表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株的製作方法

2023-05-25 22:35:06 2

表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株的製作方法
【專利摘要】本發明是一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum熱穩定熱穩定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9C。通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum獲得糖苷水解酶基因CtAA9c，將其克隆並插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，然後將得到的糖苷水解酶基因CtAA9c表達載體pPIC9K/CtAA9c導入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌GS-CT-9C。該工程菌表達的糖苷水解酶CtAA9C對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始內切酶N24的降解纖維素的活性提高1.4倍。在Mn2+條件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纖維素酶活性可分別提高15倍和3.5倍。CtAA9C具有良好的熱穩定性和提高纖維素酶活力的能力，可廣泛用於纖維廢料及其它工業領域，具有重大經濟價值和社會價值。
【專利說明】表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株(-)【技術領域】[0001]本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株Pichia pastorisGS-CT-9C。
(二)【背景技術】
[0002]糖苷水解酶(英語:Glycoside hydrolases,又稱糖苷酶)是一種專門水解配糖鍵(glycosidic bond)，並產生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質在人類的產業上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。
[0003]嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum是一種廣泛分布於土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50°C條件下可以產生熱穩定的纖維素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜熱毛殼菌產生的9家族糖苷水解酶CtAA9C具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產生的內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，可使其活性提高1.4倍。在不同金屬離子如Mn2+的作用下，CtAA9C和CtAA9C+N24的活性可分別提高15倍和3.5倍。
(三)
【發明內容】

[0005]本發明從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得內切β-1, 4-葡聚糖酶基因的cDNA序列全長，命名為CtAA9c，CtAA9c基因DNA全長1020bp，包括信號肽序列，起始密碼子和終止密碼子，無內含子，編碼313個胺基酸，具有信號肽序列(l-26aaMPPSTSSLLSILLTLSSTLIH)PVFA)。將CtAA9c編碼的胺基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬於糖苷水解酶第9家族。
[0006]構建重組表達質粒載體pPIC9K/CtAA9c，利用電轉儀進行電擊轉化Pichiapastoris GSl 15，在MD和麗培養基上篩選，經PCR鑑定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然後進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9C。該工程菌株接種於含BMGY培養基中，在28°C 200rpm/min搖床培養6d後，糖苷水解酶的表達量為3.24mg/ml，分子量為65KDa，酶活力為0.0483~1111，(^449(:在651:下是穩定的，處理601^11後仍有95%以上的酶活性；70°C處理30min後仍保持74.4%的活性；80°C處理30min後保持24.8%的活性；90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9C對嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高1.4倍。不同金屬離子對CtAA9C和CtAA9C+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn2+條件下，CtAA9C和CtAA9C+N24的纖維素酶活性可分別提高35倍和3.5倍。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】:[0008]圖1 9家族糖苷水解酶CtAA9C的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白標準
[0010]泳道2:純化的9家族糖苷水解酶CtAA9C
[0011]圖2 A: 9家族糖苷水解酶CtAA9C的最適溫度
[0012]B: 9家族糖苷水解酶CtAA9C的熱穩定性測定
[0013]圖3 9家族糖苷水解酶CtAA9C對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0014]圖4金屬離子Mn2+對CtAA9C纖維素酶及混合酶活性的影響
(五)【具體實施方式】
[0015]實施例1:嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum的分離鑑定
[0016](I)標本採集:從堆肥中採集。
[0017](2)分離培養:將採集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養3天後，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。
[0018](3)鑑定:參考 Coo ney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。
[0019]實施例2:糖苷水解酶基因CtAA9c的克隆
[0020](I)嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum總RNA的提取:參照Trizol試劑盒說明。
[0021](2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行:取I~2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，將RNA樣品在75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然後稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture 2 μ L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24y L, Oligod (T) -Adaptor Primer I μ L, RNase Inhibiter 0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptase IuL(Final Volume 20 μ L),將反應液混合後，室溫下放IOmin,然後42°C溫育60min,再煮沸5min以滅活反轉錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存於-20°C，備用。
[0022](3) PCR 反應(25yL):cDNA 2 μ L, IOXBuffer 2.5 μ L, 10mmol/L dNTP2μ L, 25mmol/LMgC12 2 μ L,上、下遊引物各 2 μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5yL(5U/μ L), ddH2012y L0 反應條件為 94°C 5min 預變性；94°C 40s，54°C 40s, 72 °C lmin,共 32個循環，72°C延伸10min，4°C保存。
[0023]上遊引物:5』 -ATGCCTCCTTCAACGAGTTCAC-3 』
[0024]下遊引物:5』 -TTAACCCCTAAGATGATAC-3 』
[0025](4)基因克隆:取0.5μ I PCR產物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公司產品說明書進行。然後連接產物轉化大腸桿菌DH5ci菌株，在表面塗有氨卞青黴素(100 μ g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
[0026](5)質粒DNA的提取:鹼法提取質粒DNA。
[0027](6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列引物為M13啟動子引物。嗜熱毛殼菌CtAA9c基因cDNA全長1020bp，包含起始密碼子和終止密碼子，無內含子，編碼313個胺基酸。將此胺基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬於糖苷水解酶第9家族。該序列如下:[0028]⑷SEQ ID NOl 的信息
[0029](a)序列特徵:*長度:1020鹼基對；*類型:核酸；*鏈型:雙鏈；*拓撲結構:線性
[0030](b)分子類型:DNA
[0031](C)假設:否
[0032](d)反義:否
[0033](e)最初來源:嗜熱毛殼菌 Chaetomium thermophilum
[0034](f)序列描述:
[0035]I ATGCCTCCTT CAACGAGTTC ACTTCTTTCA ATCCTGCTTA CTCTCAGCTC CACACTCATC
[0036]61 CCTGACCCGG TATTCGCCCA CTCTCATCTC TCCCACATCG TCGTCAACGG GGCTCTCTAC
[0037]121 CACGGCTATG ACCCGCGAAG CCCCGTTAAG AACCCTGATA GCAACAAAAC ATACAACAAT
[0038]181 CCCAGACCCA ACCATCCTGG TAGTGTTGCT TGGTCATATG CCGCTTTCGA CGATGGCTTC
[0039]241 GTCGCCCCAG AAAATTACTC ACATCCGGAT ATAATTTGTC ACATCGGTGC TACCAGCCCC
[0040]301 AAAGCCCATG CTCCCGTTCG CCCAGGCGAT CTAATCCACA TTCAATGGAA CGGTTGGCCT
[0041]361 GTGGGGCACG TCGGTCCTAT CCTGACATAC ATCGCTCCCT GCAAAAGCCA GTCCGGGTGT
[0042]421 GCAGGTGTGG ATAAGACGAC CCTGAGATGG ACAAAAATTG ATGAGTCTCG TCCCGTACTA
[0043]481 GAGATTCTCC CGAACAATGA GAATCGCTGG GATGTGGAAC ACGGCCGGGC TGGCATAGTA
[0044]541 GGAAAGAGGT GGGCCACAGA TGTGATGGTT GCTGCCAACA ACAGCTGGCA GGTAGAGGTG
[0045]601 CCAAGGGGTT TGGCGCGCGG GGCGTATGTG ATGAGACATG AGATTATTGC ATTGCATTTT
[0046]661 GCGGCGAAGA GGGGAGGGGC GCAAAATTAC CCTGTGTGCT TTAATCTGTG GATTGAGGGA
[0047]721 GAGAAAGAGG GGAGCGTGAC GCTAGATGGG TATGATGCTA GGGAGTTTTA TCGGGATGAT
[0048]781 CATATTGGCG TGTGGGTAAA TGTCACAGCT CCAGCGCTGG CGAGTTACAT CATTCCGGGG
[0049]841 CCAACGATAG CCAGCTGGGC TATGCCAGTC CCGTATGCGC AGCAGACCTC GATGTTACTG
[0050]901 AGATCAGAGG GAACTCCCGT TGTTGTGACG AGGAGTACAG AGACCGTACT GTGGACTGCA
[0051]961 GAGGTGACAC CTACACCTAC CGGCCAAGCT GTTCGACACA GGTATCATCT TAGGGGTTAA
[0052](B) SEQ ID N02 的信息
[0053](a)序列特徵:*長度:313胺基酸；*類型:胺基酸；*鏈型:單鏈；*拓撲結構:線性
[0054](b)分子類型:蛋白質
[0055](C)序列描述:
[0056]I HSHLSHIVVN GALYHGYDPR SPVKNPDSNK TYNNPRPNHP GSVAffSYAAF DDGFVAPENY
[0057]61 SHPDIICHIG ATSPKAHAPV RP⑶LIHIQW NGffPVGHVGP ILTYIAPCKS QSGCAGVDKT
[0058]121 TLRffTKIDES RPVLEILPNN ENRffDVEHGR AGIVGKRffAT DVMVAANNSff QVEVPRGLAR
[0059]181 GAYVMRHEII ALHFAAKRGG AQNYPVCFNL WIEGEKEGSV TLDGYDAREF YRDDHIGVffV
[0060]241 NVTAPALASY IIPGPTIASff AMPVPYAQQT SMLLRSEGTP VVVTRSTETV LffTAEVTPTP
[0061]301 TGQAVRHRYH LRG
[0062]實施方式3:表達載體的構建
[0063](I)根據分離出的CtAA9c基因的核苷酸序列設計表達引物，在引物的5』端分別引入Ecor I和Not I酶切位點，下遊引物引入6個組氨酸序列，作為純化標籤:上遊引物:5』 -CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACCA CTCTCATCTC TCC-3 (Ecor I);下遊引物:5』 -TTGCGGCCGCTTAACCCCTA AGAT-3』 (Not I )(組氨酸序列)[0064](2)嗜熱毛殼菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。
[0065](3)反轉錄合成cDNA第一條鏈:取2yg總RNA，加入5X反應緩衝液4 μ L，IOmMdNTP2y L，核糖核酸酶抑制劑(40 — 200u/yL)0.5yL，引物 oligodT (I μ g/μ L) I μ L，反轉錄酶(IOu/ μ L) 2 μ L，42°C反應60min，然後85°C IOmin終止反應，稀釋至200 μ L。
[0066](4)PCR 反應(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2.5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/LMgCl22y L，上、下遊引物各 2μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH2012 μ L。反應條件為 94°C 5min 預變性；94°C 40s，54°C 40s, 72°C lmin,共 32 個循環，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0067](5)基因克隆:取2yL PCR產物與pMD18 — T載體進行連接，獲得重組質粒pMD18T/CtAA9c操作步驟按TAKARA公司產品說明書進行。然後連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在塗有AMP的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
[0068](6 )質粒DNA提取:鹼法提取質粒DNA。
[0069](7)用Ecor I和Not I對重組質粒pMD18_T/CtAA9c產物進行雙酶切，同時用EcorI和Not I雙酶切酵母表達質粒pPIC9K，DNA膠回收試劑盒回收純化9a基因及載體pPIC9K片斷。然後進行體外連接，獲得重組質粒pPIC9K/CtAA9c，重組質粒轉化大腸桿菌JM109，在含Amp的LB轉化平板上挑選單菌落，提取質粒DNA，進行PCR和酶切鑑定，測序確認重組質粒的讀碼框正確。
[0070]實施例4.表達糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株的構建及篩選
[0071](I)重組表達質粒的線性化:將重組表達質粒pPIC9K/CtAA9c用限制性內切酶Sac I線性化。
[0072](2)轉化:電擊轉化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受態細胞,轉化方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0073](3)篩選:用滅菌牙籤挑取轉化子對應點種在麗和MD平板上，30°C培養2 — 4d,挑取在MD/MM平板上均生長良好的轉化子為陽性轉化子。挑取陽性轉化子分別點種於250 μ g/mL,300 μ g/mL,400 μ g/mL,500 μ g/mL,600 μ g/mLG418 的 YPD 平板上篩選多拷貝轉化子。
[0074]實施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導表達和活性檢測
[0075](I)將陽性轉化子接種於含25mL BMGY培養基中，30 °C 250rpm/min搖床培養24h(OD600達2 — 6)，離心收集菌體，將細胞重懸於適當體積的BMMY培養基中，至0D_值為1.0，300C 250rpm/min繼續培養，每24h補充甲醇至終濃度為0.5%，每24h取樣，室溫10，OOOg離心5min，取上清進行SDS-PAGE分析。
[0076](2)酶活性檢測:酶活性測定採用DNS法，反應體系及反應條件為100 μ L的酶液，加入200 μ L的0.5%微晶纖維素，100 μ L的醋酸緩衝液(0.4mol/L、pH5.0)60°C反應30min，加入400 μ L DNS試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。對照組用失活的酶液做對照。以失活酶液的活性定義為100%，測定糖苷水解酶CtAA9C的相對酶活性。重複三次，取平均值。蛋白含量測定採用Bradford法。
[0077](3)重組糖苷水解酶CtAA9C的最適反應溫度、pH及熱穩定性:誘導表達的重組糖苷水解酶經過GE公司的HisTrap FF crude金屬配體親和層析柱純化帶有組氨酸標記的重組蛋白質，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組糖苷水解酶測定其性質。在不同溫度和PH條件下分別測定重組糖苷水解酶的對纖維素的酶活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下糖苷水解酶的相對酶活性；將重組糖苷水解酶在不同的溫度下保溫30min，檢測剩餘酶活力。重複三次，取平均值。
[0078]實施方式6:9家族糖苷水解酶對內切纖維素酶N24活性的促進作用及不同金屬離子對其活性的影響
[0079](I)糖苷水解酶對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0080]採用DNS法，分別測定CtAA9C、N24及混合酶在N24最適反應條件下的內切纖維素酶活性，混合酶為CtAA9C和N24等體積混合，反應體系為:CtAA9C50 μ L，N2450 μ L，200 μ L的 0.5%CMC-Na, 100 μ L 的醋酸緩衝液(0.4mol/L、pH5.0)50°C反應 30min，加入 400 μ L DNS試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9C的反應體系中的酶活性定義為100%，分別計算糖苷水解酶CtAA9C、內切纖維素酶N24以及混合酶的相對酶活性。重複三次，取平均值。
[0081](2)金屬離子Mn2+對糖苷水解酶CtAA9C纖維素酶活性的影響
[0082]在反應體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為lmmol/L，在糖苷水解酶CtAA9C最適反應條件下測定其內切纖維素酶活性，不加金屬離子反應體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條件下糖苷水解酶CtAA9C的相對酶活性。重複三次，取平均值。
[0083](3)金屬離子Mn2+對混合酶活性的影響
[0084]在反應體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為lmmol/L，在內切纖維素酶N24最適反應條件下測定混合酶的內切纖維素酶活性，不加金屬離子反應體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條 件下混合酶的相對酶活性。重複三次，取平均值。
[0085]實施方式7:表達CtAA9c基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT9C的保藏
[0086]表達CtAA9c基因的畢赤酵母工程菌株GS_CT_9C的保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期:2013年7月19日；酵母工程菌株編號為=CGMCC N0.7944 ;畢赤酵母工程菌株的分類命名為:巴氏畢赤酵母Pichia pastoris。
【權利要求】
1.一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9c的酵母工程菌株，其特徵在於該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum獲得熱穩定9家族糖苷水解酶基因CtAA9c,將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體PPIC9K，獲得表達重組質粒pPIC9K/CtAA9c，轉化畢赤酵母GSl 15，從中篩選出表達熱穩定糖苷水解酶基因CtAA9c的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9C，該糖苷水解酶CtAA9C對內切纖維素酶的活性具有`明顯的促進作用。
【文檔編號】C12N1/19GK103509727SQ201310423137
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】李多川, 韓超 申請人:山東農業大學