實時螢光定量pcr檢測人腸道病毒的試劑盒的製作方法

2023-05-25 03:14:51

專利名稱：實時螢光定量pcr檢測人腸道病毒的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及實時螢光PCR檢測試劑盒，特別足涉及以實時螢光定量聚合酶鏈反應技術早 期、快速診斷人腸道病毒感染的試劑盒。通過本發明的試劑盒實現對糞便、血清、咽拭子、 腦脊液、皰疹液等樣品中的人腸道病毒的檢測和定量分析。
背景技術：
腸道病毒(enterovirus, EV)屬於微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae),本屬病毒具 有相同的理化生物學特性，包括脊髓灰質炎病毒(Poliomyelitis Vims, PV)、柯薩奇病毒
(Coxsackievirus, CV)、致腸細胞病變人孤兒病毒(enterocytopathic human orphan virus, 簡 稱埃可病毒，ECHOV)及新型腸道病毒等70多個血清型，本屬病毒感染廣泛分布於世界各 地，夏秋季發生流行較多，同一地區每年流行的病毒型別常有改變。普遍易感，但發病以小 兒為多，成人多為隱性感染，但初發地區亦可見成人間的暴發流行。腸道病毒感染臨床表現 複雜多變，病情輕重差別甚大。同型病毒可引起不同的臨床症候群，而不同型的病毒又可引 起相似的臨床表現。腸道病毒71型、A組柯薩奇病毒和埃^病毒的某些血清型感染可引起嬰 幼兒手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)及皰疹性咽峽炎，其中腸道病毒71型
(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)還能引起祌經系統相關疾病，嚴重者致人死亡。 自2008年5月2 R起，手足口病納入丙類傳染病管理。
人是腸道病毒唯一宿主，患者和隱性感染者均為本病的傳染源。腸道病毒主要經山腸胃 道(糞-口、水、食物汙染)或呼吸道(飛沫、咳嗽或打噴嚏)傳染，亦可經接觸病人皮膚、 黏膜泡疹液而感染，並具有起病急、傳播快等特點。
山腸道病毒引起的手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區均有此病流行的報導。20 世紀70年代中期，保加利業、匈牙利相繼暴發以中樞神經系統為主要臨床特徵的EV71流行， 1975年保加利亞報告病例750例，其中149人致癱，44人死亡；1994年英國發生一起山Cox A16引起的手足口病暴發，患者大多為l-4歲嬰幼兒；1997年馬來西亞發生了主要由EV71引 起的手足口病流行，4-8月共有2628人發病，4-6月有29例病人死亡。我國於1981年上海 首次報導本病，此後，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等10幾個 省份均有本病報導。1983年天津發生Cox A16引起的手足口病暴發，5-10月間發生了 7 000
3餘病例。1998年，臺灣地區發生EV71感染引起的手足口病和皰疹性咽峽炎流行，共報告129106 例病例，其中重症病人405例，死亡78例，大多為5歲以下的幼兒，重症病例的併發症包括 腦炎、無菌性腦膜炎、肺水腫或肺出血、急性軟癱和心肌炎。2008年4月，在我國安徽省阜 陽暴發EV71引起的手足口病，短短2周時間內造成23例兒童死亡，隨後全國手足口病報告 病例數直線上升，截止5月9日全國共累計因EV71、 CoxA16等腸道病毒引起的手足口病例近 25000例，34名患兒死亡，給嬰幼兒身體健康、社會穩定帶來嚴重威脅。由於腸道病毒引起 的手足口病等疾病無特效治療藥物和疫苗，而且傳播規律和致病機理不清，快速、準備的檢 測是控制和預防腸道疾病傳播的有效手段。
目前腸道病毒的常規診斷方法還是組織培養、中和抗體實驗以及免疫學診斷等方法。組 織培養需要一定的實驗設備和技術水平，並相當耗時，等培養結果明確時己無益於患者的治 療；而且，約25% 35%的腸道病毒，尤其是柯薩奇病毒A組，不能在組織培養中生長(Lipson SM et al. J Clin Microbiol, 1988:26:1298 1303.)，必須接種到裸鼠體內才能檢測到，因 此，該方法繁雜， 一般需要6 —8天，周期太長，不適合標準化推廣。中和抗體實驗必須採集、 比較患者急性期血清與恢復期血清中和抗體的滴度才有意義，這對於由EV71、 CoxA16等致 病性強的病毒引起的急性、重症疾病來說，顯然無益於患者的診斷。免疫學方法診斷腸道病 毒感染受到不同血清型間抗原性分化的限制，由於腸道病毒血清型繁多，變異快，缺乏能有 效用於免疫學診斷的共同抗原。更重要的是，目前國內外缺乏標準診斷試劑，市面上還沒有 一個可用的診斷試劑盒，因此，開發早期、快速、特異、敏感的檢測試劑盒非常必要。
近年來，隨著分子診斷技術的飛速發展，聚合酶鏈反應(PCR)技術已經廣泛應用於RNA 病毒基因水平的研究，也給微生物的快速鑑定提供了可能。PCR技術克服傳統方法費時、費 力且無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要的缺點， 一般12小時內可以出結果，已 成為腸道病毒快速診斷的重要手段。Rotbart等(Rotbart HA et al. Diagnosis of Enteroviral Meningitis with the Polymerase Chain Reaction. J Pediatr， 1990， 117:85-89.) X才些患有 手足麻痺可疑為腦膜炎的病兒進行病原學檢查，在臨床診斷為無菌性腦膜炎的12例病人的腦 脊液標本中，用PCR方法全部檢出腸道病毒RNA的存在；Sawyer等(Sawyer MH et al. Diagnosis of enteroviral central nervous system infection by polymerase chain reaction during a large community outbreak.Pediatr Infect Dis J， 1994, 13:177-182.)在腸道病毒感染大面積流行 時，用PCR技術對感染有中樞神經系統疾病的患兒進行病原學分析，在112例腸道病毒培養 陽性的腦脊液標本中，PCR檢測出109例(97% )含有腸道病毒RNA; 53例腸道病毒培養陰 性或沒做腸道病毒培養鑑定的腦脊液標本中，PCR檢測出35例(66%)腸道病毒為陽性。 Nix WA ， (N丄x WA et al. Identification of enteroviruses in naturally infected captiveprimates. J Clin Microbiol. 2008 Jul 2.)以及梅元武等(梅元武等.病毒性腦炎患者腸 道病毒RT-PCR檢測的臨床意義初探.中華神經醫學雜誌，2006， 5 (1): 33-37)分別用PCR
技術檢測出腦膜炎患者標本中的腸道病毒，並論證了 PCR技術在臨床腸道病毒診斷中的積極意義。
實時螢光PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有核電偶聯裝置 (CCD)的PCR擴增儀，通過檢測螢光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平。 CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測螢光信號，並通過軟體 分析匯總到工作站得到擴增曲線。TaqMan PCR技術是實時螢光PCR的一種(Mackay IM W a/. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6):1292-1305; Lie, Y.S., Petropoulos， C丄,Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9,4348.)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別 標記螢光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，螢光報告基團發出螢光的能量轉移 給淬滅基團，呈現淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸 被水解切斷，螢光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間螢光共振能量轉移效應，熒 光報告基團發出螢光信號。隨著擴增的進行，螢光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。
與普通PCR相比，TaqMan PCR技術具有如下優點通過對擴增曲線以及對數增長期的 循環閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素幹擾的終點分析方法，能夠對檢測樣 品進行準確定量分析，從而有效監測藥物治療的效果；將DNA擴增與檢測過程融合為一體， 可以實時、動態監測DNA擴增的全過程，省掉了PCR後處理過程大大縮短了結果分析時間， 使得該方法更加快捷、方便；由於採取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠汙染和由此 造成的假陽性；由於在普通PCR基礎上增加了一條可與模板互補配對的螢光探針，進一歩提 高了檢測靶多核苷酸的特異性。因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐 漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。
美國食品與藥品管理局(FDA)已經批准了一些定量檢測病原體的PCR診斷試劑盒，如 用於HIV、結核分枝桿菌、沙眼衣原體等的實時螢光PCR檢測的試劑盒。同樣，中國目前也 已批准了B型肝炎、C型肝炎、HIV和SARS等的實時螢光PCR檢測試劑盒的生產和臨床應用。 因此，通過實時螢光PCR技術能夠開發一種檢測腸道病毒核酸的試劑盒，滿足腸道病毒快速 檢測與監測工作的需要。
眾所周知，在使用己知的實時螢光定量PCR技術檢測和定量分析臨床樣品中某特定靶核 酸的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性， 一個關鍵性的基本技術環節是如何基於已知的靶多核苷酸序列設計並製備適當的引物和寡核苷酸探 針。本發明人將實時螢光定量PCR技術開發了應用於腸道病毒的檢測和定量分析，成功地完 成了本發明。

發明內容
本發明涉及檢測糞便、血清、咽拭子、腦脊液、皰疹液等樣品中的腸道病毒存在的試劑 盒，特別是涉及以實時螢光定量聚合酶鏈反應技術早期、快速診斷腸道病毒感染的試劑盒。
因此，本發明的目的是提供一種使用實時螢光PCR技術來定性及定量檢測樣品中腸道病 毒的試劑盒，特別是涉及腸道病毒的早期感染在實驗室診斷中的應用。基本原理是利用一對 靶多核苷酸的特異性引物和一條靶多聚核苷酸的特異性探針，在耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、 逆轉錄酶(RT酶)、RNA酶抑制劑(RNasin)、高質量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg^ 等PCR反應緩衝液中，通過DA7600、 ABI7500等螢光PCR擴增儀實現靶多核苷酸的循環擴增， 從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。
本發明所提供的檢測臨床樣品中腸道病毒的試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液(即 TRIZOL核酸抽提試劑)、PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品和定量參考品並加蓋密 封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特徵在於PCR擴 增反應液中用於靶多核苷酸擴增的正向引物EV-F和反向引物EV-R的序列分別是5'-GGTAGTGTGTCGTAATGGGCAACTCAC-3' (SEQ ID NO: 1)和5'- TTCTATAATTGTCACCATAAGCAGTCA -3' (SEQIDNO: 2)，其中正向引物EV-F可向5'和3，端方向各延伸10個鹼基，反向引物EV-R可向5' 和3'端方向各延伸10個鹼基。
根據本發明的-個優選實施方案，PCR擴增反應液中用於靶多核苷酸擴增和監測體系的 寡核苷酸探針EV-P的序列是5'- CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTT -3' (SEQ ID NO: 3)， 其中該寡核苷酸探針序列可向5'和3'端方向各延伸10個鹼基。
根據本發明的另一個優選實施方案，其中PCR擴增反應液由(a)耐熱DNA聚合酶(Taq 酶)、(b)逆轉錄酶(RT酶)、(c) RNA酶抑制劑(RNasin)、 (d)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、 (e)能夠與雙鏈耙多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物，(f)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二 條鏈結合的反向引物，(g)和能夠與靶多核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光報告基團和 螢光淬滅基團的寡核苷酸探針組成。
根據本發明的另一個優選實施方案，其中用於PCR擴增反應液中的最佳引物濃度為 0.40pmol/L、探針濃度為0.20nmol/L;
根據本發明的另一個優選實施方案，其中用於PCR擴增反應液中的最佳鎂離子濃度為2.0mmol/L、 Taq酶最佳用量為5U/反應、RT酶最佳用量為100U/反應、RNasin最佳用量為20U/反應、脫氧核糖核苷三磷酸最佳濃度為0.21mmol/L。
根據本發明的另一個優選實施方案，其中用於PCR擴增的最佳反應溫度和時間為40°C逆轉錄25min;然後94。C預變性3min;最後93。C 15s， 55°C 45s， 40個循環。
根據本發明的另一個優選實施方案，其中陰性質控品為生理鹽水。
根據本發明的另一個優選實施方案，其中陽性質控品為滅活腸道病毒71型(ATCC VR-784)純培養上清液，包括l X 106 PFU /ml的強陽性質控品和l X 103 PFU /ml的臨界陽性質控品。
根據本發明的另一個優選實施方案，其中定量參考品為滅活腸道病毒71型(ATCC VR-784)純培養上清液，包括4個濃度梯度1.0X107PFU/ml、 1.0X106PFU/ml、 l.OX 105 PFU/ml、1.0X104 PFU/ml。
本發明提供的實時螢光定量PCR檢測試劑盒可以檢測出腸道病毒的最低濃度為5.0X102PFU/ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。
本發明針對腸道病毒5'端非編碼區保守基因片段設計特異引物和探針，可檢測出腸道病毒，但不能檢測出非腸道病毒病原體，說明本試劑盒具有很好的特異性。
本發明提供的實時螢光定量PCR檢測試劑盒可以檢測糞便、血清、咽拭子、腦脊液、皰疹液等樣品中的腸道病毒；可為靈敏、快速早期診斷腸道病毒感染提供可靠的實驗證據；同時由於能準確定量，所以可對臨床用藥進行有效監測。


圖l顯示線性與靈敏度參考品的檢測結果圖。針對模板數為5.0Xl(y 5.0X10》FU /ml的線性與靈敏度參考品進行TaqManPCR檢測分析，檢測結果表明，當病毒量為5.0X 102 PFU/ml時，檢測樣品的Ct值在34左右，即檢測下限靈敏度可到達5.0X 102PFU/ml。
圖2顯示定量參考品擴增結果的標準曲線圖。針對模板數為1.0X1(^ 1.0X10》FU /ml的定量參考品進行T叫Man PCR檢測分析，繪製得到的標準曲線斜率為一3.85,在Y軸截距為44.60,相關係數(R2) =0.9977。
圖3顯示8個陽性參考品的檢測結果圖。8個陽性參考品的螢光擴增曲線有明顯指數增長期，並與設定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值分別為17.42, 19.69,20.96, 21.42,22.87,25.39,27.00,28.48，可明確判定為陽性。8個陽性參考品分別為腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)、柯薩奇病毒B組2型(CoxB2)、埃可病毒、脊髓灰質炎病毒以及新型腸道病毒68型、69型和70型。
圖4顯示10個陰性參考品的檢測結果圖。IO個陰性參考品的擴增曲線平直或斜向下且與閾值線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。IO個陰性參考品分別為與腸道病毒感染有相似症狀的腺病毒、輪狀病毒、諾沃克病毒、流感病毒A以及6份正常人的糞便樣品。
圖5顯示同一份陽性參考品(5X104PFU /ml) 7次重複性實驗的檢測結果圖。可看出不同擴增曲線的Ct值均在27至28之間，計算得出變異係數CV二5X，說明試劑盒的重複性好。
圖6顯示6個臨床陽性標本的擴增曲線。6個標本的Ct值分別是19.01， 20.16， 23.14， 23.63，25.43， 28.80;結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性。
具體實施例方式
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。
實施例l:人腸道病毒螢光PCR檢測試劑的研製
1、 引物和探針的設計通過對Genbank資料庫已有的腸道病毒核酸序列以及國內外己發表文獻中報導的核酸序列進行序列比對分析，以腸道病毒的5'非編碼區保守基因片段為擴增靶位點，選擇無二級結構且高度保守的區段，根據引物探針設計的基本原則，利用軟體和人工設計多對引物和探針。
2、 樣本的選擇根據國內外相關文獻報導表明，可以選擇糞便、血清、咽拭子、腦脊液、皰疹液等樣品。
3、 反應體系的建立與優化
樣品的準備以病毒培養和測序鑑定為陽性的8種腸道病毒作為陽性參考品，分別為腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)、柯薩奇病毒B組2型(CoxB2)、埃可病毒、脊髓灰質炎病毒以及新型腸道病毒68型、69型和70型；以腺病毒、輪狀病毒、諾沃克病毒、流感病毒A型以及6份正常人的糞便樣品，共10份樣品作為陰性參考品。分別用TRIZOL提取上述陽性參考品與陰性參考品的RNA待用。
引物探針的篩選以上述l中設計的多組引物探針分別檢測上述的陽性參考品與陰性參考品的RNA，經反覆試驗，篩選出特異性、靈敏度和重複性好的最佳引物探針組合(如序列表中SEQIDNO: 1 SEQ1DN0: 3)。
引物探針濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.15,ol/L至0.5pmol/L濃度梯度的引物和從0.075^imol/L至0.5pmol/L濃度梯度的探針進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的引物濃度為0.40pmol/L、探針濃度為0.20nmol/L。
Taq酶用量的優化在25pL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1U (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的Taq酶用量為5U/反應。RT酶用量的優化在25pL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從50U (酶單位)至400U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的RT酶用量為100U/反應。
RNasin用量的優化在25pL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的RNasin用量為20U/反應。
dNTPs濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.1mmol/L至0.25mmol/L濃度梯度的dNTPs進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為0.21mmol/L。
反應溫度的優化根據酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優化，經多次重複試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為40。C逆轉錄25min;然後94。C預變性3min;最後93。C 15s， 55°C 45s， 40個循環。
4、 靈敏度實驗測定出濃度為5.0Xl(^PFU/mL的滅活腸道病毒71型(ATCCVR-784)純培養上清液，10倍梯度稀釋成5.0Xl7pFU/mL、 5.0X 106 PFU/mL、 5.0X 105 PFU/mL、 5.0X104PFU/mL、 5.0X103 PFU/mL、 5.0X 102 PFU/mL、 5.0X 10'PFU/mL作為線性與靈敏度參考品，進行T叫ManPCR檢測分析，檢測結果如附圖l所示，當病毒量為5.0X 102 PFU/m塒，檢測樣品的Ct值在34左右，即檢測下限靈敏度可到達5.0X 102 PFU /ml。
5、 標本檢測；以糞便、血清、咽拭子、腦脊液、皰疹液等作為待檢標本，分別用TR1Z0L提取標本的RNA後，經上述優化建立的核酸擴增體系檢測，結果表明本試劑盒可以很靈敏的檢測出臨床標本中的腸道病毒。
實施例2:人腸道病毒螢光PCR檢測試劑盒及其使用
1、 製備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50ml/管)l管、PCR擴增反應液(2(^1滑)24管、陰性質控品(100nl/管)l管、陽性質控品(lOO^il/管)l管、定量參考品(50 p1/管)4管。
2、 標本採集、運送和保存
(1) 標本採集標本採集對象是暴發疫情出現時手足口病的臨床診斷病例和病例發病所在社區(村)的臨近無病例的社區(村)或託幼機構的5歲以下的兒童(作為健康對照人群)。
標本應冷凍運輸，運輸時要附有必要的信息，如標本編號、發病R期和標本採集H期。
(2) 標本保存和運送①糞便標本採集病人發病7日內的糞便標本，採集量5 8g/份，採集後立即放入無菌採便管內，4'C暫存立即(12h內)送達實驗室，一2(TC以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存於一7(TC冰箱。
② 咽拭子標本
採集病人發病3日內的咽拭子標本，用專用採樣棉籤，適度用力拭抹咽後壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉籤放入裝有3 5ml保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的採樣管中，在靠近頂端處折斷棉籤杆，旋緊管蓋並密封，以防乾燥。4'C暫存立即(12h內)送達實驗室，—2(TC以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存於一7(TC冰箱。
③ 血清標本
靜脈採集3 5ml全血，置於真空無菌採血管中，自凝後，分離血清，將血清置於一2(TC以下冰箱中冷凍保存。
④ 皰疹液
同時採集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然後用消毒針將皰疹挑破用棉籤蘸取皰疹液，迅速將棉籤放入內裝有3 5ml保存液(維持液或生理鹽水，推薦使用維持液)的採樣管中，在靠近頂端處折斷棉籤杆，旋緊管蓋並密封。所採集標本4。C暫存立即(12h內)送達實驗室，一20。C以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存於一7(TC冰箱。
⑤ 腦脊液標本
出現神經系統症狀的病例，要採集腦脊液標本，採集時間為出現神經系統症狀後3天內，採集量為1.0 2.0ml。採集後立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4。C暫存立即(12h內)送達實驗室，一2(TC以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存於一7(TC冰箱。3、檢測歩驟(1) RNA提取
水樣糞便、血清、腦脊液、皰疹液等液態樣本各IOO ^ (樣品不足100pl時請補加適量生理鹽水重懸)，放置於1.5ml滅菌離心管，加入200pl Trizol試劑及100iil氯仿，用振蕩器強力振蕩20秒後靜置3分鐘；
2 8。C下12,000rpm離心10min，吸取上清至另一乾淨的1.5ml離心管；加入0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，手動用力顛倒搖動15s (不可用振蕩器)，室溫孵育2 3min;2 8°C下12000rpm離心15min後，取最上層的上清液至另一乾淨的1.5ml離心管；加入0.5ml預冷的異丙醇，緩慢顛倒充分混勻後，一20。C靜置15min， 2 8°C， 12000rpm離心10min，小心棄盡上清液；加入lml預冷的70%的冰冷乙醇，手動顛倒數次洗滌沉澱，2 8°C, 8000rpm離心5min，小心棄盡上清液；
空氣或真空乾燥5 10min，加入5(HU DEPC H20， 55 60。C下孵育10min，手指輕輕彈打管底，使其充分溶解，直接取上清用於PCR實驗或-70。C保存備用。(2) PCR反應與結果分析
分別取陰性質控品、標本、陽性質控品、定量參考品各5pl，加入PCR反應管中進行PCR擴增。PCR循環條件是40。C逆轉錄25min;然後94。C預變性3min;最後93。C 15s， 55°C 45s，40個循環。
反應結束後保存檢測數據文件。根據PCR擴增結果所得到的曲線圖調節分析參數，使標準曲線(Std curve )窗口下的定量參考品標準曲線達到最佳(即相關性數值絕對值〉0.97)(參見附圖2所示)。由附圖3可以看出，8個陽性參考品的螢光擴增曲線有明顯指數增長期，並與設定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值分別為17.42, 19.69,20.96, 21.42, 22.87,25.39,27.00,28.48;在附圖4中，由於10個陰性參考品的擴增曲線平直或斜向下且與閾值線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。最後由儀器自動分析裝置計算出未知標本的測定數值。
實施例3:腸道病毒螢光PCR檢測試劑盒重複性實驗
以5.0X1(^PFU /ml的陽性參考品作為待檢樣品，按照實施例2中的方法用3個生產批次的7個腸道病毒螢光PCR檢測試劑盒同時檢測5.0X1(^PFU /ml的陽性參考品，結果如附圖5所示不同擴增曲線的Ct值均在27至28之間，計算得出變異係數CV二5X，說明試劑盒的重複性好。
實施例4:應用腸道病毒螢光PCR檢測試劑盒定量檢測臨床樣品
臨床樣品來自廣東省疾病預防控制中心，包括糞便、咽拭子、血清、腦脊液等樣品類型；標本RNA提取、PCR反應與結果分析參照實施例2進行。
PCR反應結束後，根據擴增曲線先調節分析參數，使標準曲線(Std curve )窗口下的定量參考品標準曲線達到最佳(即相關性數值絕對值〉0.97)，然後分析臨床樣品。臨床樣品的檢測結果如附圖6所示6個臨床陽性標本擴增曲線的Ct值分別是19.01、 20.16、 23.14、23.63、 25.43、 28.80，結合擴增曲線有明顯指數增長期，均能夠判定為陽性；參照同一次試驗中定量參考品的標準曲線圖(如附圖2所示)可以判定6個臨床陽性標本的腸道病毒濃度分別為1.05X 106PFU/ml、 5.64X105PFU/ml、 1.15 X 105 PFU/ml、 8.80 X104PFU/ml、 3.36X 104PFU /ml、 5. 54X 103PFU /ml。序列表
中山大學達安基K股份有限公司
實時螢光定量PCR檢測人腸道病毒的試劑盒

〈141>
3
<210〉 1 〈211〉 27 DNA 〈213〉人工序列
<223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 <400〉 1
ggtagtgtgtcgtaatgggcaactcac
〈210〉 2 〈211〉 27 DNA
<223〉根據特定核仃酸序列設計，以W作PC對廣增的引物。 2
ttctataattgtcaccataagcagtca
〈210> 3
〈211〉 35
<212〉 DNA <213〉人T.序列
根據特定核苷酸序列設計，以用作PC財廣增的探針。 3
cggaaccgactactttgggtgtccgtgtttccttt
權利要求
1、一種檢測樣品中人腸道病毒存在的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液、PCR擴增反應液、陰性質控品、陽性質控品和定量參考品並加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中PCR擴增反應液包括耐熱DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針，其特徵在於PCR擴增反應液中用於靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別為正向引物EV-F5』-GGTAGTGTGTCGTAATGGGCAACTCAC-3』反向引物EV-R5』-TTCTATAATTGTCACCATAAGCAGTCA-3』其中正向引物EV-F可向5』和3』端方向各延伸10個鹼基，反向引物EV-R可向5』和3』端方向各延伸10個鹼基。
2、 根據權利要求l的試劑盒，其特徵還在於PCR擴增反應液中所使用的寡核苷酸探針EV P 的序列為5'- CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTT-3'，該寡核苷酸探針序列可向5' 和3'端方向各延伸5個鹼基。
3、 根據權利要求l的試劑盒，其特徵還在於PCR擴增反應液中正向引物濃度為 0.40nmol/L、反向引物濃度為0.40umol/L、寡核苷酸探針濃度為O. 20 ii mol/L。
4、 根據權利要求l的試劑盒，其特徵還在於PCR擴增反應液中耐熱DNA聚合酶的濃度為5U/ 反應。
5、 根據權利要求l的試劑盒，其特徵還在於PCR擴增反應液中逆轉錄酶的濃度為100LJ/反應。
6、 根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於PCR擴增反應液中RNA酶抑制劑的濃度為20U/ 反應。
7、 根據權利要求l的試劑盒，其特徵還在於PCR擴增反應液中脫氧核糖核苷二磷酸(dNTPs) 的濃度為0.21mmol/L。
8、 根據權利要求l的試劑盒，其特徵還在於用於PCR擴增的反應溫度和時間為40'C逆 轉錄25min;然後94。C預變性3min;最後93。C 15s， 55°C 45s， 40個循環。
9、 根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於所檢測的樣品可選自但不局限T糞便、向.清、 咽拭子、腦脊液、皰疹液等樣品。
10、 根據權利要求1的試劑盒，其特徵還在於所檢測的人腸道病毒包括但不局限於脊髓 灰質炎病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒和新型腸道病毒68型、69型、70型和71型。
全文摘要
本發明涉及實時螢光PCR檢測試劑盒，特別是涉及以實時螢光定量聚合酶鏈反應技術早期、快速診斷人腸道病毒感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發明的試劑盒實現對糞便、血清、咽拭子、腦脊液、皰疹液等樣品中的人腸道病毒的快速早期檢測和定量分析。
文檔編號C12Q1/70GK101638693SQ20081002984
公開日2010年2月3日 申請日期2008年7月30日 優先權日2008年7月30日
發明者何蘊韶, 明 李, 傑 李, 王秋泉, 鋼 程, 胡守旺, 鄧中平, 高秀潔 申請人:中山大學達安基因股份有限公司