水產品中孔雀石綠間接競爭elisa檢測試劑盒的製作方法

2023-05-25 16:00:36

專利名稱：水產品中孔雀石綠間接競爭elisa檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及水產類肉食品一種藥物的快速診斷方法和器具，具體是孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒背景技術無色孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)是孔雀石綠(malachite green，MG)在生物體內主要代謝殘留物，對人類有致癌危險。
孔雀石綠又稱為苯胺綠、維多利亞綠或中國綠，是一種具有金屬光澤的綠色晶體，溶於水、乙醇和甲醇，水溶液的顏色為藍綠色(最大吸收波長為618nm)，最早在1913年有人發現孔雀石綠等染料可破壞病原菌而不引起宿主損害，從而使這些染料用做防腐劑、殺錐蟲藥和其它醫療作用。自磺胺類藥物和其它抗菌素的出現，孔雀石綠作為抗菌素在畜牧業中的應用已日漸衰退。然而在水產養殖中由於價格低廉和抗菌、抗真菌效果好，廣泛用於進行水體消毒和防止魚水黴病。
近年來發現孔雀石綠特別是其代謝物在水產體內有明顯的蓄積殘留現象，殘留時間也較長。由於其化學官能團三苯甲烷是一種致癌物質，所以國外一些發達國家，如歐盟、美國已宣布禁止其在經濟魚類(觀賞魚除外)養殖過程中使用。我國農業部發布的《無公害食品中華絨鰲蟹》(NY5064-2001)和農業部發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》文件(農牧發 1號)中明確規定所有可食組織中禁用孔雀石綠。
《2000年度中國出口動物源性食品中有毒有害物質殘留監控計劃》首次將鰻魚中孔雀石綠項目的監控列入年度計劃，並延續至今。試驗證實孔雀石綠在動物體內8小時後50％轉變為無色孔雀石綠，24小時後84％轉變成無色孔雀石綠，而長期滯留在組織中。國內外檢測MG主要採用以色譜技術(HPLC)檢測技術，雖然靈敏、定量準確，但大批量檢測時速度慢，成本相對較高。以競爭性酶聯免疫法(ELISA)為代表的快速篩選法是免疫學主流技術，快速、成本低、可以大批量檢測，國內外尚無該技術報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種運用抗無色孔雀石綠單抗建立的孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒。
本發明的目的是這樣實現的採用無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物作為抗原包被可拆96孔酶標板，然後同時加入經前處理過的待測樣品和抗無色孔雀石綠單克隆抗體，讓兩者競爭抗體以檢測樣品中的LMG。具體如下本發明的檢測試劑盒內設有微孔檢測板，單抗凍乾物，酶標二抗，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色物A，顯色液B、終止液和標準溶液，微孔檢測板為包被無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物(LMG-RSA或LMG-OVA)的可拆96孔酶標板，標準溶液為無色孔雀石綠(LMG)標準溶液。
微孔檢測板的最佳製備方案為用pH9.6的0.2M碳酸鹽緩衝液作包被液，將無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物(LMG-RSA或LMG-OVA)稀釋至2μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜，甩幹，按200μl/孔加入含1％明膠，PH7.4的磷酸鹽緩衝液37℃封閉2小時，洗滌甩幹，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時，置乾燥室乾燥後，裝入含乾燥劑的包裝袋中保存。
上述單抗凍乾物為利用無色孔雀石綠與白蛋白的偶聯物免疫小鼠及單抗製備技術製備的抗無色孔雀石綠單克隆抗體，可與無色孔雀石綠特異結合。
上述樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，顯色物A為鄰苯二胺(OPD)，顯色液B為含0.5‰過氧化氫的檸檬酸—磷酸鹽緩衝液，無色孔雀石綠單抗為10μl提純的單抗加50μl牛血清/管凍乾物，終止液為2M硫酸溶液，LMG標準溶液的配製為精確稱取LMG 10mg，先用0.1ml 0.1mol/L鹽酸溶解，然後用ddH2O稀釋到10ml，用ddH2O配製系列濃度為0，1.6，8，40，200，1000ng/ml的標準LMG溶液。
本發明無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒的檢測程序為(1)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)將待檢樣品勻質並用乙酸乙酯和環己烷進行提取，調節PH值為7左右後用稀釋液作1∶4稀釋；(3)於部分微孔中分別加入50μl標準溶液，在另外微孔中加入50μl已完成前處理的檢測樣品溶液，在一孔中加入100μl洗滌液作不加單抗的對照孔；(4)除對照孔外，再於每一微孔中加入50μl適當稀釋的抗無色孔雀石綠單抗，37℃孵育120分鐘，甩幹，每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(5)每孔加100μl的1∶1000稀釋的羊抗鼠Ig-HRP，37℃孵育90分鐘，甩幹，每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(6)將顯色液B全移入顯色物A中，溶解混勻後，在每微孔中加100μl顯色液，37℃避光孵育10-15分鐘；(7)加50μl終止液，用酶標儀在490nm波長下讀取每孔光吸收值。
上述述步驟(2)的具體做法為(a)取剪碎樣品置入離心管中，按每克樣品加入2mL計加入乙酸乙酯，充分打碎勻質；(b)4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹乾樣品；(c)以等量環己烷和蒸餾水混合提取渦旋1分鐘，取環己烷層，按每克樣品加入12.5μl計加入1M HCl，渦旋1分鐘，靜置30min；(d)加入2倍於HCl液量的蒸餾水，8000rpm/min離心10min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N NaOH調整到pH 6.0～8.0，與稀釋液進行4倍稀釋後，取50uL進行分析。
本發明孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，其檢測樣本的判定標準為先計算標準樣品抑制率(B/BO)，然後以抑制率為縱坐標，以標樣無色孔雀石綠濃度的對數值為橫坐標，做標準曲線；根據每個樣品的B/BO值就可從曲線上讀出相對應的無色孔雀石綠的濃度。
本發明有益的積極效果是操作簡單，能較好滿足目前對水產品孔雀石綠殘留檢測的迫切的需要，用於海關檢測、食品衛生部門檢測等，易於大範圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
本發明具有下列優點(1)特異性強，敏感性高，安全性好。抗無色孔雀石綠單抗間接競爭ELISA檢測試劑盒以人工合成純抗原製備的單克隆抗體為基礎製備的而成；不含針對載體蛋白的抗體，只與相應無色孔雀石綠特異結合或與含同一母環結構的孔雀石綠部分結合，不與水產動物其它抗生素藥物和消毒藥發生交叉反應。因此具有很高的特異性和敏感性。
(2)操作簡便快速。使用孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒檢測無色孔雀石綠時，無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在5-6小時內即可判定檢測結果。
(3)結果判定形象、準確、可靠。孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒以顯色的深淺定性顯示檢測結果，即檢測孔出現桔黃色顯色為陰性，中止後呈黃色或棕色，無色和較淺色為陽性，結果判定形象。採用酶標儀機讀數定量顯示檢測結果，減少主觀性，準確可靠。
(4)成本低，批量檢測。孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒可批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。


圖1為LMG標準抑制曲線，圖中的縱坐表為抑制率＝OD(加入LMG)/OD(未加入LMG)橫坐表為LMG溶液濃度的對數。
圖2為檢驗試劑盒的不同濃度標準溶液的吸光值變異係數(CV％)圖，圖中的縱坐表為變異係數(CV％)，橫坐表為LMG溶液濃度的對數。
具體實施例方式
根據本發明的技術方案，具體製備如下(1)無色孔雀石綠微孔檢測板的製備用pH9.6的0.2M碳酸鹽緩衝液作包被液，將無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物(LMG-RSA或LMG-OVA)稀釋至2μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜，甩幹，按200μl/孔加入含1％明膠的0.01M PH7.4的磷酸鹽緩衝液37℃封閉2小時，洗滌甩幹，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時，置乾燥室乾燥後，裝入含乾燥劑的包裝袋中保存。
(2)樣品稀釋液、洗滌液、單抗稀釋，終止液的配製樣品或血清稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩衝液(KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐溫-20)；10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩衝液(KH2PO42g，Na2HPO4·12H2O29g，NaCl 80g，定容至1000ml，pH7.4，再加5ml吐溫-20)；單抗稀釋在單抗管中加入500μl稀釋液，取部分抗體稀釋液再稀釋200-500倍；終止液為2M硫酸溶液，即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml。
(3)無色孔雀石綠標準溶液的製備LMG標準溶液的配製精確稱取LMG 10mg，先用0.1ml 0.1mol/L鹽酸溶解，然後用ddH20稀釋到10ml。用ddH2O配製系列濃度為0，0.32，1.6，8，40，200，1000ng/ml的標準LMG溶液。
(4)顯色液的配製稱取2mg鄰苯二胺(OPD)作為顯色A裝入6ml小瓶中；取PH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液5.9ml加入3％過氧化氫100μl配製成顯色液B；PH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液配製Na2HPO4·12H2O 1.84g，檸檬酸0.467g加蒸餾水到50ml。
(5)樣品前處理魚肉樣品的前處理1)取4g已剪碎樣品置入離心管中，再加入8mL乙酸乙酯，在勻質機下充分打碎；2)然後離心4000rpm/min 10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹乾樣品；3)以1ml環己烷和1ml蒸餾水混合提取渦旋1分鐘，取環己烷層；加入50μl 1M HCl，渦旋1分鐘，靜置30min；4)加入0.1ml蒸餾水，離心8000rpm/min 10min，棄去上層環己烷，吸取下層清液(若有乳化現象，請先將大部分上層液-正己烷取出後，再將玻璃管置入80℃水中，隔水加熱約5～10分鐘，可改善乳化情形)。用1N NaOH調整到pH 6.0～8.0，與稀釋液進行4倍稀釋後，取50uL進行分析。
(6)試劑盒檢測操作程序其檢測程序為(1)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)將待檢魚肉樣品勻質並用乙酸乙酯和環己烷進行提取，調節PH值為7左右後用稀釋液作1∶4稀釋，(3)於適當微孔中分別加入50μl標準溶液，在另外的微孔中加入50μl已完成前處理的樣品溶液，在一孔中加入100μl洗滌液作不加單抗的對照孔用於測定OD值時的對照孔。(4)除對照孔外，再於每一微孔中加入50μl適當稀釋的抗無色孔雀石綠單抗，37℃孵育120分鐘，甩幹，每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(5)每孔加100μl的1∶1000稀釋的羊抗鼠Ig-HRP，37℃孵育90分鐘，甩幹；每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(6)將顯色液B全移入顯色物A瓶中，溶解混勻後，在每微孔中加100μl顯色液，37℃避光孵育10-15分鐘；(5)加50μl終止液，用酶標儀在490nm波長下讀取每孔光吸收值(OD490nm值)。
(7)結果判定標準根據每個樣品的B/BO值就可從曲線上讀出相對應的無色孔雀石綠濃度，再乘以相應稀釋倍數。
為驗證本發明效果的可靠性，進行以下鑑定(1)LMG標準抑制曲線與靈敏度取已經封閉好的酶標板，將配好的系列LMG標準溶液(0、1.6、8、40、200、1000ppb)50uL/孔與稀釋2萬倍的單抗工作液50uL/孔於酶標板孔中混合，在一孔中加入100μl洗滌液作不加單抗的對照孔，37℃於37℃溫育2h，洗板；加1∶1000HRP酶標羊抗鼠(二抗)，100uL/孔，於37℃溫育1.5h，洗板；每孔加新鮮配製的OPD低物顯色液100uL，37℃暗室反應15min；加入2mol/L H2SO450ul終止顯色反應，用酶標儀于波長490nm下判讀。以抑制率I為縱坐標，LMG溶液濃度的對數為橫坐標，繪製出標準曲線。抑制率I＝B/BO(B為樣品OD值，BO為空白對照OD值)。競爭ELISA結果及相關參數見表1，標準抑制曲線見圖1表1間接競爭ELISA結果的相關參數

回歸曲線方程為Y＝-0.0814X2-0.5058X+0.0731，R2＝0.9979
從圖1可看到0.0016-1μg/ml範圍內(B/Bo)與LMG濃度的對數值呈一元二次曲線關係，相關係數為r＝0.9979，用BO-3SD外推法經計算靈敏度為0.0023μg/ml。
(2)結果再現性針對LMG檢驗試劑盒的精密度測試，批間重複6次，所得不同濃度標準溶液的吸光值變異係數(CV％)如圖2所示，顯示本產品有很高的再現性(3)回收率計算取在4g空白魚肉中加入無色孔雀石綠標樣，提取液作適當稀釋後，進行ELISA測定。根據OD值及B/BO值從標準曲線查得無色孔雀石綠含量後再乘以相應稀釋倍數即為樣品中無色孔雀石綠的含量，然後計算回收率見表2。
表2測定樣品的回收率

從上表可看出回收率92-112％(4)結果特異性針對以下藥物運用競爭ELISA進行特異性交叉反應測試，結果如下表3無色孔雀石綠與幾種結構或作用類似藥物的交叉反應

權利要求
1.無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，試劑盒內設有微孔檢測板，單抗凍乾物，酶標二抗，樣品稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色物A，顯色液B、終止液和標準溶液，其特徵在於微孔檢測板為包被無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物(LMG-RSA或LMG-OVA)的可拆96孔酶標板，標準溶液為無色孔雀石綠(LMG)標準溶液。
2.根據權利要求1所述的一種無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，其特徵在於微孔檢測板的最佳製備方案為用pH9.6的0.2M碳酸鹽緩衝液作包被液，將無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物(LMG-RSA或LMG-OVA)稀釋至2μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜，甩幹，按200μl/孔加入含1％明膠，PH7.4的磷酸鹽緩衝液37℃封閉2小時，洗滌甩幹，再加入20％蔗糖磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時，置乾燥室乾燥後，裝入含乾燥劑的包裝袋中保存。
3.根據權利要求1所述的一種無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，其特徵在於所說單抗凍乾物為利用無色孔雀石綠與白蛋白的偶聯物免疫小鼠及單抗製備技術製備的抗無色孔雀石綠單克隆抗體，可與無色孔雀石綠特異結合。
4.根據權利要求1所述的一種無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，其特徵在於所述樣品稀釋液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，10×濃縮洗滌液為含0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)，顯色物A為鄰苯二胺(OPD)，顯色液B為含0.5‰過氧化氫的檸檬酸—磷酸鹽緩衝液，無色孔雀石綠單抗為10μl提純的單抗加50μl牛血清/管凍乾物，終止液為2M硫酸溶液，LMG標準溶液的配製為精確稱取LMG 10mg，先用0.1ml 0.1mol/L鹽酸溶解，然後用ddH2O稀釋到10ml，用ddH2O配製系列濃度為0，1.6，8，40，200，1000ng/ml的標準LMG溶液。
5.根據權利要求1所述的一種無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，其檢測程序為(1)將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2)將待檢樣品勻質並用乙酸乙酯和環己烷進行提取，調節PH值為7左右後用稀釋液作1∶4稀釋；(3)於部分微孔中分別加入50μl標準溶液，在另外微孔中加入50μl已完成前處理的檢測樣品溶液，在一孔中加入100μl洗滌液作不加單抗的對照孔；(4)除對照孔外，再於每一微孔中加入50μl適當稀釋的抗無色孔雀石綠單抗，37℃孵育120分鐘，甩幹，每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(5)每孔加100μl的1∶1000稀釋的羊抗鼠Ig-HRP，37℃孵育90分鐘，甩幹，每孔加洗滌液200μl，洗滌6次，每次間隔1分鐘，拍幹；(6)將顯色液B全移入顯色物A中，溶解混勻後，在每微孔中加100μl顯色液，37℃避光孵育10-15分鐘；(7)加50μl終止液，用酶標儀在490nm波長下讀取每孔光吸收值。
6.根據權利要求5所述的一種無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒，所述步驟(2)的具體做法為(a)取剪碎樣品置入離心管中，按每克樣品加入2mL計加入乙酸乙酯，充分打碎勻質；(b)4000rpm/min離心10min，取上清在50℃水浴下氮氣流吹乾樣品；(c)以等量環己烷和蒸餾水混合提取渦旋1分鐘，取環己烷層，按每克樣品加入12.5μl計加入1MHCl，渦旋1分鐘，靜置30min；(d)加入2倍於HCl液量的蒸餾水，8000rpm/min離心10min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1N NaOH調整到pH6.0～8.0，與稀釋液進行4倍稀釋後，取50uL進行分析。
全文摘要
本發明為一種水產品中無色孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒。試劑盒的檢測板為包被無色孔雀石綠與白蛋白偶聯物的可拆96孔酶標板，抗無色孔雀石綠抗體為利用無色孔雀石綠與白蛋白的偶聯物免疫小鼠而製備的單克隆抗體，檢測樣品先經過勻質後用乙酸乙酯和環己烷進行提取，調節pH值後稀釋用於檢測。樣本檢測的判定標準為以標樣濃度的對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標的回歸曲線。根據每個樣品的抑制率就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。該方法檢測的靈敏度為0.0023μg/ml，檢測範圍是0.0016－1μg/ml。本發明試劑盒的操作簡單，能較好滿足目前對水產品孔雀石綠殘留檢測的迫切的需要，用於海關檢測、食品衛生部門檢測等，易於大範圍推廣應用。
文檔編號G01N33/543GK1766623SQ20051006099
公開日2006年5月3日 申請日期2005年10月8日 優先權日2005年10月8日
發明者郭德華, 李健, 王權, 龔朋飛, 薛飛群, 顧惠明, 陳永軍, 陳燕軍 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局, 中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所