用陽離子去汙劑清除和分離核酸的方法
2023-05-25 03:08:21
專利名稱：用陽離子去汙劑清除和分離核酸的方法
技術領域：
本發明涉及用具有以下通式的陽離子去汙劑清除和分離核酸的方法Y+R1R2R3R4X-(I)式中，Y可表示氮或磷，R1、R2、R3和R4可獨立表示直鏈或支鏈C1-C20-烷基、C3-C6-烯基、C3-C6-炔基和/或C6-C20-芳基以及C6-C26-芳烷基，和X-可表示無機或有機一元或多元酸的陰離子。
優選的組合物中，陽離子化合物由銨鹽構成，其中R1表示高級烷基，優選具有12、14、16或18個碳原子，R2、R3和R4各自表示甲基。
此外，優選的組合物中，R1表示芳烷基，優選苄基，R2表示有12、14或16個碳原子的高級烷基，R3和R4表示甲基。
作為一般的原則，C1-C6-烷基表示有1-6個碳原子的支鏈或直鏈烴基，如果需要可被一個或多個相同或各不相同的滷原子取代，所述滷原子優選氟。
以下是烴基的例子甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(異丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基-丙基。
高級烷基表示支鏈或直鏈C7-C20-烷基，如果需要可被一個或多個相同或各不相同的滷原子取代，所述滷原子優選氟。以下是烴基的例子支鏈或直鏈庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基。
作為一般的原則，C3-C6-烯基表示含有3-6個碳原子的有一個或者可能多個雙鍵的支鏈或直鏈烴基，如果需要可被一個或多個相同或各不相同的滷原子取代，所述滷原子優選氟。
以下是所述烴基的例子2-丙烯基(烯丙基)、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1，1-二甲基-2-丙烯基、1，2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-3-丁烯基、1，2-二甲基-2-丁烯基、1，2-二甲基-3-丁烯基、1，3-二甲基-2-丁烯基、1，3-二甲基-3-丁烯基、2，2-二甲基-3-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-3-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1，1，2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基。
作為一般的原則，C3-C6-炔基表示含有3-6個碳原子的有一個或者可能多個三鍵的支鏈或直鏈烴基，如果需要可被一個或多個相同或各不相同的滷原子取代，所述滷原子優選氟。
以下是所述烴基的例子2-丙炔基(炔丙基)、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-甲基-2-丁炔基、3-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、3-甲基-3-丁炔基、1，1-二甲基-2-丙炔基、1，2-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-甲基-2-戊炔基、2-甲基-2-戊炔基、3-甲基-2-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、3-甲基-3-戊炔基、4-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、3-甲基-4-戊炔基、4-甲基-4-戊炔基、1，1-二甲基-2-丁炔基、1，1-二甲基-2-丁炔基、1，1-二甲基-3-丁炔基、1，2-二甲基-2-丁炔基、1，2-二甲基-3-丁炔基、1，3-二甲基-2-丁炔基、1，3-二甲基-3-丁炔基、2，2-二甲基-3-丁炔基、2，3-二甲基-2-丁炔基、2，3-二甲基-3-丁炔基、1-乙基-2-丁炔基、1-乙基-3-丁炔基、2-乙基-1-丁炔基、2-乙基-2-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基、1，1，2-三甲基-2-丙炔基、1-乙基-1-甲基-2-丙炔基和1-乙基-2-甲基-2-丙炔基。
除非另有說明，芳基表示含有4-22個碳原子的芳族單環或多環基團，可含有一個或兩個雜原子。例子有苯基、萘基、蒽基和吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基或吡嗪基，如果需要可被一個或多個滷原子取代，所述滷原子優選氟，或者可被烷基獨立取代一次或多次。
根據上述定義，芳烷基指通過C1-C6-烷基、C3-C6-烯基或C3-C6-炔基橋鍵結合到陽離子部分結構的單環或多環芳基，其中C1-C6-烷基、C3-C6-烯基和C3-C6-炔基具有相應的定義。出於本發明的目的，優選苄基。
優選的陰離子是溴離子、氯離子、磷酸根離子、硫酸根離子、甲酸根離子、乙酸根離子、丙酸根離子、草酸根離子或琥珀酸根離子。
分離核酸的方法是本領域熟知的。因此，根據本領域最確定的方法之一，從生物原料(如細胞和組織)分離DNA的方法是，在強變性和還原條件(部分還可使用蛋白質降解酶類)下溶解含有核酸的原料並通過透析法或乙醇沉澱法從含水相分離由此釋放出的核酸[J.Sambrock、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Cold Spring Harbor，″分子克隆(Molecular Cloning)″]。
這種方法的主要缺點在於，從細胞，尤其從組織分離核酸非常耗時，通常需要2天以上。此外，該方法需要非常昂貴的設備，且包括使用苯酚或氯仿之類會刺激皮膚或損害健康的物質。
出於這種情況，本領域早期開發了一些其它的方法，這些方法能避免上述核酸提取中出現的缺點。
所有這些方法都基於由Vogelstein和Gillespie建立並首次描述(Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1979，76，615-619)的方法從瓊脂糖凝膠上製備性及分析性清除DNA片段。該方法包括將含有待分離DNA條帶的瓊脂糖溶於離液序列高的(chaotropic)鹽(NaJ)的飽和溶液，並使DNA結合到玻璃顆粒上。固定到玻璃顆粒上的DNA隨後用洗滌溶液(20mM Tris HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩衝液)[pH 7.2]，200mM NaCl；2mM EDTA；50％v/v乙醇)洗滌，然後從載體顆粒上解吸。
迄今為止該方法已經過一系列改進，目前被用於不同起源核酸的不同的提取和清除方法中(Marko，M.A.、Chipperfield，R.和Bimboim，H.G.，Anal.Biochem.，121，(1982)382-387)。
因此，可購得許多用於進行這種類型核酸提取的試劑組合(所謂的試劑盒)。
這些幾乎專門的市售試劑盒是基於充分熟知的核酸在存在不同離液序列高的鹽的溶液和使用精細研磨的玻璃粉(例如Glasmilk，BIO 101，La Jolla，CA、二價鹼土金屬(Sigma)或者甚至矽膠(歐洲專利申請616 639)作為載體物質時能結合無機載體的原則。
Boom等已經描述了原則上可用於大量不同應用的分離核酸的方法[EP 389 063A1]。在該歐洲專利申請中，描述了通過將含有核酸的原料和DNA-結合固相的離液序列高的緩衝液一起孵育而從原料分離核酸的方法。離液序列高的緩衝液能裂解原料並使核酸結合固相。該方法也適合從小的樣品量分離核酸，並且特別適合分離病毒核酸。
儘管由於可能難以裂解原料而造成的問題可通過一系列市售的分離核酸的產品(尤其是用於分離複合原料的基因組DNA時)解決，但他們的主要缺點在於，由於原料的裂解是在採用蛋白水解酶的常規緩衝液中進行的，因此這不再是以Boom等披露的上述方法為特徵的經典的「單管法」。隨後核酸結合到離心膜所需的離液序列高的離子，例如，必須在裂解完成時再加入裂解製品中。由於熟知離液序列高的鹽的蛋白質破壞功能，且自然會立即破壞有效裂解所需的蛋白水解酶，因此無論何時它們都不能形成裂解緩衝液的一部分。
儘管有許多缺點，但用離液序列高的鹽分離核酸的方法已被全世界認可並被廣泛用於市售產品。這些系統使用非常簡單，在所有情況下都按照以下程序使用●裂解原料，隨後將核酸結合到位於離心柱內載體懸浮液上的玻璃或二氧化矽膜的固相上；●洗滌結合的核酸，和●用低離子強度緩衝液洗脫核酸；所有這些系統都基於在存在離液序列高的鹽，即存在至少一種以離液序列高的鹽作為其主要組分的緩衝液時核酸與各載體表面的結合。某些情況下甚至可用於所述裂解緩衝液，或者在採用蛋白水解酶類的系統中用於必需的結合緩衝液(在裂解完成後加入原料)。
用來鹽析出負電、中性或鹼性蛋白質溶液的霍夫邁斯特序列形成了選擇合適離液序列高的鹽的基礎。離液序列高的鹽的特徵在於能夠使蛋白質變性、增加非極性物質在水中的溶解度、和破壞疏水相互作用。根據本領域的現狀，僅這些特徵也能破壞水環境與離液序列高的鹽緩衝系統的疊加結構，促進核酸與所選固相的結合。最常見的分離核酸的試劑是高氯酸鈉、碘化鈉、碘化鉀、異硫氰酸胍和鹽酸胍。然而，它們一方面成本較高另一方面有一定程度的毒性或刺激性。
專家已經解釋了存在離液序列高的鹽時核酸結合無機載體的物理-化學原理。核酸與無機載體表面的結合在於破壞水環境的疊加結構，通過這樣核酸就吸附到無機材料尤其是玻璃或二氧化矽顆粒表面。通常必需存在離液序列高的離子以破壞水環境的疊加結構。當離液序列高的鹽的濃度高時，反應幾乎定量進行。由於已經描述了這種物理-化學原理，就本領域現狀可以假設，所有分離核酸的市售系統必須含有高離子強度的離液序列高的鹽的緩衝組合物以將核酸結合到核酸結合固相。
此外，本領域還已知不使用離液序列高的物質或苯酚的合適的方法，這樣可避免上述缺點。國際專利申請WO 00/034463公開了這種類型的從複合原料分離核酸的方法。在這些方法中，採用了含有至少一種離液序列低的鹽組分並以所謂醇結合化學工作的裂解/結合緩衝系統(Invitek(柏林)製造的Invisorb質粒試劑盒)。
然而，使用醇類也有一些缺點，具體包括以下這些●為進行精確質粒分離以防止要分離的質粒(尤其是含有RNA的質粒)出現汙染，必須小心維持樣品裂解產物與醇的精確體積比。
●離液序列高和醇的結合化學都導致DNA分離物被內毒素強烈汙染。為了能夠持續結合固相(通常是膜)，其它洗滌步驟必須限制為使用含有大量醇的緩衝液。使用其它必需物質的可選洗滌步驟因此難以用於該目的。
●分離的DNA中所含的內毒素可導致與進一步使用以這種方式分離的DNA有關的問題一例如藥物應用。
因此，本發明的目的首先包括克服上述缺點。
通過使用通式(I)的陽離子去汙劑來使核酸結合到固體基質可解決該問題。適合的基質一例如纖維素一是本領域已知的。然而，根據本發明，優選二氧化矽或玻璃纖維基質。
本發明方法的主要順序原則可描述如下，以使用質粒製品為例首先從含有細菌的培養基分離細菌，之後，出於實踐目的，使它們以團的形式存在。在隨後的步驟中，將該團重懸於重懸緩衝液。這種類型的重懸緩衝液是本領域已知的(例如，50mM Tris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，含RNA酶A)。
將如此獲得的懸浮液與裂解緩衝液(這裡可使用的裂解緩衝液與精通本領域的技術人員已知的類似)，例如200mM NaOH，1％SDS混合。裂解後，根據製品的形式用中和緩衝液將製品中和。這裡可使用的中和緩衝液也是精通本領域的技術人員熟知的。它們包括，例如，pH值為5的3M的乙酸鉀水溶液。
需要的話過濾所得反應混合物。合適的濾器是本領域熟知的並可購得(如來自QIAGEN公司(D-40724 Hilden)的QIAfilterMidi)。然後將裂解產物與一種或多種通式(I)的化合物(優選水溶液)混合，混合後置於二氧化矽柱上，優選所謂的旋轉柱。(根據操作過程，通式(I)的化合物可以已經加入裂解緩衝液以進行「溫和裂解」，可參見第4部分)如果旋轉柱的體積不足以容納所有的量，可在旋轉柱上放置漏鬥形式的延長器，以便能夠容納所有量的液體。通過施加真空或通過離心使反應混合物轉移或吸收通過柱，從而所需核酸(這裡是質粒DNA)結合到表面，優選結合到二氧化矽表面。
如果需要然後用洗滌緩衝液將柱洗滌數次。這種類型的洗滌緩衝液是本領域熟知的，並包括諸如「PE緩衝液」(QIAGEN，Hilden)的緩衝液。
如果需要可通過離心除去任何存在的殘餘洗滌緩衝液。
最後，用同樣是本領域已知的洗脫緩衝液從柱上洗脫結合的核酸。
因此，本發明涉及分離和清除核酸的方法，該方法通常包括以下步驟-裂解含有核酸的生物樣品；-需要的話中和裂解所得製品；-將如此獲得的反應混合物與一種或多種通式(I)的化合物或其水溶液混合，並使反應混合物接觸矽基基質(silica-based matrix)；-洗滌核酸；-分離核酸。
此外，本發明涉及上述方法，其中，將含有200mM NaOH和1重量％/V SDS的水溶液用作裂解緩衝液。
此外，本發明涉及上述方法，其中，用2-3M的乙酸鉀水溶液作為中和緩衝液。
此外，本發明涉及上述方法，其中，優選用300-1000mM、特別優選400-800mM、尤其優選500-600mM的氯化鈉水溶液作為洗滌緩衝液。
此外，本發明涉及上述方法，其中，用pH值為7.5的70-90％的緩衝乙醇水溶液作為洗滌緩衝液。合適的緩衝液是本領域已知的，其中包括，例如，Tris/HCl、MOPS和類似的緩衝液混合物。
此外，本發明涉及通式(I)的化合物的在將核酸可逆結合到無機基質中的應用，其中所述基質可由基於金屬氧化物或金屬氧化物混合物的多孔和/或非多孔載體構成，並可優選由矽-氧化合物，特別優選二氧化矽(矽石)，或由矽酸鹽，或由玻璃、矽膠或沸石構成。
此外，所述無機基質可由氧化鋁、二氧化鈦或二氧化鋯構成，或者可使用上述金屬氧化物的混合物。
具體地說，本發明涉及通式(I)的化合物的應用，用於結合單鏈和/或雙鏈DNA和/或RNA形式的核酸以及單個核苷酸和/或核糖核苷酸，若為DNA，該DNA是基因組DNA、質粒DNA和/或質體DNA，若為RNA，該RNA是mRNA、tRNA、rRNA和/或sn-RNA。
最後，本發明涉及分離和/或清除核酸的試劑盒，該試劑盒至少包含通式(I)的化合物。
實施例之後用以下實施例例證本發明採用以下縮寫CTAB 鯨臘基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨TTAB 十四烷基三甲基溴化銨DoTAB十二烷基三甲基溴化銨DTAB 癸基三甲基溴化銨OTAB 辛基三甲基溴化銨GEL 通過瓊脂糖凝膠密度評價得到的產量min 分鐘PE緩衝液 市售洗滌緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)EC緩衝液 市售細胞培養緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)RLT緩衝液市售裂解/結合緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)EB緩衝液 市售洗脫緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)DP3緩衝液市售中和緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)S3緩衝液 市售中和緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)CE3緩衝液市售抽提緩衝液(QIAGEN，D-40724 Hilden)OD 通過260nm光度測量得到的產量(光密度)RT 室溫(約20-25℃)X多次測量的平均值第1部分用陽離子去汙劑清除和分離核酸除非另有說明，實施例1-4按照以下方法進行方法(1)用於以「中等規模」從大腸桿菌製備質粒DNA1.將細菌團重懸於2ml重懸緩衝液；2.加入2ml裂解緩衝液，然後裂解約3min；3.加入2ml中和緩衝液，通過翻轉混合；
4.立即轉移到QIAfilterMidi，在RT培育3min，然後過濾；5.在旋轉柱上接上10ml延長器，並放置在QIAvac上；6.在裂解產物中加入2ml去汙劑溶液，充分混合併放在柱上；7.吸出混合物，除去真空；8.棄去延長器；9.將旋轉柱置於收集管內；10.任選地通過加入750μl鹽緩衝液來洗滌膜，在14,000rpm下離心1min；11.加入750μl PE緩衝液洗滌膜，在14,000rpm下離心1min；12.再在14,000rpm下離心1min以除去殘餘緩衝液；13.將旋轉柱置於1.5ml離心管上；14.用200μl EB緩衝液洗脫。用移液管移到膜上，培育1min並離心(14,000 pm1min)。
實施例1比較本發明的使用去汙劑的結合化學和所謂的「醇」結合化學根據本發明的方法(1)，分別用2ml、2.5ml和4ml去汙劑溶液(4重量％，用0.5MNaCl配製)或用異丙醇沉澱25ml DH5α/pCMVβ培養物(高拷貝質粒)表1和2CTAB結合，OD260產量(μg)20 異丙醇結合，OD260產量(μg)
表3和4CTAB結合，GEL產量(μg) 25 CTAB結合，GEL產量(μg)
如以上數據所示，去汙劑結合系統比醇基結合系統更穩定，且產量更高。
實施例2通過鹽濃度控制結合和選擇性在該實施例中，按照方法(1)，每次使25ml DH5α/pBRCMVβ培養物(低拷貝質粒)與不同鹽濃度的CTAB結合。
兩次測定的平均值在下表5和6的各次情況中重現CTAB結合，OD260產量(μg)
CTAB結合，GEL產量(μg)
試驗結果明確顯示，通過選擇合適的鹽濃度可以設置選擇性結合所需核酸的最佳條件。此外，NaCl濃度為0.8M時的光度測量和密度測量值一致證明，只有需要的質粒DNA在相應製品中出現。
實施例3使用含有鹽的洗滌緩衝液除去RNA汙染如果將陽離子去汙劑作為「可溶性陰離子交換劑」，則可以通過分階梯度在結合到膜之後除去不需要的核酸並因此可獲得額外的結合選擇性。
在所示實施例中，按照方法(1)，每次使50ml DH5α/pBRCMVβ培養物(低拷貝質粒)與具有用0.8M NaCl配製的1％CTAB的膜結合。結合的DNA然後用不同氯化鈉濃度的洗滌緩衝液洗滌(方法(1)的任選步驟10)a)無任選洗滌步驟b)300mM NaClc)600mM NaCld)800mM NaCl表7和8CTAB結合，OD260產量(μg)
CTAB結合，GEL產量(μg)
上表顯示的試驗數據以圖的形式重現於
圖1。結果顯示，膜上的去汙劑-核酸複合物的表現與核酸相同，能夠結合陰離子交換劑。因此可用具有合適鹽濃度的洗滌緩衝液選擇性除去汙染物。
此外還顯示，具有相同純度(OD/GEL值幾乎相同)的質粒DNA可與上述所有鏈長在8個碳原子以上的去汙劑一起結合到二氧化矽膜上。同時，產量取決於所用去汙劑和溶液的使用濃度(離子強度)。
文中顯示，結合也可在低鹽濃度下發生，此時不會抑制DNA沉澱。
實施例4分離的DNA的品質為評價分離的DNA的品質，將醇結合化學和陽離子去汙劑結合進行比較。結果示於下面的表9和10a)檢測內毒素汙染(EU/μg DNA)高拷貝質粒 低拷貝質粒(無額外洗滌步驟)
雖然使用醇結合化學時的內毒素濃度在通過二氧化矽技術得到的DNA製品的正常範圍內，但CTAB製品的汙染物在通常只能通過陰離子交換柱獲得的範圍內。
b)內毒素敏感細胞(Huh7)的轉染結果轉染是臨界應用，其中，所用質粒DNA必須儘可能不含汙染物(尤其是內毒素)。
細胞按照SuperFect方法(QIAGEN，D-40724 Hilden)轉染。採用通過陰離子交換柱(Ultrapure100，QIAGEN，D-40724 Hilden)分離的質粒作為參比(100％)。
所得結果示於圖2。
轉染結果顯示，用CTAB分離的DNA的值約為100％，即與陰離子交換柱(Ultrapure 100)得到的製品相同。
另一方面，用異丙醇結合得到的製品的轉染結果明顯較差，有高內毒素值(見上)。
第2部分省略細胞裂解產物的預先純化除非另有說明，按照以下方法進行實施例5-8方法(2)用於以「小規模」(1.5ml細菌培養物)從大腸桿菌快速製備質粒DNA1.將細菌團重懸於150ml重懸緩衝液；2.加入150μl裂解緩衝液，裂解約3min；3.加入150ml中和緩衝液，通過翻轉混合；4.在裂解產物中加入300ml去汙劑溶液，充分混合併放在柱上；5.離心(14,000rpm，1min)；6.通過加入750μl PE緩衝液進行洗滌，在14,000rpm下離心1min；7.再在14,000rpm下離心1min以除去殘餘緩衝液；8.將旋轉柱置於1.5ml離心管上；9.用100μl EB緩衝液洗脫。用移液管移到膜上，放置1min並離心(14,000rpm，1min)。
實施例5省略裂解產物純化時結合的最佳化在該實施例中，按照方法(2)，每次使1.5ml DH5α/pBRCMVβ培養物(高拷貝)與不同鹽濃度的CTAB結合。
給出每種情況下兩次測定的平均值。
基於採用裂解產物純化的結果使去汙劑溶液所需鹽濃度最佳每次採用具有規定鹽濃度的300μl 1％CTAB溶液。
從圖3可見，用1.2和1.4M NaCl得到了最佳結果。這裡需要注意，在這些鹽濃度時採用裂解產物純化未發生進一步結合。相反，0.8M NaCl—採用裂解產物純化時確定的最佳濃度(參見實施例2)-此時導致相當差的結果。
實施例6以旋轉模式製備在該實施例中，按照方法(2)，每次用以1.2M NaCl配製的1％CTAB或異丙醇沉澱1.5ml DH5α/pBRCMVβ培養物(高拷貝)。
各種情況下用DP3緩衝液(3M乙酸銨，pH5.5)和S3緩衝液(2M乙酸鉀，pH5.5)作為中和緩衝液。用來自QIAGEN GmbH公司的QIAprep製品作為額外對照。
如圖4所示，採用陽離子去汙劑CTAB獲得的產量為使用異丙醇的兩倍。採用S3緩衝液僅使陽離子結合量略低，和以往一樣，OD和GEL之間良好相對應。與此相反，當使用異丙醇時OD的量非常高。
實施例7以96孔模式製備，自動在該實施例中，將DH5α/pCMVβ培養物(高拷貝)的搖瓶培養物分布到96孔板中，每孔1.5ml。
隨後在分析儀(例如BR8000/QIAGEN GmbH)上用CTAB或異丙醇同時製備一塊96孔板以形成DNA結合。
選擇最新的DP96法用於用異丙醇分離(每次100μl裂解緩衝液，180μl異丙醇；所謂的「小體積法」)。為用CTAB分離，選擇儘可能與之前採用的旋轉方法類似的方法(每次150μl裂解緩衝液，300μl CTAB溶液)。
確定所有96個孔的OD260產量(見表11和12)。此外，同時對7個孔進行瓊脂糖凝膠密度分析以確定產量。
圖5比較了隨機選擇的7個孔的OD和GEL。新結合化學的優點可從所選範圍的產量清楚看出。兩種情況下OD和GEL之間的一致性一樣好。
下面的表11和12的值(對所有96個孔測定的值)與7個選擇樣品的值的差異不明顯，但仍高出約2-3倍。
CTABOD260
平均11.4μg異丙醇
OD260
平均4.0μg實施例7所得DNA的品質進行不同應用以確定分離的DNA的品質a)限制性分析用鹽敏感性限制性酶消化實施例7中分離的質粒DNA樣品。對照採用同樣的質粒，但首先用陽離子交換柱(例如UP100/QIAGEN GmbH)分離。圖6明確顯示，所有消化的樣品在0.7kb都有預期的額外條帶。未檢測到與對照樣品有何不同。
b)測序能力從下表13可見，所有DNA樣品都有平均約800bp的閱讀長度。各鹼基的信號強度和可讀性的早期啟動也顯示，分離的質粒DNA的品質非常適合測序。
c)內毒素含量檢測用LAL Kinetic Kit(Cambrex)測定序列4中樣品的內毒素含量。
內毒素單位/所用DNA的微克數
測量顯示，內毒素汙染水平與採用離液序列高的結合化學的常規二氧化矽製品(參見實施例4)在相同數量級上。
與此相反，未經裂解產物純化的醇結合化學的值高出約10倍。
結論如實施例5-7所示，在與醇結合化學類似的方法中(也可參見WO 03/040364)，新的結合化學也能省略裂解產物純化，就高通量應用或自動系統而言這是最大的優點。
如實施例6所示，自動方法(2)可非常方便地與已有系統相適應。與醇結合化學相比，陽離子結合化學製造的質粒DNA就品質而言是相同的或者更高，但產量明顯較高。
第3部分隨後清除DNA下面給出了有關清除任意大小DNA的一些例子。此時的目標在於在酶反應之後分離游離核苷酸或引物以及選擇性分離引物和較大DNA分子。
除非另有說明，按照下面的方法(3)進行實施例9-11，該方法顯示了隨後用陽離子去汙劑清除DNA的順序，以便以小規模結合二氧化矽膜。
方法(3)用於根據大小選擇性結合DNA1.將樣品與去汙劑溶液混合；2.充分混合併置於柱上；3.離心(14,000rpm，1min)；4.加入750μl PE緩衝液進行洗滌，在14,000rpm下離心1min；5.再在14,000rpm下離心1min以除去殘餘緩衝液；6.將旋轉柱置於1.5ml離心管上；7.用100μl EB緩衝液洗脫。用移液管移到膜上，放置1min並離心(14,000rpm，1min)。
給出的實施例9-11證實了三個不同參數，這些參數可用於區分不同DNA分子的結合●所用去汙劑的量●pH值●結合製備中所含的離子(陽離子)這三個參數可提供足夠的組合選項，從而能夠方便地獲得任何所需選擇性。
實施例9選擇性結合100bp片段每次將2μg 100bp片段或20聚體溶於50μl EB緩衝液，與不同稀釋度的TTAB溶液(每次300μl)混合，再按照上述方法(3)處理。
圖7所示結果顯示，僅通過改變所用去汙劑的量(這裡為0.07％)便可幾乎定量除去20聚體。
實施例10通過選擇合適的pH值選擇性結合20聚寡核苷酸每次將1μg20聚體或100bp片段溶於100μl EB緩衝液(10mM Tris/HCl，pH8.5)，並與300μl 0.05％乙酸鹽緩衝的TTAB溶液(15mM乙酸/乙酸鈉，pH值為5、7和9)混合。
再按照上述方法(3)處理樣品。
圖8所示結果顯示了回收率，因此在pH5時同時結合20聚體和100bp片段。與此相反，在較高pH值時僅結合20聚體。這顯示，通過本發明的結合化學，僅通過選擇合適的pH值便可實現所需DNA片段的分離。
實施例11通過選擇合適的陽離子選擇性結合或不結合100bp片段每次將2μg 20聚體或100bp片段或pUC21質粒溶於50μl EB緩衝液(10mMTris/HCl，pH8.5)，並與50μl pH值約為5.5的合適的乙酸鹽溶液(見下面a-d所列)混合。在其中加入50μl用500mM NaCl配製的4％的CTAB溶液，並再按照上述方法(3)處理。
a)2M乙酸鉀b)1M乙酸鎂c)1M乙酸鈣d)1M乙酸錳(II)
每次都能分離20聚體而質粒pUC21每次都保持結合。根據所用陽離子，100bp片段可結合或不結合。
因此，圖9顯示，僅通過選擇所用陽離子就能實現對所需DNA分子的某些選擇。
第4部分分離RNA(包含DNA和天然蛋白質)下面將顯示如何將新的結合化學用於從生物材料分離RNA。這裡，用常規的溫和裂解緩衝液(如長期用於分離蛋白質的裂解緩衝液)進行裂解。然而，根據本發明，這種緩衝液含有陽離子去汙劑，這一方面能穩定RNA，另一方面能促進與二氧化矽膜的結合。
採用這種方法，所有核酸在最初的結合步驟中結合，然後用已知緩衝液逐個選擇性洗脫。
與已知的用高濃度離液序列高的鹽鈍化RNA酶以穩定DNA的常規方法不同，在結合陽離子去汙劑時，RNA被保護以免遭攻擊。這意味著樣品中存在的蛋白質仍保留其生物學功能，並且可在通過二氧化矽旋轉柱之後能以天然形式被進一步加工。
相比已知系統這提供了非常顯著的優點，在已知系統中，必須將樣品分開，一份用於分離天然蛋白質並同時進行RNA降解，另一份用於分離核酸並同時使蛋白質變性，這樣做的缺點是每次必須丟棄一半樣品，當分開不均勻的樣品材料時這樣會非常容易地導致錯誤結果。
採用本發明的方法，可以首次在RNA和蛋白質水平對一份相同裂解產物進行功能研究。
有益的是，也可分離基因組DNA，基因組DNA在核查觀察結果以了解它們在遺傳背景中的原因(突變)的分析中非常重要。
除非另有說明，下面的實施例12和13按照以下方法進行方法(4)用於從樣品分離RNA、gDNA和天然蛋白質(用於12孔細胞培養模式的方法)1.除去培養基並用1ml EC緩衝液洗滌細胞；2.將平板在冰上冷卻5min；3.將細胞與400μl裂解緩衝液(1.6份體積抽提緩衝液CE3+1份體積8％TTAB的水溶液)混合，並在室溫放置5min。
(通常用於分離天然蛋白質的任何緩衝液可用作裂解緩衝液的基礎，然後將其與適量陽離子去汙劑混合。)4.刮下細胞並通過上下吸取3次均質裂解產物；5.用市售旋轉柱(例如RNeasy旋轉柱/QIAGEN GmbH)離心裂解產物；6.發現流出液中有蛋白質組分，隨後個別分析；7.用350μl市售離液序列高的緩衝液(例如RLT緩衝液/QIAGEN GmbH)洗脫加載了所得核酸的旋轉柱；8.收集流出液並在步驟10中進一步處理；9.旋轉柱隨後用PE緩衝液洗滌，保留在柱子上的gDNA用EB緩衝液洗脫；10.將含有RNA的RLT流出液與250μl 100％乙醇混合；11.用新的RNeasy旋轉柱離心；12.分離所需RNA，例如採用RNeasy Mini手冊(QIAGEN GmbH/Status 2001-6)第32頁「從動物細胞分離總RNA的RNeasy Mini法」的步驟4。
實施例12RNA和DNA的分離HeLa S3細胞以12孔細胞培養模式培育，每次用兩種不同的常規蛋白質裂解緩衝液(見列表a和b)和作為去汙劑的CTAB裂解4個孔。用合適的Rneasy製品作為參比c)(QIAGEN GmbH)。
a)含1％CTAB的β-G半乳糖苷酶裂解緩衝液(見下文)，用100mM NaCl配製(終濃度為188mM)b)含1％CTAB的細胞抽提緩衝液CE3，用300mM NaCl配製(終濃度為804mM)c)RNeasy Mini(QIAGEN)β-半乳糖苷酶裂解緩衝液10mM Tris(三羥甲基氨基甲烷緩衝液)，pH7.41mM EDTA100mM NaCl5mM MgCl21％NP40然後按照上述方法(4)分離RNA和gDNA。
圖10和11所示結果清楚顯示，尤其在比較製品a)和c)時，用本發明的方法和已知緩衝液組合可同時分離RNA和DNA。其產量和品質可與已有系統相媲美。
在開發過程中最佳化裂解緩衝液CE3的NaCl濃度至最終375mM隨後也能得到可以相媲美的結果。
實施例13分離的蛋白質的品質HeLa S3細胞以12孔細胞培養模式培育，並用攜帶β-半乳糖苷酶基因的質粒轉染。48小時後，按照上述方法(4)裂解細胞，每次將4個孔與兩種不同的常規蛋白質裂解緩衝液(見列表a和b)混合。
採用如用於β-半乳糖苷酶活性測定的標準裂解緩衝液進行裂解作為參比。
a)含3％TTAB的裂解緩衝液b)用3％TTAB裂解緩衝液，隨後用RNeasy旋轉柱離心c)標準β-半乳糖苷酶裂解緩衝液(組合物見實施例12)然後將蛋白質組分與一定體積3％的SDS溶液混合以沉澱TTAB。SDS沉澱之前和之後測量酶的活性。
通過在孔(未顯示)中用β-半乳糖苷酶處理反應溶液顯示出黃色可以證明，所得蛋白質仍具有生物學活性。用本領域已知方法不可能得到這種結果，已知方法採用高摩爾離液序列高的鹽，因此強烈變性緩衝液，這在客觀上造成RNA酶滅活。
權利要求
1.一種從裂解產物中分離和清除核酸的方法，其特徵在於，所述方法包括a)用裂解緩衝液裂解含有核酸的生物樣品；b)如果有必要，用中和緩衝液中和裂解所得製品；c)然後將如此獲得的反應混合物與一種或多種通式(I)的化合物或其水溶液混合，並與無機基質，優選矽基基質接觸Y+R1R2R3R4X-(I)式中，Y可表示氮或磷R1、R2、R3和R4可彼此獨立地表示直鏈或支鏈C1-C20-烷基、C3-C6-烯基、C3-C6-炔基和/或C6-C20-芳基以及C6-C26-芳烷基，和X-可表示無機或有機一元或多元酸的陰離子；d)用洗滌緩衝液洗滌該核酸；e)分離該核酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，R1表示高級烷基，優選有12、14、16或18個碳原子，R2、R3和R4各自表示甲基，Y表示氮。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，R1表示芳烷基，優選苄基，R2表示高級烷基，優選有12、14或16個碳原子，R3和R4各自表示甲基。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗衡離子X是溴離子、氯離子、磷酸根離子、硫酸根離子、甲酸根離子、乙酸根離子、丙酸根離子、草酸根離子或琥珀酸根離子。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，用含200mM NaOH和1重量％/V SDS的水溶液作為裂解緩衝液。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於，用2-3M的乙酸鉀水溶液作為中和緩衝液。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其特徵在於，優選用300-1000mM，特別優選400-800mM，尤其優選500-600mM的氯化鈉水溶液作為洗滌緩衝液，和/或用pH值為7.5的優選含有Tris/HCl的70-90％的緩衝乙醇水溶液作為洗滌緩衝液。
8.通式(I)的化合物在將核酸結合到無機基質中的用途，Y+R1R2R3R4X-(I)式中，Y可表示氮或磷R1、R2、R3和R4可彼此獨立地表示直鏈或支鏈C1-C20-烷基、C3-C6-烯基、C3-C6-炔基和/或C6-C20-芳基以及C6-C26-芳烷基，和X-可表示無機或有機一元或多元酸的陰離子。
9.如權利要求8所述的用途，其特徵在於，R1表示高級烷基，優選具有12、14、16或18個碳原子，R2、R3和R4各自表示甲基，Y表示氮。
10.如權利要求8所述的用途，其特徵在於，R1表示芳烷基，優選苄基，R2表示高級烷基，優選具有12、14或16個碳原子，R3和R4各自表示甲基。
11.如權利要求8-10中任一項所述的用途，其特徵在於，所述抗衡離子X是溴離子、氯離子、磷酸根離子、硫酸根離子、甲酸根離子、乙酸根離子、丙酸根離子、草酸根離子或琥珀酸根離子。
12.如權利要求8-11中任一項所述的用途，其特徵在於，所述無機基質由基於金屬氧化物或金屬氧化物混合物的多孔和/或非多孔載體構成。
13.如權利要求12所述的用途，其特徵在於，所述無機基質由矽-氧化合物，優選二氧化矽，或矽酸鹽構成。
14.如權利要求12所述的用途，其特徵在於，所述無機基質由玻璃、矽膠或沸石構成。
15.如權利要求12所述的用途，其特徵在於，所述無機基質由氧化鋁、二氧化鈦和/或二氧化鋯構成。
16.如權利要求13-15中任一項所述的用途，其特徵在於，使用所述金屬氧化物的混合物。
17.如權利要求8-16中任一項所述的用途，其特徵在於，用於結合核酸，尤其是單鏈和/或雙鏈DNA和/或RNA形式的核酸以及單核苷酸和/或核糖核苷酸。
18.如權利要求17所述的用途，其特徵在於，所述DNA是基因組DNA、質粒DNA和/或質體DNA。
19.如權利要求17所述的用途，其特徵在於，所述RNA是mRNA、tRNA、rRNA和/或sn-RNA。
20.一種分離和/或清除核酸的試劑盒，所述試劑盒包含以下成分-通式(I)的化合物Y+R1R2R3R4X-(I)式中，Y可表示氮或磷R1、R2、R3和R4可彼此獨立地表示直鏈或支鏈C1-C20-烷基、C3-C6-烯基、C3-C6-炔基和/或C6-C20-芳基以及C6-C26-芳烷基，和X-可表示無機或有機一元或多元酸的陰離子如果需要存在於水溶液中，和/或-如果需要，含裂解緩衝液，和/或-如果需要，含中和緩衝液，和/或-如果需要，含洗滌緩衝液，和/或-如果需要，含洗脫緩衝液，和/或-如果需要，含可結合核酸的無機基質。
21.如權利要求20所述的試劑盒，其特徵在於，R1表示高級烷基，優選具有12、14、16或18個碳原子，R2、R3和R4各自表示甲基，Y表示氮。
22.如權利要求20所述的試劑盒，其特徵在於，R1表示芳烷基，優選苄基，R2表示高級烷基，優選具有12、14或16個碳原子，R3和R4各自表示甲基。
23.如權利要求20所述的試劑盒，其特徵在於，所述抗衡離子X是溴離子、氯離子、磷酸根離子、硫酸根離子、甲酸根離子、乙酸根離子、丙酸根離子、草酸根離子或琥珀酸根離子。
全文摘要
本發明涉及用具有通式(I)的陽離子去汙劑清除和分離核酸的方法Y
文檔編號C12N15/10GK101014707SQ200580023800
公開日2007年8月8日 申請日期2005年7月15日 優先權日2004年7月15日
發明者T·辛格 申請人:恰根有限公司