分鐘。在一個單獨的燒瓶中，將三甲基甲矽烷基氯(5.69g，6.64mL，52.2mmol)加到不飽和醯亞胺A3(3.87g，11.3mmol)在無水THF(42mL)內的溶液中。由於該醯亞胺的不溶性，移去含有銅酸鹽試劑的該燒瓶的隔片，一次性加入醯亞胺漿液，並用少量THF迅速洗滌。將水浴溫度升至-30℃，並繼續攪拌1小時。將該反應混合物倒入250mL3∶2的飽和NH4Cl濃NH4OH混合物中。分離各層，用EtOAc(3×200mL)萃取水層。將合併的有機部分依次用飽和NH4Cl(1×100mL)和水(1×100mL)洗滌。將有機部分(MgSO4)乾燥並減壓濃縮。將殘餘物過二氧化矽塞以進行純化，用4∶1的己烷EtOAc洗脫。將洗脫液真空濃縮，收集到了白色固體(3.64g，9.81mmol，收率87％).NMR(CDCl3)δ7.87-7.82(c，3H)；7.72(s，1H)；7.54-7.27(c，8H)；6.11(ddd，1H，J＝6.7，10.4，17.0Hz)；5.34(dd，1H，J＝8.6，3.5Hz)；5.10(d，1H，J＝8.2Hz)；5.08(d，1H，J＝17.2Hz)；4.56(t，1H，J＝8.8Hz)；4.26(dd，1H，J＝8.8，3.5Hz)；4.16(ddd，1H，J＝8.1，7.0，6.9Hz)；3.68(dd，1H，J＝8.4，16.5Hz)；3.50(dd，1H，J＝6.5，16.5Hz)。2.1.5(2』S3』R4S)-3-(2』-疊氮基-3』-(2″-萘基)-4』-戊烯醯基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(A5)在-78℃，將六甲基二矽氮烷基鉀(0.5M的甲苯溶液，25.5mL，12.8mmol)一次性加到無水THF(34mL)中。通過插管加入醯亞胺A4(3.64g，9.81mmol)在THF(34mL)中的漿液，並用THF(2×11mL)洗滌以轉移完全。30分鐘後，將三甲矽烷基疊氮化物(4.40g，14.2mmol)溶於THF(34mL)中，冷卻至-78℃，並通過插管加入。30分鐘後，加入AcOH(1.41g，1.34mL，23.4mmol)以中止反應。將該混合物在室溫攪拌過夜。將該混合物在CH2Cl2(300mL)和稀鹽水(150mL)之間分配。分離各層，並用CH2Cl2(3×150mL)萃取水相。將合併的有機部分乾燥(MgSO4)，並減壓濃縮。通過快速柱色譜法純化殘餘物，回收到了產物(3.41g，8.28mmol，收率84％)。NMR(CDCl3)δ7.85-7.82(c，3H)；7.72(s，1H)；7.53-7.47(c，2H)；7.42(dd，1H，J＝1.7，8.5Hz)；7.37-7.31(c，3H)；7.18-7.15(c，2H)；6.28(ddd，1H，J＝8.2，10.2，17.1Hz)；5.63(d，1H，J＝10.2Hz)；5.37(d，1H，J＝17.0Hz)；5.34(d，1H，J＝10.2Hz)；4.83(dd，1H，J＝3.0，8.3Hz)；4.14(t，1H，J＝7.2Hz)；4.07(dd，1H，J＝9.3，17.9Hz)；3.94(dd，1H，J＝3.0，5.8 Hz)；3.68(t，1H，J＝8.6Hz)。2.1.6(2S3R)-2-疊氮基-3-(2』-萘基)-4-戊烯酸甲酯(A6)向醯亞胺A5(3.41g，8.28mmol)在THF(62mL)內的溶液中加入水(21mL)、35％H2O2(2.7mL)、和LiOH.H2O(695mg，16.6mmol)。2小時後，加入Na2SO3(4.17g，33.1mmol)在水(41mL)中的溶液。將該混合物攪拌15分鐘，減壓除去THF。用HCl酸化該水溶液，並用EtOAc(2×150mL)萃取。將合併的萃取液乾燥(MgSO4)，並減壓濃縮。將殘餘物過二氧化矽塞柱，並用1∶1的己烷EtOAc洗脫，濃縮後，收集到了白色固體，推測其是羧酸與手性副產物的混合物。從己烷/EtOAc中重結晶，獲得了手性副產物，為針狀結晶。將母液濃縮，並進行酯化步驟。將含有羧酸粗產物的殘餘物溶於無水MeOH(46mL)中，並冷卻至0℃。加入亞硫醯氯(1.18g，725μl，9.94mmol)，10分鐘後，將該混合物加熱回流2小時。向該混合物中加入水(1.0mL)，攪拌10分鐘，將燒瓶的內容物減壓濃縮。把殘餘物在EtOAc(150mL)和鹽水(100mL)之間分配。分離各層，將有機部分乾燥(MgSO4)，並減壓濃縮。通過快速柱色譜法(19∶1己烷EtOAc)純化殘餘物，收集到了該甲酯(1.54g，5.48mmol，收率66％)。NMR(CDCl3)δ7.84-7.80(c，3H)；7.71(s，1H)；7.50-7.46(c，2H)；7.39(dd，1H，J＝1.8，8.5Hz)；6.23(ddd，1H，J＝8.3，10.9，17.6Hz)；5.30(d，1H，J＝9.9Hz)；5.28(d，1H，J＝17.7Hz)；4.22(d，1H，J＝7.5Hz)；4.06(t，1H，J＝7.9Hz)。2.1.7反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸甲酯(A7)將硼烷-二甲硫醚絡合物(2.0 M的THF溶液，6.57 mL，13.1mmol)用無水THF(26 mL)稀釋，並冷卻至0℃。通過注射器小心地加入環己烯(2.16 g，2.66 mL，26.3 mmol)。30分鐘後已形成了白色沉澱，繼續攪拌3小時。將燒瓶中的內容物真空濃縮。將該反應物在CH2Cl2(36 mL)中形成漿液，並冷卻至0℃。將乙烯基疊氮化物A6(1.23 g，4.38 mmol)溶於CH2Cl2(9 mL)中，並通過插管加入。該反應混合物變成淡黃色，明顯有氣體釋放出來。將該混合物溫熱至室溫並保持過夜。加入MeOH(26 mL)，並再攪拌15分鐘。將該混合物減壓濃縮。把殘餘物置於Et2O(25 mL)中，並用0.1 M HCl(5×25 mL)萃取。用飽和碳酸氫鈉將水萃取液鹼化，並用CH2Cl2(3×100 mL)萃取。將有機萃取液乾燥(MgSO4)，並真空濃縮，收集到了含有一些衍生自二環己基硼烷的汙染物的環化產物(974 mg，3.82 mmol，粗產物收率87％)。NMR(CDCl3)δ 7.84-7.78(c，3H)；7.71(s，1H)；7.49-7.41(c，3H)；3.91(d，1 H，J＝6.9 Hz)；3.69(s，3H)；3.63(m，1H)，3.48(dd，1H，J＝8.2，15.4 Hz)；3.27(d，1H，J＝7.8Hz)；3.25(d，1H，J＝7.8Hz)；2.33(m，1H)，2.09(m，1H)。2.1.8 N-Fmoc-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸(A8)將510 mg(2 mmol)甲酯(A7)在12 ml 6N HCl中於100℃加熱10小時。將該反應溶液減壓濃縮，把固體殘餘物懸浮在15 ml丙酮中。用2N碳酸鈉溶液將該懸浮液調節至pH 9-10。然後緩慢地加入742 mg(2.2 mmol)Fmoc-O-琥珀醯亞胺。然後將pH調節至9-10，並將該混合物在室溫攪拌4小時，然後在室溫放置過夜。用濃鹽酸將pH調節至2，將該混合物與乙酸乙酯混合。抽濾出560 mg沉澱產物。用乙酸乙酯將水相萃取3次，然後與二氯甲烷混合。又以沉澱形式獲得了185mg產物。產量745 mg(80.4％)。NMR(d6-DMSO)δ 7.95-7.80(c，6 H)；7.68(d，1H，J＝7.3Hz)；7.60(d，1H，J＝7.4Hz)；7.50-7.34(c，6H)；7.25(m，1H)，4.39-4.15(c，4H)；3.70-3.48(c，3H)；2.29(m，1H)；2.14(m，1H)。2.2 N-琥珀醯基-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨醯基-L-天冬醯胺醯基-L-丙氨醯基-L-纈氨醯胺(34) 2.2.1 N-Fmoc-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺(B1)將463.5mg(1mmol)N-Fmoc-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸(A8)、338mg H-Asn-Ala-Val-NH2鹽酸鹽(依據常規肽化學方法製備的)和135mg HOBT溶於20ml DMF中。在0℃，加入0.13ml N-乙基嗎啉和220mg DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，然後在室溫攪拌3小時，之後在室溫放置過夜。抽濾出沉澱，將溶液在高度真空下濃縮。將殘餘物在戊醇和碳酸氫鈉溶液之間分配。用KHSO4溶液和H2O/NaCl溶液洗滌戊醇相。抽濾出沉澱，並用乙醚充分研製。獲得了473mg產物。將戊醇相用Na2SO4乾燥並濃縮。用乙醚將殘餘物研製2次。又獲得了另外257mg產物。產量730mg(97.7％)。2.2.2反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺(B2).
將248mg(0.332mmol)N-Fmoc-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺B1置於5ml DMF中。加入0.35ml(3.32mmol)二乙胺，將該混合物在室溫攪拌15分鐘。將該混合物經由澄清層抽濾，並在高度真空下濃縮。將該固體殘餘物用乙醚研製，並抽濾產量141mg(81％)。2.2.3琥珀酸甲酯叔丁酯(B3).
在氬氣氛下，將13.2g(100mmol)琥珀酸-甲酯懸浮在500ml二氯甲烷中。用30分鐘滴加12.9ml(150mmol)草醯氯，然後將該混合物在室溫攪拌6小時。大約3.5小時後，獲得了澄清的溶液。然後滴加300ml叔丁醇。之後將該混合物在室溫放置21小時，並將該澄清溶液濃縮。把殘餘物溶於乙酸乙酯中，並用H2O、NaHCO3溶液和H2O洗滌。用硫酸鈉將該溶液乾燥，並濃縮。產量21.6g(油狀粗產物)。2.2.4琥珀酸一叔丁酯(B4)將9.4g(50 mmol)琥珀酸甲酯叔丁酯(B3)溶於115ml 1，4-二氧雜環己烷中。然後加入110ml 0.5N NaOH。將該混合物在室溫放置，產物沉澱出來。將該混合物在室溫放置一個周末，之後濃縮。用乙醚萃取該水溶液。將水相冷卻至0℃，並用冷的2N H2SO4酸化至pH4。然後用乙醚將該混合物萃取5次。合併有機相，用水洗滌，用Na2SO4乾燥並濃縮。產量5.62g油狀物(64.5％)。2.2.5 N-叔丁基琥珀醯基-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺(B5)將262mg(0.5mmol)反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺(B2)、87.1mg(0.5mmol)琥珀酸一叔丁酯(B4)和67.5mg HOBt溶於5ml DMF。在0℃，加入110mg DCC，將該混合物在0℃攪拌1小時，然後在室溫攪拌2小時，並在室溫放置過夜。抽濾出沉澱，將濾液在高度真空下濃縮。用碳酸氫鈉溶液研製殘餘物，抽濾，用水洗滌，並在乾燥器中乾燥。產量169mg(49.6％)。2.2.6 N-琥珀醯基-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺(34)將316mg N-叔丁基琥珀醯基-反式-3-(2』-萘基)-L-脯氨酸-L-天冬醯胺-L-丙氨酸-L-纈氨醯胺(B5)溶於2ml 90％濃度的三氟乙酸中，並在室溫放置1小時。然後將該混合物經由澄清層過濾，並濃縮。用乙醚研製殘餘物，並抽濾。獲得了159mg粗產物。為了純化，將該粗產物經由SephadexLH20進行色譜處理，用丁醇/冰醋酸/水混合物洗脫。產量27.5mg(9.5％)。m/z625.298949(M+H)+(高解析度質譜)。化合物34的NMR數據 化合物34在DMSO中於300K的化學位移
2.3 N-琥珀醯基-L-(2-萘基)丙氨醯基-L-天冬醯胺醯基-L-絲氨醯基-L-纈氨醯基甘氨酸-3-羥基丙基醯胺(24)
2.3.1苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇)醯胺(C1)將627g(30mmol)Gly-OH、2.45ml 3-氨基-1-丙醇、4.05gHOBt溶於60ml DMF中。在0℃，加入6.6g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，在室溫攪拌3小時，並在室溫放置過夜。抽濾出沉澱，將濾液在高度真空下濃縮。把殘餘物在乙酸乙酯和NaHCO3溶液之間分配。然後將有機相用NaHCO3溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4乾燥並濃縮。用乙醚研製殘餘物。產量7.05g(88.2％)。2.3.2苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C2)將7g(26.28mmol)苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇)醯胺(C1)溶於60二氧雜環己烷中。在低溫下(液態CO2)，緩慢地加入6ml H2SO4。然後加入60ml縮合的異丁烯。將該混合物在高壓反應釜中於室溫和大約20巴的氮氣壓力下振搖3天。然後將該混合物與乙醚混合，並用2NNa2CO3溶液萃取3次。用乙醚洗滌該水溶液。合併有機相，用水洗滌，用Na2SO4乾燥並濃縮。產量7.98g(94.2％)。2.3.3甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C3)將7.98 g(24.75mol)苄氧基羰基甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C2)溶於80ml MeOH中，與Pd/碳混合，並使用HCl甲醇溶液和H2在自動滴定儀上氫化。然後抽濾出催化劑，並將濾液濃縮。將殘餘物在高度真空下乾燥。產量4.7g(84.5％).2.3.4苄氧基羰基-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C4)將5.13g(20.43 mmol)苄氧基羰基-Val-OH、4.59g(20.43mmol)甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C3)和2.75g HOBt溶於60ml DMF中。在0℃，加入2.65ml N-乙基嗎啉和4.5g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，然後在室溫攪拌2小時。將該混合物在室溫放置過夜，然後在高度真空下濃縮。將該殘餘物在冰醋酸和碳酸氫鈉溶液之間分配。然後將冰醋酸相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4乾燥並濃縮。用乙醚乙醚研製固體殘餘物，並抽濾。產量7.32g(85％).2.3.5 L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C5)將7.29g(17.3mmol)苄氧基羰基-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C4)溶於90ml MeOH中，與Pd/碳混合，並用HCl甲醇溶液在自動滴定儀上氫化。然後抽濾出催化劑，並將濾液濃縮。將殘餘物(無定形)在高度真空下乾燥，用乙醚研製，並抽濾。產量5.22g(93.2％).2.3.6苄氧基羰基-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C6)將5.46g(18.5mmol)Z-Ser(But)OH、6g(18.5mmol)L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C5)和2.5g HOBt溶於60ml DMF中。在0℃，加入2.4ml N-乙基嗎啉和4.07g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，然後在室溫攪拌3小時。將該混合物在室溫放置過夜，然後在高度真空下濃縮。將該固體殘餘物在冰醋酸和碳酸氫鈉溶液之間分配。然後將冰醋酸相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4乾燥並濃縮。用乙醚研製固體殘餘物，並抽濾。產量9.74g(93.2％)。2.3.7 L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C7)將9.74g(17.25mmol)苄氧基羰基-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C6)溶於大約100ml MeOH中，與Pd/碳混合，並用HCl甲醇溶液在自動滴定儀上氫化。然後抽濾出催化劑，並將濾液濃縮。將殘餘物(無定形)在高度真空下乾燥，用乙醚研製，並抽濾。產量8.02g(99.6％).2.3.8苄氧基羰基-L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C8)將4.53g(17mmol)Z-Asn-OH、7.94g L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C7)和2.3g HOBt溶於60ml DMF中。在0℃，加入2.21ml N-乙基嗎啉和3.74g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，在室溫攪拌3小時，然後在高度真空下濃縮。將該固體殘餘物在戊醇和碳酸氫鈉溶液之間分配。然後將戊醇相用NaHCO3溶液、KHSO4溶液和H2O/NaCl洗滌，用Na2SO4乾燥並濃縮。用乙醚研製殘餘物，冷卻並抽濾。將產物在乾燥器中用P2O5乾燥。產量10.8g(93.6％).2.3.9 L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C9)將10.8g(15.9mmol)苄氧基羰基-L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C8)溶於大約160ml溫熱的MeOH中，與Pd/碳混合，並用HCl甲醇溶液在自動滴定儀上氫化。然後抽濾出催化劑，並將濾液濃縮。將無定形殘餘物在高度真空下乾燥，用乙醚研製，冷卻並抽濾。產量8.96g(97％).2.3.10苄氧基羰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C10)將5.24g(15mmol)苄氧基羰基-2-Nal-OH、8.72g(15mmol)L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C9)和2.04g HOBt溶於60ml DMF中。在0℃，加入1.95ml N-乙基嗎啉和3.3g DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，在室溫攪拌3小時。然後將該混合物在室溫放置過夜，用DMF稀釋並輕微加熱。然後抽濾出沉澱，並將濾液在高度真空下濃縮。用NaHCO3溶液研製殘餘物，抽濾，然後用KHSO4溶液研製，抽濾，用水研製，抽濾，並用水洗滌，在乾燥器中用P2O5乾燥。產量13.25g(＞99％)。2.3.11 L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C11)將8.85g(10.1mmol)苄氧基羰基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺(C10)部分溶於270ml MeOH中，與Pd/碳混合，並用HCl甲醇溶液在自動滴定儀上氫化。用DMF將該懸浮液稀釋。大約6小時後，將該混合物濃縮至其最初體積的一半。所有物質都溶解了。將該混合物在室溫放置過夜。然後抽濾出催化劑，將濾液用相同量的MeOH稀釋，與新催化劑(Pd/碳)混合，並在自動滴定儀上進一步氫化。7小時後，將該混合物在室溫放置過夜。然後將該混合物再氫化4小時，抽濾出催化劑，並將濾液濃縮。將殘餘物(無定形)在高度真空下乾燥，然後用乙醚研製，並抽濾。產量7.56g(96.2％)。2.3.12 N-叔丁基琥珀醯基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)醯胺(C12)將523mg(3mmol)L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸(叔丁酯)-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇叔丁酯)醯胺鹽酸鹽(C11)、2.33g琥珀酸一叔丁酯(B4)和405mg HOBt溶於20ml DMF中。在0℃，加入0.39ml N-乙基嗎啉和660mg DCC。將該混合物在0℃攪拌1小時，在室溫攪拌2小時，然後在室溫放置過夜。將該混合物在高度真空下濃縮，用NaHCO3溶液研製固體殘餘物，抽濾。然後用KHSO4溶液研製產物，抽濾，用水洗滌，在乾燥器中用P2O5乾燥。產量3.04g(粗產物).2.3.13 N-琥珀醯基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)醯胺(24)將3g(粗產物)N-叔丁基琥珀醯基-L-2-萘基丙氨酸-L-天冬醯胺-L-絲氨酸-L-纈氨酸-甘氨酸-(3-丙醇)醯胺(C12)溶於30ml 90％濃度的三氟乙酸中，並在室溫放置1小時。然後將該混合物濃縮，用乙醚研製殘餘物，並抽濾。獲得了2.6g粗產物。為了純化，將250mg粗產物溶於溫熱的冰醋酸中，並經由Sephadex LH20進行色譜處理，用丁醇/冰醋酸/水混合物洗脫。產量103mgm/z730.341246(M+H)+(高圖形解析度質譜)。化合物24的NMR數據
3.抑制層粘連蛋白/巢蛋白相互作用和生物活性除非另有說明，否則所用的化學品購自Merck(Darmstadt)，Sigma(Munich)或Riedel de Haen(Seelze)。
從人胎盤中分離層粘連蛋白P1、從轉染的HEK-293細胞中分離人巢蛋白、和從HEK-293細胞中分離小鼠層層粘連蛋白γ1 III3-5描述在WO98/31709中。實施例3.1抑制測定-用所發現的肽衍生物抑制層粘連蛋白/巢蛋白結合3.1.1.HTS篩選測定(高靈敏性測定變型)時間-解析螢光測定包被試管在室溫將微量滴定板(例如FluoroNunc)用75μl 0.1μg/ml層粘連蛋白P1溶液(在0.159g Na2CO3，0.293g NaHCO3，0.02g NaN3/升，pH9.2中)包被1小時。然後將該溶液倒出，通過與0.5％BSA(在7.9g NaCl，1.2g Na2HPO4，0.31g KCl，0.23g of NaH2PO4，0.04％吐溫20/升，pH7.2中)在室溫培養0.5小時來阻斷游離的結合位點。阻斷反應完成後，傾出溶液，用250μl洗滌緩衝液(PBS/0.04％吐溫)洗滌一次。順序抑制與包被平行進行的是，將85-100μl 0.25nM巢蛋白溶液(重組製得的人巢蛋白)與抑制劑或標準物在單獨的反應容器中預培養(在7.9g NaCl，1.2g Na2HPO4，0.31g KCl，0.23g NaH2PO4，0.04％吐溫20/升，0.5％BSA，pH7.2中於室溫預培養1小時)。
將75μl預培養物(巢蛋白+抑制劑或標準物)轉移到微量滴定板的包被孔中，並在室溫培養1小時。然後用PBS/0.04％吐溫洗滌2次。通過在室溫與75μl特異性抗體製備物(由用人巢蛋白免疫接種的小雞的蛋黃製得的)培養1小時來檢測結合的巢蛋白。使用在PBS/0.04％吐溫中進行了1∶500稀釋的IgY片段。用PBS/0.04％吐溫洗滌後，通過加入抗-小雞IgY-生物素(75μl 1∶2500稀釋液；Promega，Madison，WI53711，608-274-4330)來檢測巢蛋白與特異結合抗體的複合物。培養1小時，用PBS/0.04％吐溫洗滌2次，然後與鏈黴抗生物素蛋白-銪培養(Wallac；在室溫培養1小時)，用PBS/0.04％吐溫洗滌2次。加入100μl增強溶液(Wallac)並振搖5分鐘後，可用銪方案在Victor多標記計數器中測定螢光信號。發現了在該溶液中與抑制劑結合的巢蛋白的量和不具有所加入的抑制劑的巢蛋白的量之間的關係。3.1.2.3-天平衡測定在該測定變型中評價所選抑制劑的抑制活性。該測定描述在US5,493,008中。
下表比較了所選物質的IC50值與HTS篩選測定的結果。很明顯，該3-天測定給出了稍低的測定值，並且如預計的那樣，該測定比篩選測定的靈敏度高。然而，從該比較中可明顯看出，可用我們開發的篩選測定可靠地鑑定具有抑制活性的結構。表2層粘連蛋白/巢蛋白結合的特異性抑制劑的特徵在不同測定變型中的IC50值(μM)
實施例3.2(假設)測試肽衍生物的生物活性可使用在文獻中詳細描述的幾種模型來測定肽衍生物的生物活性。
其中的代表性模型如下所述在胚胎腎培養物中的細管形成Grobstein，C.；(1956)Exp.Cell Res.10424-440.Ekblom，P.等人.(1994)Development 1202003-2014在胚胎肺中的分支形態Ekblom，P.等人.(1994)Development 1202003-2014在胚胎唾液腺中的分支形態Grobstein，C.(1953)J.Exp.Zool.124383-413Kadoya，Y.等人.(1997)Development 124683-691器官型皮膚培養物中的基底膜裝配Smola，H.；Stark，H.-J.；Thiektter，G.；Mirancea，N.；Krieg，T.；Fusenig，N.E.(1998)Exp.Cell Res.239399-410得自分裂細胞的hydra重新構成Yang，Y.G.；Mayura，K.；Spainhour，C.B.；Edwards Jr.，J.F.；Phillips，T.D.(1993)Toxicology 85179-198在提高的葡萄糖濃度下培養後hydra中基底膜的增厚。Zhang，X.；Huff，J.K.；Hudson，B.G.；Sarras Jr.；M.P.(1990)Diabetologia 33704-707R.K.等人。在Nature Medicine(1997)Vol.3，No.中的綜述性文章裡對所有定量血管生成測定作了總結，例如通過植入得自自發血管內皮瘤的細胞來在小鼠中誘導血管瘤O』Reilly，M.S.；Brem，M.S.；Folkman，J.(1995)J.Pediatr.Surg.302；325-329在不含血清的大鼠主動脈培養物中微血管的生長Nicosia，R.F.；Ottinetti，A.(1990)Lab.Invest Vol.63，No.1,115-122包埋到纖維蛋白凝膠中後在微載體上形成內皮細胞的毛細管Nehls，V.；Drenckhahn，D.(1995)Microvascular Research 50311-322.
權利要求
1.式I化合物 其中R1是其中一個下式所示基團 其中R4表示-A、-NH2、-NHR、-NR2、A2、-NHR1、 且R5表示-(CH2)1COOA、-(CH2)1CONH2、-(CH2)1NH2或-(CH2)1-SO3H、 且X是其中一個下式所示基團 其中Y表示O、S、-N(A)-CO-或-(CH2)r-，D表示(CH2)r、O、S、NH、NR、(CH2)r-O、(CH2)r-S、(CH2)r-NH或(CH2)rNR，且R2表示-A、-E-OH、-E-COOH或-E-CONH2，其中E表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基鏈，該烷基鏈未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，或者E表示C5-C10-環烷基，該環烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，且R3是其中一個下式所示基團 其中R6表示-H、-COOH、-CONH2、-CONHR、-CONR2、-CH2OH或 其中R7表示直鏈或支鏈C1-C10-烷基，該烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，或者R7表示C5-C10-環烷基，該環烷基未取代或者被-A、-(CH2)m-OH、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-C(O)NA2或C5-C10-環烷基取代，且R表示直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環烷基、Het或Ar，所述基團可任選被一個或多個滷素、C1-C6-烷氧基、直鏈或支鏈C1-C6-烷基、C2-C6-鏈烯基、C2-C6-鏈炔基、C5-C10-環烷基或-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代，其中Het表示單環或二環5元-10元芳族或非芳族環，該環包含1或2個相同或不同的選自氮、氧和硫的雜原子作為所述環的成員，並且未取代或者被一個或多個羥基或羧基取代，Ar表示單環或二環5元-10元芳環，該環未取代或者被一個或多個羥基或羧基取代，Z表示(CH2)m、O、S、NH、NR、N-C(O)-R或NSO2R，A表示H或C1-C4-烷基，l、m和r是0-3的整數，n和k是1-2的整數，p是0-1的整數，q是1-3的整數，其中所述化合物是所有其立體異構體和所有比例的立體異構體混合物，並包括它們的生理可耐受鹽。
2.權利要求1的式I化合物，其中n是1。
3.權利要求1或2的式I化合物，其中基團X中的R表示Het或Ar，所述Het或Ar可任選被-C1-C6-烷基-Het、-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Het、-O-C1-C6-烷基-Ar、Het或Ar取代。
4.權利要求3的式I化合物，其中基團X中的R表示Het。
5.權利要求4的式I化合物，其中Het表示
6.權利要求4的式I化合物，其中Het表示
7.權利要求4的式I化合物，其中Het表示
8.權利要求4的式I化合物，其中Het表示
9.權利要求4的式I化合物，其中Het表示
10.權利要求3的式I化合物，其中基團X中的R表示Ar，所述Ar可任選被-C1-C6-烷基-Ar、-O-C1-C6-烷基-Ar或Ar取代。
11.權利要求10的式I化合物，其中基團X中的R表示Ar。
12.權利要求11的式I化合物，其中Ar表示
13.權利要求11的式I化合物，其中Ar表示
14.權利要求11的式I化合物，其中Ar表示
15.權利要求11的式I化合物，其中Ar表示
16.權利要求10的式I化合物，其中基團X中的R表示
17.權利要求10的式I化合物，其中基團X中的R表示
18.權利要求1-17中一項或多項的式I化合物，其中X是下式所示基團
19.權利要求18的式I化合物，其中Y表示-(CH2)r-。
20.權利要求19的式I化合物，其中r是1。
21.權利要求19的式I化合物，其中r是0。
22.權利要求18-21的化合物，其中k是2。
23.權利要求18-21的化合物，其中k是1。
24.權利要求1-17中一項或多項的式I化合物，其中X是下式所示基團
25.權利要求24的式I化合物，其中D表示-(CH2)r-。
26.權利要求24的式I化合物，其中r是0。
27.權利要求24的式I化合物，其中r是1。
28.權利要求1-27中一項或多項的式I化合物，其中R1是下式所示基團
29.權利要求28的式I化合物，其中Z表示(CH2)m。
30.權利要求29的式I化合物，其中m是0。
31.權利要求29的式I化合物，其中m是1。
32.權利要求28-31中一項或多項的式I化合物，其中R5表示-(CH2)1-COOA。
33.權利要求32的式I化合物，其中A表示H。
34.權利要求28-31中一項或多項的式I化合物，其中R5表示-(CH2)1-COONH2。
35.權利要求31-34中一項或多項的式I化合物，其中1是0。
36.權利要求28-35中一項或多項的式I化合物，其中R4表示-NH2。
37.權利要求28-35中一項或多項的式I化合物，其中R4表示-A。
38.權利要求37的式I化合物，其中A表示H。
39.權利要求28-35中一項或多項的式I化合物，其中R4表示-NHR1。
40.權利要求39的式I化合物，其中-NHR1表示
41.權利要求40的式I化合物，其中-NHR1的R5表示 且l是0。
42.權利要求40的式I化合物，其中-NHR1的R5表示 且l是0。
43.權利要求40的式I化合物，其中-NHR1的R5表示(CH2)1-NH2，且l是0。
44.權利要求1-27中一項或多項的式I化合物，其中R1是下式所示基團
45.權利要求44的式I化合物，其中Z表示-(CH2)m-。
46.權利要求45的式I化合物，其中m是1。
47.權利要求44-46中一項或多項的式I化合物，其中R4表示-NH2。
48.權利要求44-47中一項或多項的式I化合物，其中R5表示-(CH2)1-COOA。
49.權利要求48的化合物，其中l是0。
50.權利要求48或49的化合物，其中A表示H。
51.權利要求1-27中一項或多項的式I化合物，其中R1是下式所示基團
52.權利要求51的式I化合物，其中R5表示-(CH2)1-COOA。
53.權利要求52的式I化合物，其中l是0，且A表示H。
54.權利要求1-53中一項或多項的式I化合物，其中R2表示A。
55.權利要求54的式I化合物，其中R2表示-CH3。
56.權利要求1-53中一項或多項的式I化合物，其中R2表示-E-COOH。
57.權利要求56的式I化合物，其中R2表示-CH2-COOH。
58.權利要求1-53中一項或多項的式I化合物，其中R2表示-E-OH。
59.權利要求58的式I化合物，其中R2表示-CH2-OH。
60.權利要求1-59中一項或多項的式I化合物，其中R3是下式所示基團
61.權利要求60的式I化合物，其中k是2。
62.權利要求1-59中一項或多項的式I化合物，其中R3表示
63.權利要求1-59中一項或多項的式I化合物，其中R3是下式所示基團
64.權利要求63的式I化合物，其中R7是支鏈C1-C10-烷基。
65.權利要求64的式I化合物，其中R7表示-CH(CH3)2。
66.權利要求64的式I化合物，其中R7表示-C(CH3)3。
67.權利要求64的式I化合物，其中R7表示-CH(CH3)CH2-CH3。
68.權利要求64的式I化合物，其中R7表示-CH2-CH(CH3)2。
69.權利要求63-68中一項或多項的式I化合物，其中R6表示-H。
70.權利要求63-68中一項或多項的式I化合物，其中R6表示-COOH。
71.權利要求63-68中一項或多項的式I化合物，其中R6表示-CONH2。
72.權利要求63-68中一項或多項的式I化合物，其中R6表示-CH2OH。
73.權利要求63-68中一項或多項的式I化合物，其中R6表示-CON(CH3)2。
74.權利要求63-68中一項或多項的式I化合物，其中R6表示
75.權利要求74的式I化合物，其中q是2。
76.權利要求1-59中一項或多項的式I化合物，其中R3是下式所示基團
77.權利要求76的式I化合物，其中R7表示-CH(CH(CH3)2)2。
78.權利要求76的式I化合物，其中R7表示-CH2C(CH3)3。
79.藥物組合物，其中含有至少一種如一項或多項前述權利要求所述的化合物和/或其生理可耐受鹽。
80.用作藥物的權利要求1-78中一項或多項的化合物和/或其生理可耐受鹽。
81.權利要求1-78中一項或多項的化合物和/或其生理可耐受鹽在製備用於治療與基底膜的增加或不良合成有關的疾病的藥物中的應用。
82.權利要求81的應用，其中所述疾病是糖尿病的晚期併發症。
83.權利要求81的應用，其中所述疾病是伴有基底膜或其成分合成增加的纖維變性。
84.權利要求83的應用，其中所述疾病是肝臟纖維變性。
85.權利要求81的應用，其中所述疾病是動脈粥樣硬化。
86.權利要求81的應用，其中所述疾病是癌症。
87.權利要求81的應用，其中所述疾病是糖尿病性視網膜病。
88.權利要求81的應用，其中所述疾病是晶狀體後纖維組織形成。
89.權利要求81的應用，其中所述疾病涉及強炎性成分。
90.權利要求89的應用，其中所述疾病是類風溼性關節炎。
91.權利要求89的應用，其中所述疾病是骨關節炎。
92.權利要求89的應用，其中所述疾病是結節性脈管炎。
93.權利要求81的應用，其中所述疾病涉及血管瘤。
94.權利要求81的應用，其中所述疾病是牛皮癬。
95.鑑定能抑制層粘連蛋白與巢蛋白相互作用的化合物的方法，其中是使用權利要求1-79的化合物作為競爭性抑制劑。
96.權利要求95的方法，其中還包括將所鑑定的化合物配製成可藥用形式。
97.製備藥物組合物的方法，其中包括權利要求95的方法，並且將所鑑定的化合物和/或其生理可耐受鹽與可藥用載體混合。
全文摘要
本發明的目的是能起層粘連蛋白與巢蛋白之間相互作用(層粘連蛋白/巢蛋白相互作用)抑制劑作用的低分子量肽衍生物,其製備方法,由其製備的藥物組合物,以及所述肽衍生物在製備藥物和鑑定層粘連蛋白/巢蛋白相互作用抑制劑中的應用。
文檔編號A61P43/00GK1342167SQ00804501
公開日2002年3月27日 申請日期2000年2月19日 優先權日1999年3月1日
發明者H·U·斯蒂爾茲, M·格爾, G·A·弗琳, M·斯坦克瓦, R·A·賓尼 申請人:阿文蒂斯藥物德國有限公司