異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中的應用的製作方法
2023-05-25 11:34:31 1
異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中的應用。具體地，給需要的對象施用本發明的含有異體脂肪來源的間質血管層細胞和異體間充質祖細胞的藥物組合物，對於類風溼性關節炎有顯著的預防或治療作用，且安全性好，不產生排異反應。本發明還提供了一種含有異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞的藥物組合物，以及預防和治療類風溼性關節炎的方法。
【專利說明】異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於幹細胞及生物醫藥領域。具體地，本發明涉及異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中的應用。
【背景技術】
[0002]類風溼性關節炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種在世界範圍內常見的由自身免疫障礙導致的免疫系統攻擊關節的慢性炎症，其病理特徵是關節滑膜的慢性炎性增生、血管翳形成、軟骨及軟骨下骨破壞，最終導致關節畸形和強直。其患病率大約佔到了世界成年人總人口的1%，我國約為0.32%~0.36%。患者的平均壽命縮短5~10年，至少有50%的患者在發病10年後喪失工作能力。臨床表現為慢性、進行性、對稱性、侵蝕性多關節炎，以雙手近指、掌指、腕、肘關節和雙足蹠趾、踝、膝關節受累最為常見，造成關節軟骨、骨和關節囊破壞，最終導致關節畸形和功能喪失。患者同時可有發熱、關節疼痛及晨僵等症狀。疾病進展亦會系統地影響其他關節外的組織，包括皮膚、血管、心臟、肺部及肌肉等。
[0003]目前對類風溼性關節炎的致病機理尚不十分清楚，主要觀點認為細胞因子參與介導了整個病理過程。越來越多的證據顯示CD4+T細胞介導的自身免疫應答及B細胞、滲入滑膜的巨噬細胞在RA的發病中起著關鍵性的作用。由單核細胞/巨噬細胞及成纖維細胞分泌的TNF-α在RA中也有著重要的作用，它主要通過誘導包括IL-1、IL_6、IL_15及IL-18等一些細胞因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子影響RA的發生。
[0004]目前,類風溼關節炎的治療包括藥物治療、外科治療和心理康復治療等,治療應個體化。結合病人自身情況，如年齡、性別、體重、自身危險因素、病變部位及程度等選擇合適的治療方案。
[0005]當前治療類風溼關節炎的常用藥物分為四大類:非甾類抗炎藥(NSAIDs)、改善病情的抗風溼藥(DMARDs)、糖皮質激素、和植物藥。但是上述藥物均不能完全控制關節破壞，而只能緩解疼痛、減輕或延緩炎症的發展。經過積極正規的內科治療，仍不能控制病情者，為糾正畸形，改善生活質量可考慮手術治療。常用的手術主要有滑膜切除術、關節形成術、軟組織松解或修復手術、關節融合術等。但手術並不能根治類風溼關節炎，故術後仍需內科藥物治療。
[0006]因此，傳統的治療方案尚遠不能控制疾病的進展或徹底治癒類風溼關節炎，迫使人們尋求新的治療方法。
[0007] 本公司開發了自體來源的間質血管層細胞和間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎。然而，部分RA患者由於種種原因，如具有傳染病者或年老瘦弱因而無法提供自體脂肪，導致無法應用自體脂肪間充質祖細胞來預防或治療RA。因此，本領域目前迫切需要探尋新穎的治療和修復策略。
【發明內容】
[0008]本發明的目的就是提供異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中的應用。
[0009]在本發明的第一方面，提供了一種異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)的用途，它們被用於製備預防和/或治療類風溼性關節炎的藥物組合物。
[0010]在另一優選例中，所述的異體間質血管層細胞為異體間質血管層細胞群。
[0011]在另一優選例中，所述的異體間充質祖細胞為異體間充質祖細胞群。
[0012]在另一優選例中，所述的異體間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特徵:
[0013](i) 30%以上的細胞具有表面抗原⑶29 ；
[0014](ii) 50%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ；
[0015](iii)85%以上的細胞具有表面抗原⑶49d ；
[0016](iv) 55%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
[0017]在另一優選 例中，35%以上的細胞具有表面抗原⑶29。
[0018]在另一優選例中，55%以上的細胞具有表面抗原⑶73。
[0019]在另一優選例中，90%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
[0020]在另一優選例中，60%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
[0021]在另一優選例中，所述的異體間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特徵:
[0022](V) 85%以下的細胞具有表面抗原⑶34 ；
[0023](vi) 15%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
[0024]在另一優選例中，80%以下的細胞具有表面抗原⑶34。
[0025]在另一優選例中，12%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
[0026]在另一優選例中，所述的異體間質血管層細胞分泌選自下組的細胞因子:幹細胞生長因子(HGF)，血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉化生長因子β (TGF-β)、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其組合。
[0027]在另一優選例中，所述的異體間質血管層細胞為異體間質血管層細胞群。
[0028]在另一優選例中，異體間質血管層細胞分泌的幹細胞生長因子(HGF)的濃度^ 0.5ng/ml,較佳地> 0.8ng/ml。
[0029]在另一優選例中，異體間質血管層細胞分泌的血管內皮生長因子(VEGF)的濃度≥35pg/ml,較佳地≥40pg/mL.[0030]在另一優選例中，異體間質血管層細胞分泌的人轉化生長因子β (TGF-β)的濃度 > 150pg/ml,較佳地 > 180pg/ml。
[0031]在另一優選例中，異體間質血管層細胞分泌的白介素-2(IL_2)的濃度≥15pg/ml,較佳地≥20pg/ml,更佳地≥30pg/ml。
[0032]在另一優選例中，異體間質血管層細胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的濃度≥15pg/ml,較佳地> 20pg/ml,更佳地> 30pg/ml,最佳地> 40pg/ml。
[0033]在另一優選例中，所述的異體間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特徵:
[0034](i) 95%以上的細胞具有表面抗原⑶90 ；
[0035](ii)95%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ；[0036] (iii)95%以上的細胞具有表面抗原⑶29 ；
[0037](iv) 95%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
[0038]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
[0039]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶73。
[0040]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶29。
[0041]在另一優選例中，98%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
[0042]在另一優選例中，所述的異體間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特徵:
[0043](V) 2%以下的細胞具有表面抗原HLA-DR ；
[0044](vi) 2%以下的細胞具有表面抗原Actin ；
[0045](vii) 2%以下的細胞具有表面抗原CD34 ；
[0046](viii) 2%以下的細胞具有表面抗原CD45 ；
[0047](viiii) 2%以下的細胞具有表面抗原⑶14。
[0048]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原HLA-DR。
[0049]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原Actin。
[0050]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原⑶34。
[0051]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
[0052]在另一優選例中，1%以下的細胞具有表面抗原⑶14。
[0053]在另一優選例中，所述的異體間充質祖細胞分泌選自下組的細胞因子:血管內皮生長因子(VEGF)、人轉化生長因子α (TGF-α)、人轉化生長因子β (TGF-β)、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、血小板衍生因子(TOGF)、白介素-2 (IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-10 (IL-10)。
[0054]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的血管內皮生長因子(VEGF)的濃度≥ 10pg/ml,較佳地≥ 15pg/ml。
[0055]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的人轉化生長因子β (TGF-β)的濃度≥ 300pg/ml,較佳地> 400pg/mlo
[0056]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的濃度≥30ng/ml,較佳地≥40ng/ml。
[0057]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的肝細胞生長因子(HGF)的濃度^ 0.4ng/ml,較佳地> 0.5ng/ml。
[0058]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的血小板衍生因子(I3DGF)的濃度^ 0.008ng/ml,較佳地> 0.01ng/ml。
[0059]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的白介素-2(IL_2)的濃度≥25pg/ml，較佳地≥30pg/mL.[0060]在另一優選例中，異體間充質祖細胞分泌的白介素-1O(IL-1O)的濃度≥30pg/ml,較佳地≥40pg/mL.[0061]在本發明的第二方面，提供了一種用於預防和/或治療類風溼性關節炎的藥物組合物，所述的藥物組合物包括:有效量的異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs),以及藥學上可接受的載體。
[0062]在另一優選例中，所述的藥物組合物為靜脈注射試劑，和/或關節腔內注射試劑。[0063]在另一優選例中，所述的藥學上可接受的載體包括(但並不限於):鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
[0064]在另一優選例中，所述異體間質血管層細胞的濃度為0.1-100X IO4個/ml，較佳地為1-10 X IO4個/ml，更佳地為2 X IO5個/ml。
[0065]在另一優選例中，所述異體間充質祖細胞濃度為0.1-100X 104個/ml，較佳地為1-10 X IO4 個 /ml，更佳地為 2 X IO5 個 /ml。
[0066]在本發明的第三方面，提供了一種預防和/或治療類風溼性關節炎的方法，包括步驟:給需要的對象施用異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)、或施用含有異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)的藥物組合物。
[0067]在另一優選例中，所述的對象為人或非人哺乳動物，優選人。
[0068]在另一優選例中，所述的方法包括步驟:
[0069](I)給需要的對象施用異體間質血管層細胞；和
[0070](2)給需要的對象施用異體間充質祖細胞。
[0071 ] 在另一優選例中，施用部位為所述對象的靜脈內，和/或關節腔內。
[0072]在另一優選例中，步驟⑴與步驟(2)之間間隔時間為I個月以上，和/或3個月以上。
[0073]應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0074]下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。
[0075]圖1顯示了異體SVF與異體haMPCs混合療法治療類風溼性關節炎流程。
[0076]圖2為haMPCs的VEGF分泌量的變化；圖2A顯示LPS刺激24h後haMPCs的VEGF分泌量的變化；圖2B顯示低氧刺激對haMPCs的VEGF分泌量的影響。
[0077]圖3顯示haMPCs成軟骨誘導實驗結果。
[0078]圖4顯示haMPCs成骨誘導實驗結果。
【具體實施方式】
[0079]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞在預防或治療類風溼性關節炎中具有極為優異的效果。具體地，給需要的對象施用本發明的異體脂肪來源的異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞，或施用含有異體脂肪來源的異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞的藥物組合物，對於類風溼性關節炎有顯著的預防或治療作用。
[0080]異體間充質祖細胞具有很高的細胞因子分泌能力，在體內合適條件下可對機體的損傷進行修復:異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞具有成軟骨分化及成骨化的能力。本發明還提供了一種預防和治療類風溼性關節炎的方法以及含有異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞的藥物組合物。[0081 ] 在此基礎上，發明人完成了本發明。
[0082]術語
[0083]如本文所用，術語「以上」和「以下」包括本數，例如「95%以上」指≥95%, 「0.2%以下」指≤0.2%。
[0084]類風溼性關節炎
[0085]如本文所用，術語「類風溼性關節炎」與「rheumatoid arthritis」或「RA」互換使用。
[0086]類風溼性關節炎是一種慢性對稱性多關節疾病，尤其屬於一種全身性自身免疫性疾病；其病理特徵是關節滑膜的慢性炎性增生、血管翳形成、軟骨及軟骨下骨破壞，最終導致關節畸形和強直。臨床表現為慢性、進行性、對稱性、侵蝕性多關節炎，以雙手近指、掌指、腕、肘關節和雙足蹠趾、踝、膝關節受累最為常見，造成關節軟骨、骨和關節囊破壞，最終導致關節畸形和功能喪失。疾病進展亦會系統地影響其他關節外的組織，包括皮膚、血管、心臟、肺部及肌肉等。
[0087]特別需要說明的是，類風溼性關節炎與常見的骨性關節炎(即0A)不同，骨性關節不屬於自身免疫性疾病，並且病變關節多見於負重關節，如膝關節，胯關節等。
[0088]脂肪
[0089]異體脂肪是整形和抗衰老治療的優良來源，脂肪組織材料可以來源於腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位。本領域技術人員可採用通用的技術方法獲得異體脂肪組織，包括(但不限於)抽吸、手術分離等方法。
[0090]在本發明中，脂肪組織或脂肪原料沒有特別限制，可以是來源於動物或人的任何部位的脂肪組織，優選人的脂肪組織。較佳地，脂肪組織可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的組織。
[0091]異體間質血管層細胞
[0092]如本文所用，術語「異體間質血管層細胞」、「異體SVF」、或「異體間質血管碎片」可以互換使用。
[0093]異體間質血管層細胞是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的幹細胞。SVF能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，它取材容易、體內儲備量大、適宜大規模培養、對機體損傷小、來源廣泛、適宜自體移植。SVF是祖細胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細胞混合物形成的細胞團就叫做間質血管碎片。間質血管碎片中含有豐富的間充質細胞，可分化為多種譜系的細胞，是再生醫學、組織工程等最理想的種子細胞，
[0094]本領域的技術人員能夠使用通用的方法進行SVF的分離和純化。
[0095]如本文所用，術語「分離方法」、「SVF的分離方法」可以互換使用，都指從原始的脂肪組織中獲得分離的SVF的方法和過程。對於獲得的SVF的脂肪細胞材料，首先進行洗滌，除去血細胞；脂肪破碎，消化；去除未消化的組織，獲得含SVF的濾液；離心得到SVF。得到的SVF可以用於進一步傳代、培養或凍存。
[0096]在一個優選的實施例中，分離SVF可以包括步驟(但不限於):將吸脂後的脂肪用PBS反覆衝洗兩次，然後在37°C條件下用膠原酶消化30min，1200g離心10min後即獲得高密度的SVF碎片，其中主要包括間質細胞、血管內皮細胞和壁細胞。另外，SVF中也包括一些血管來源的細胞，如白細胞和紅細胞等，各種細胞之間具有協同效應。
[0097]異體間質血管層細胞的抗原檢測
[0098]用本發明使用的SVF具有很高的純度，基本上不含有其他類型的細胞或幹細胞。這可通過細胞表面抗原的檢測加以驗證。
[0099]SVF具有多種特異性抗原和受體，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。
[0100]⑶34抗原是一種高度糖基化I型跨膜蛋白，它選擇性的表達於人類造血幹細胞(HSC)，祖細胞(PC)和血管內皮細胞(EC)表面，帶有CD34的脂肪組織祖細胞在總幹細胞的比例優選為≥0.2%，更佳地，(0.2%。
[0101]⑶45存在於所有造血細胞的表面，包括造血幹細胞和破骨細胞。帶有⑶45的脂肪組織祖細胞在總幹細胞的比例優選為< 0.1%。
[0102]⑶29、⑶73、⑶ 49d、⑶90等主要存在於脂肪異體間充質祖細胞表面。
[0103]帶有CD29的SVF在總幹細胞的比例優選為≥30%,更佳地≥32%，最佳地≥35%。
[0104]帶有CD73的SVF在總幹細胞的比例優選為≥50%,更佳地≥60%,最佳地≥70%。
[0105]帶有CD49d的SVF在總幹細胞的比例優選為≥85%，更佳地≥90%,最佳地≥95%。
[0106]帶有CD90的SVF在總幹細胞的比例優選為≥55%，更佳地≥60%,最佳地≥65%。
[0107]本領域內技術人員可以使用通用的方法檢測SVF的純度和分化程度，如流式細胞儀法。檢測時，加入不同的與有針對性的特異抗體，抗體可以是完整的單克隆或多克隆抗體，也可以是具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國專利N0.4，946，778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。加入抗體與細胞表面的抗原結合一定時間，用流式細胞儀對細胞進行自動分析和分選。
[0108]異體脂肪來源的間充質祖細胞
[0109]如本文所用，術語「異體脂肪來源的間充質祖細胞」、「allogeneic haMPCs」或「allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal progenitor cells，，含義相同，可以
互換使用。
[0110]本發明使用的脂肪來源的異體間充質祖細胞優選人來源的脂肪來源的異體間充質祖細胞；更優選人自體脂肪來源的異體間充質祖細胞。
[0111]本領域的普通技術人員可以使用常規方法進行allogeneic haMPCs的分離和培養，在一個優選例的實施例中，包括步驟:
[0112]a.分裝脂肪:將抽取的脂肪裝至離心管中，抽取的脂肪分兩部分，一部分用膠原酶消化洗滌後，用於製備成SVF細胞懸液，直接進行現場回輸；另一部分獲得SVF後繼續培養，以獲得脂肪祖細胞；
[0113]b.脂肪分解:向離心管中加入酶劑，置恆溫振蕩器中，進行脂肪消化，待消化完畢，離心後棄去上層消化後的脂肪，收集沉澱並洗滌；
[0114]c.過濾:加細胞洗液，混勻，用細胞濾網過濾後細胞計數，離心，洗滌沉澱。過濾後的細胞即為血管基質層細胞SVF (stromal vasvular fraction Cells)。SVF是從脂肪組織中分離的多種細胞混合物，是由多種同種異質細胞組成的細胞群，其中包括MPCs樣細胞，內皮(祖)細胞，血管平滑肌細胞以及其他部分的血液來源細胞，包括粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等；
[0115]d.SVF懸液製備:將過濾後的SVF細胞配製成5ml細胞懸液，用注射劑將懸液吸入後，將懸液注入100mL生理鹽水袋中；
[0116]e.細胞培養:根據計數細胞的量調整接種密度接種至培養瓶置C02培養箱培養；
[0117]f.傳代:接種3天左右出現少量貼壁異體間充質祖細胞，培養5-7天貼壁細胞呈集落時，消化傳代，收集並計數細胞，原代貼壁情況1:1-2的比例傳代，傳代培養2至3周，收集細胞(自體脂肪來源的祖細胞);
[0118]g.製備脂肪來源的祖細胞懸液:將收集的脂肪來源的祖細胞離心洗滌後，注入生理鹽水，製成細胞懸液。
[0119]異體脂肪間充質祖細胞的抗原檢測
[0120]本發明使用的異體脂肪間充質祖細胞具有極高的純度和活性。
[0121]本領域的普通技術人員可以使用常規方法對異體脂肪間充質祖細胞表面抗原進行檢測，如過流式細胞儀法等。
[0122]異體脂肪間充質祖細胞具有多種特異性抗原和受體，主要有:⑶29、⑶73、⑶90、CD49d 等。
[0123]帶有CD73抗原的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例> 95 %，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0124]帶有CD90抗原的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例> 95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0125]帶有CD29抗原的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例> 95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0126]帶有CD49d抗原的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例> 95%，更佳地≥98%，更佳地≥99%，最佳地為100%。
[0127]脂肪來源的異體間充質祖細胞的陰性指標包括:HLA_DR、Actin、⑶34、⑶45、⑶14等。
[0128]帶有HLA-DR抗原的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例≤ 2%，更佳地≤ 1%，更佳地≤ 0.5%，最佳地沒有HLA-DR抗原。
[0129]帶有Actin抗原的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例≤ 2%，更佳地≤ 1%，更佳地≤ 0.5%，最佳地沒有Actin抗原。
[0130]帶有CD34的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例≤ 2%，更佳地(1%，更佳地≤ 0.5%，最佳地沒有⑶34。
[0131]帶有CD45的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例≤ 2%，更佳地(1%，更佳地≤ 0.5%，最佳地沒有⑶45。
[0132]帶有CD14的異體間充質祖細胞在總異體間充質祖細胞中的比例≤ 2%，更佳地(1%，更佳地≤ 0.5%，最佳地沒有⑶14。
[0133]本發明使用的haMPCs優選是可以大量分泌VEGF、TGF- a、TGF- β、GM-CSF, HGF、PDGF, IL-2、IL-4、IL-10等生子因子的人來源的haMPCs，並具有極強克隆形成能力和極低的免疫原性。
[0134]本領域的普通技術人員可以使用常規方法對haMPCs進行使用、處理、施用等操作。如:每批haMPCs發放或使用之前，必須通過無菌、內毒素和支原體檢查，以及DNA同一認定。每批發放的細胞都要符合細胞活力>95%、細胞純度(陽性指標>95%，陰性指標〈2%)。haMPCs急毒、過敏檢測結果均呈陰性，均有一份相應的檢測報告。
[0135]藥物組合物及其應用
[0136]本發明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞，以及藥學上可接受的載體。
[0137]通常，可將異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，如生理鹽水中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為7-8。
[0138]如本文所用，術語「有效量」或「有效劑量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人 和/或動物所接受的量。
[0139]如本文所用，「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0140]本發明的藥物組合物含有的載體包括(但並不限於):鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物製劑還可製成緩釋製劑。
[0141]本發明所述異體間質血管層細胞和異體間充質祖細胞的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於:所述藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。
[0142]本發明的藥物組合物優選為皮下注射試劑與及靜脈注射試劑同時使用。在另一優選例中，所述皮下注射試劑的異體間質血管層細胞的濃度為0.1-100 X IO4個/ml，較佳地為
1-10X IO4個/ml，更佳地為2X IO5個/ml ;和/或異體間充質祖細胞濃度為0.1-100X IO4個/ml，較佳地為1-10 X IO4個/ml，更佳地為2 X IO5個/ml。
[0143]本發明還提供了一種使用本發明所述藥物組合物的方法，在一個具體地實施例中，包括步驟:
[0144](I)給需要的對象施用異體間質血管層細胞，和
[0145](2)給需要的對象施用異體間充質祖細胞，優選的使用時間為步驟(1)之後的I個月，和/或3個月。
[0146]在本發明中，給所需要的對象施用異體間質血管層細胞異體間充質祖細胞，優選的施用部位為所述對象的關節腔，和/或靜脈內，其機理是通過靜脈注射達到全身免疫調節的目的，在關節腔內注射達到局部調節的目的，並刺激祖細胞成骨化和成軟骨化從而修
復病變。
[0147]本發明所述的施用流程見圖1。
[0148]本發明的主要優點如下:
[0149](I)本發明的SVF和haMPCs在體內使用是安全的；[0150](2)本發明使用的haMPCs經LPS、低氧等刺激後，各種細胞因子的表達量會出現均明顯上升，haMPCs具有較高的細胞因子分泌能力，在體內合適條件下能進行機體損傷修復；
[0151](3)本發明的haMPCs具有典型的異體間充質祖細胞特性，在體內的合適條件下具有潛在的分化能力，從而滿足機體相對需求；
[0152](4)本發明的SVF與haMPCs混合療法中，haMPCs在特定誘導條件下可轉化為軟骨細胞，應用於預防或治療類風溼性關節炎。
[0153](5)本發明的SVF與haMPCs混合療法中，haMPCs在特定誘導條件下可轉化為骨細胞，應用於預防或治療類風溼性關節炎。
[0154]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。
[0155]實施例1
[0156]SVF和haMPCs治療類風溼性關節炎(RA)
[0157]患者女，53歲，雙手指間關節及掌指關節反覆腫痛5年餘，晨僵持續I小時，化驗RF352RU/ml、抗CCP565RU/ml，診斷為類風溼關節炎。
[0158]予口服非甾體消炎藥、來氟米特口服治療後，症狀未見緩解。經患者同意後行SVF和haMPCs治療。因患者瘦弱，BMI為16.8kg/m2，故建議採用異體SVF和異體haMPCs治療。
[0159]抽脂志願者為到整形外科抽脂減肥的32歲女性，排除傳染性疾病及心、肝、肺、腎等慢性病。從下腹部抽取脂肪，取出約35ml脂肪用於治療該患者。其中從IOml新鮮獲取的脂肪組織中分離出血管基質部分，經膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細胞後得到SVF。
[0160]將劑量為1*107個細胞/100mL的SVF靜脈輸注，持續時間約為30分鐘，再將劑量為1*107個細胞/2ml的SVF注射於患者患病關節腔內。剩餘脂肪組織分離提純後培養P2-P5代獲得haMPCs。haMPCs冷凍保存，待解凍復甦後可再次培養，待首次注射後的第1、3個月再同上方法靜脈輸注加患病關節腔內注射，劑量均為1*107/個。
[0161]結果:療程結束8周後患者自覺症狀明顯改善，12周後複查各項指標。血清抗體較治療前明顯降低，RF為56RU/ml，抗CCP為73.5RU/ml。
[0162]實施例2SVF及haMPCs的鑑定
[0163]1.流式檢測
[0164]通過酶消化法將細胞收集到離心管中，細胞懸液調整密度為lX105/mL，800r/min(120g)，離心5min，棄掉上清，用4°C的冷D-Hanks衝洗重懸細胞，再次將細胞懸液以800r/min,離心5min,之後棄去上清。然後用D-Hanks將細胞重懸至ImL,加入抗體5~10 μ L,避光，冰上放置30min。用D-Hanks衝洗，離心，棄上清，重複該衝洗過程2~3次，確保將未結合抗體除淨最後，加入約200至300 μ L的D-Hanks製成懸液。
[0165]SVF的流式檢測結果見表1。
[0166]表1
[0167]
【權利要求】
1.一種異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)的用途，其特徵在於，它們被用於製備預防和/或治療類風溼性關節炎的藥物組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的異體間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特徵: (i)30%以上的細胞具有表面抗原⑶29 ； (?)50%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ； (iii)85%以上的細胞具有表面抗原⑶49d； (iv)55%以上的細胞具有表面抗原⑶90。
3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的異體間質血管層細胞具有選自下組的任一或多種特徵: (V) 85%以下的細胞具有表面抗原CD34 ； (vi) 15%以下的細胞具有表面抗原⑶45。
4.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的異體間質血管層細胞分泌選自下組的細胞因子:幹細胞生長因子(HGF)，血管內皮生長因子(VEGF)、血小板衍生因子(TOGF)、人轉化生長因子β ( TGF-β)、巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介素-10 (IL-10)、或其組合。
5.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的異體間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特徵: (i)95%以上的細胞具有表面抗原⑶90 ； (?)95%以上的細胞具有表面抗原⑶73 ； (iii)95%以上的細胞具有表面抗原⑶29； (iv)95%以上的細胞具有表面抗原⑶49d。
6.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的異體間充質祖細胞具有選自下組的任一或多種特徵: (V) 2%以下的細胞具有表面抗原HLA-DR ； (vi)2%以下的細胞具有表面抗原Actin ； (vii)2%以下的細胞具有表面抗原CD34 ； (viii)2%以下的細胞具有表面抗原CD45 ； (viiii) 2%以下的細胞具有表面抗原⑶14。
7.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的異體間充質祖細胞分泌選自下組的細胞因子:血管內皮生長因子(VEGF)、人轉化生長因子α (TGF-α)、人轉化生長因子β (TGF-β)、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、血小板衍生因子(PDGF)、白介素-2 (IL-2)、白介素 _4 (IL-4)、白介素-10 (IL-10)。
8.一種用於預防和/或治療類風溼性關節炎的藥物組合物，其特徵在於，所述的藥物組合物包括:有效量的異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)，以及藥學上可接受的載體。
9.一種預防和/或治療類風溼性關節炎的方法，其特徵在於，包括步驟:給需要的對象施用異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)、或施用含有異體間質血管層細胞(SVF)和異體間充質祖細胞(haMPCs)的藥物組合物；優選地，採用靜脈注射，和/或局部關節腔內注射的方法給需要的對象進行施用。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，包括步驟:(1)給需要的對象施用異體間質血管層細胞；和(2)給需要的對象施用異體間充質祖細胞。
【文檔編號】A61K38/19GK103961374SQ201310045004
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月4日 優先權日:2013年2月4日
【發明者】曹衛, 曾曉聆, M·A·卡尤姆, 周玉潔, 張麗 申請人:西比曼生物科技（上海）有限公司