基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測集合、試劑盒及檢測方法與流程
2023-05-25 11:50:01
本發明屬於基因工程領域，尤其涉及一種基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測集合、試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：耳聾是語言學習及交流的最大的障礙，其中50％～70％可能與遺傳因素有關。在世界範圍內，每1000名新生兒中就有1名先天性耳聾患兒。在發達國家，先天性耳聾患者中至少50％是由遺傳因素造成的。據我國衛生部2012年出生缺陷防治報告顯示，先天性聽力障礙在目前出生缺陷中位居首位約1‰-3‰，每年新發出生缺陷達90萬例，先天性聽力障礙約3.5萬例，聽力語言殘疾者達2780萬以上，並以每年新生2-3萬聾兒快速增長。絕大部分遺傳性耳聾為非症候群性耳聾，不伴隨其他系統疾病。遺傳性耳聾主要有隱性、顯性、伴性染色體遺傳和線粒體母系遺傳四種遺傳方式。目前已發現近300個耳聾疾病相關基因。在我國，常見的耳聾相關基因及突變熱點包括GJB2、(35delG、176del16bP、235delC及299-300delAT)，GJB3(538C>T及547G>A)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和線粒體DNA12SrRNA(A1555G)。傳統耳聾基因研究主要採用定位克隆技術，集中在候選基因克隆和位置候選基因克隆，但流程複雜效率不高。Sanger測序是臨床分子診斷的金標準，但是檢測效率低、成本高，傳統的酶切、雜交、TaqMan探針、DHPLC和HRM等方法針對突變熱點進行檢測，但檢測通量較低。近幾年微陣列晶片技術的發展可以同時針對數百個突變位點進行高通量檢測，極大提高了診斷效率，降低了檢測成本。但微陣列晶片技術存在檢測周期長、檢測成本相對較高，對除點突變之外的其他突變類型的檢出能力有限的缺點。以上策略均不適於大量的耳聾散發病例和小家系的研究，特別是對一些罕見的症候群型耳聾。技術實現要素：發明目的：針對現有技術中存在的問題，本發明的其中一個目的是提供基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測集合，較為全面的展現了與聾病相關的基因及位點。本發明的第二個目的是提供高通量、檢測成本低、檢測區域大、適用範圍廣的基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測方法，本發明的第三個目的是提供基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測試劑盒。技術方案：一種基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測集合，包括：人聾病的基因及位點，其中，所述聾病的基因包括ACSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE和ZCCHC14；所述位點如下表所示：申請人經過在OMIM、Clinvar、TheHereditaryHearinglossHomepage、DVD等資料庫中收集與整理，並參考美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)聯合分子病理學學會(AMP)發布的基因變異的解讀標準及指導原則篩選出致病和可能致病的位點和基因。基因：只要該基因的突變能導致耳聾的發生(致病和可能致病)；線粒體：考慮到線粒體基因的突變能導致聾病，加之部分位點的突變能否導致聾病尚未有確切的答案，所以把所有線粒體序列都包含進去。非CDS：部分能導致或可能導致耳聾發生的位點不在以上所述位置，將這類位點單獨列出來。另外申請人還進行了大量的耳聾相關樣本收集、測序和數據篩選，結合資料庫篩選和實際樣本檢測篩選，申請人獲得了上述基因和位點，上述核基因共計258個，位點包括81個核的非CDS區域以及全線粒體組，能夠較為全面的展現與聾病相關的基因與位點，這些基因和位點也是目前耳聾相關疾病涵蓋面最廣的、適用人群最廣的panel。上述具體的基因和位點可以在文獻或者本領域通用資料庫中進行查詢。本發明還公開了一種用於疾病或非疾病診斷目的的基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測方法，包括：(1)針對所述的部分或全部的聾病的基因及位點設計引物；(2)以待測樣本的DNA為模板，利用所述的引物進行PCR擴增，並基於擴增產物構建耳聾檢測基因文庫；(3)根據所述的耳聾檢測基因文庫建立測序模板，進行高通量測序，分析測序數據信息。步驟(1)中，「部分」的含義為：所述的耳聾基因檢測集合(panel)中的所有基因或位點可以自由組合，如可以是任意的2個、3個、30個、150-339個、200-339個、250-339個、300-339個等等自由組合，至於選擇哪些基因和位點可以根據自己的需求(如耳聾的表型或用途)進行設置，例如篩選藥物致聾的時候可以選擇線粒體的12SrRNA，篩選大前庭水管綜合症可以選擇SLC26A4、FOXI1、KCNJ10等。同時選擇基因或位點時也可兼顧基於高通量測序的成本和速度等。當選擇全部的基因和位點時可以較為全面的進行檢測。基於測序方法設計引物時，一對引物的擴增的片段長度通常為150-275bp，因此對某一基因或位點設計引物時可能需要多對引物。對於引物設計的擴增區域選擇原則為：針對基因設計引物時，所有引物對擴增區域應覆蓋基因的所有外顯子序列、外顯子上遊5bp內的序列。針對位點設計引物時，所有引物對擴增區域應覆蓋上述位點序列。對於上述擴增區域，可採用一般通用的引物設計原則利用常用引物設計軟體如primer、Oligo、在線軟體等進行設計。步驟(2)中，PCR擴增時，10μL體系中，DNA模板的加入量為10～100ng，優選為20～50ng，更優選為30～40ng。所述PCR擴增的程序為：99℃酶活化2min；99℃變性15s，60℃退火與延伸16min，15個循環；10℃持續結束。通過提高DNA的量、延遲反應的時間增加擴增的均一性。耳聾檢測基因文庫的構建步驟包括：1)引物的消化：將PCR擴增後的反應液加入消化試劑進行消化反應；2)加接頭：消化後的產物連接接頭，加接頭結束後純化得到文庫。所述的消化試劑為FuPa試劑。所述的接頭為P1接頭和barcode接頭。連接接頭時，對反應條件進行優化，反應條件為：22℃，30min；68℃，5min；72℃，5min；10℃，不超過60min。純化後的文庫可根據實際需要選擇是否需要進行擴增。構建基因文庫可採用市售試劑盒，測序模板的製備可採用測序儀配套的試劑及使用說明進行。測序儀可以採用DA8600測序儀。測序技術後，對測序數據進行分析即可獲得耳聾相關基因變異信息。本發明所述待檢測樣本為血液、幹血斑或羊水。本發明還提供了所述的基於靶向新一代測序的耳聾基因檢測試劑盒，包括：引物：針對所述的部分或全部的耳聾病的基因及位點進行設計，用於對待檢測DNA進行PCR擴增；PCR擴增試劑，用於對待檢測DNA進行PCR擴增；文庫構建試劑，用於對PCR擴增產物進行文庫構建；測序試劑，用於對文庫進行高通量測序模板的製備和上機測序。其中關於引物，可以採用關於上述測序方法中關於步驟(1)論述的內容進行基因及位點的選擇以及引物設計原則設計引物。PCR擴增試劑、文庫構建試劑以及測序試劑可採用市售的相關試劑即可。與現有技術相比，本發明的有益效果為：本發明所提供的基因集合能夠較為全面的展現與聾病相關的基因與位點，是目前耳聾相關疾病涵蓋面最廣的、適用人群最廣的panel。本發明提供的檢測方法及檢測試劑盒具有如下優點：1.通量高：不僅能夠檢出現有已知突變，還能夠檢出新發突變類型等優點。2.檢測區域大：能在短時間內完成大量目的區域的測序和分析，對於耳聾相關的幾百個基因的全部外顯子和調控區有可能發生致病突變的位置進行相關測序和分析，含SNP、indel、CNV等。3.平均成本低、速度快：通過本方法均能一次性全面檢測耳聾相關基因的所有變異情況，而且平均每個基因全外顯子檢測成本低於10元。4.適用範圍廣：從適用人群來看，不僅僅滿足患者的檢測需求，還能滿足疑似患者和正常人的檢測需求；從樣本類型上看，可以有多種選擇，如足跟血、全血、羊水等；從功能上看，能為受檢者提供幹預指導，包括耳聾防治的婚前指導、耳聾相關用藥指導、早期幹預與防治等。附圖說明圖1為靶向高通量測序檢測流程圖；圖2為基因靶向捕獲數據分析流程。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，在閱讀了本發明之後，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落於本申請所附權利要求所限定的範圍。實現本發明方法主要包括檢測遺傳性耳聾的目的基因的確定和檢測方法的開發。(1)遺傳性耳聾目的基因的確定耳聾具有高度的遺傳異質性，通常分為非症候群型遺傳性耳聾和症候群型遺傳性耳聾。目前已發現近300個耳聾疾病相關基因，截止2015年11月，本研究通過在OMIM、Clinvar、TheHereditaryHearinglossHomepage、DVD等資料庫中收集，並自主進行大量樣本收集、測序和數據篩選，匯總所有與人的耳聾相關的基因，匯總結果包括258個基因和81個非CDS區域，以及全線粒體組。上述258個基因為：ACSL4、ACTB、ACTG1、ADCY1、ADD1、AGAP1、AIFM1、ALDH7A1、ALMS1、ALX3、AQP1、AQP2、AQP3、ATP2B2、ATP6V0A4、ATP6V1B1、ATP6V1B2、BAI1、BCS1L、BSND、CABP2、CACNA1D、CAMSAP3、CATSPER2、CCDC50、CDH23、CEACAM16、CEMIP、CHD7、CIB2、CISD2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL11A1、COL11A2、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL9A1、COL9A2、COL9A3、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIABLO、DIAPH1、DIAPH3、DLX5、DNMT1、DSPP、ECE1、ECM1、EDN3、EDNRA、EDNRB、ELMOD3、EPS8、ERCC2、ERCC3、ESPN、ESRRB、ESRRG、EYA1、EYA4、FAM107B、FAM65B、FAS、FBXO33、FCGR2A、FCGR3A、FGF3、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLNA、FOXI1、FOXO3、FREM1、FXN、GATA3、GIPC3、GJA1、GJB1、GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJC3、GLI3、GPR152、GPR98、GPSM2、GRHL2、GRXCR1、GRXCR2、GSTP1、HAL、HARS、HARS2、HCFC1、HGF、HLA-DRB1、HMX1、HOXA1、HOXA2、HSD17B4、HSPA1A、IGF1、IL13、IL1A、ILDR1、JAG1、KARS、KCNE1、KCNE3、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KLC2、KLHL18、KRT9、LAMA3、LARS2、LHFPL5、LHX3、LOXHD1、LRIG1、LRP2、LRTOMT、MARVELD2、MASP1、MCPH1、MIR96、MITF、MKRN2、MPZ、MSRB3、MTAP、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO1C、MYO1F、MYO3A、MYO6、MYO7A、NDP、NDRG1、NF2、NOS1、NOS2、NR2F1、OCM、OPA1、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、OTOR、P2RX2、PABPN1、PAN3、PARP1、PAX2、PAX3、PAX9、PCDH15、PCDH9、PDSS1、PDZD7、PEPD、PEX3、PEX6、PHEX、PHF20、PMP22、PNPT1、POLR1C、POLR1D、POU3F4、POU4F3、PROK2、PROKR2、PRPS1、PRRX1、PTPN22、PTPRQ、RDX、RPGR、SALL1、SALL4、SCARF2、SEC23A、SEMA3E、SERAC1、SERPINB6、SETD5、SIX1、SIX2、SIX5、SLC12A1、SLC17A8、SLC19A2、SLC25A21、SLC26A4、SLC26A5、SLC4A11、SLITRK6、SMAD4、SMPX、SNAI2、SOBP、SOX10、SOX2、SOX9、SPINK5、SPNS2、SRSF7、STRC、SYNE4、TBC1D24、TBL1X、TCF21、TCOF1、TECTA、TFCP2、TIMM8A、TJP2、TMC1、TMEM126A、TMIE、TMPRSS3、TMPRSS5、TNC、TNFRSF11B、TPRN、TRAM2、TRIOBP、TRMU、TSHZ1、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、WBP2、WFS1、YWHAE、ZCCHC14。上述81個非CDS區域和全線粒體組位置如表1。表181個非CDS區域和線粒體位置該方法能夠檢測出258個基因和81個非CDS區域以及全線粒體組的突變情況及具體突變類型(含SNP、indel、CNV等)，並針對這些基因的外顯子、外顯子上遊5bp以及非CDS區域和全線粒體組進行多重PCR的引物設計，總共6140對引物，這六千多對引物的擴增產物覆蓋上述258個基因的所有外顯子序列、外顯子上遊5bp內序列(即外顯子上遊第1～5bp範圍)，以及覆蓋上述81個非CDS區域和線粒體序列，每對引物的擴增的片段長度通常為150-275bp，對於上述確定的擴增區域，可採用一般通用的引物設計原則利用常用引物設計軟體如primer、Oligo、在線軟體等進行設計。序列表中列舉了部分引物，其他引物不再一一列舉，本領域技術人員根據上述引物設計的指導可以自主設計，並不影響本發明的實施。申請人將將這些引物分在不同的管內，標記為DGPPrimerPool1和DGPPrimerPool2。也可以組合識別，即選擇在上述基因、非CDS區域和線粒體中任意組合，將所選擇的基因對應的引物混合即可檢測以下含有的目的區域。(2)檢測方法的開發基本流程如圖2所示，首先需要將接受的樣本中進行全基因組DNA的提取，並將檢測合格的DNA進行多重PCR，然後再進行文庫的構建，文庫的構建包括引物的消化、加接頭、文庫擴增(此步驟也可以省略)，再通過qPCR或者qubit質檢，質檢通過則進行乳液PCR，再進行ES富集，之後再進行上機測序，測序下機的數據通過質檢，則進行生物信息分析，生物信息的過程見圖2。得到的突變位點進一步進行sanger驗證，驗證之後即可進行報告的發放和對受檢者進行遺傳諮詢。為了更加清楚明白的表達本方法的目的、技術方案，以下結合具體實施例和附圖對本方法做進一步說明。實施例1外周血耳聾相關基因檢測1.樣本先天性聽力損失患者的外周血樣本，對其進行基因檢測，檢測致病突變。2.基因組核酸抽提離心柱法抽提血液樣本的基因組DNA，採用核酸純化試劑純化基因組DNA。採用Qubit2.0螢光計檢測所提取核酸質量。3.多重PCR多重PCR及「4.耳聾檢測基因文庫構建」採用市售的多重PCR文庫構建試劑盒，本實施例採用的試劑盒品牌為life，名稱為IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0-96LV，貨號為4480441。但試劑盒並不僅限於此。按表2配製PCR反應體系，按表3程序進行PCR擴增。表2基因組DNA目標區域PCR擴增體系表3基因組DNA目標區域PCR擴增程序4.耳聾檢測基因文庫構建4.1部分消化引物序列上述擴增後的PCR反應液中加入1μLFuPa試劑，按表4程序進行消化反應。表4部分消化引物序列反應程序溫度時間50℃10min55℃10min60℃20min10℃持續(最長1h)4.2連接接頭按表5配置連接反應，按表6在PCR儀上運行連接反應。表5接頭連接反應體系表6接頭連接反應過程溫度時間22℃30min68℃5min72℃5min10℃持續(不超過1h)4.3純化核酸純化試劑(磁珠法)純化上述文庫。需要說明的是：上述核酸純化試劑應於室溫平衡30min並充分振蕩將磁珠混勻，使用時緩慢吸取。70％乙醇需要新鮮配置。4.4擴增文庫(選擇性的做)(1)上述含有文庫的磁珠中加入25μL文庫擴增混合液和1μL的文庫擴增引物混合液。置於磁力架，靜置2min，轉移至PCR管中。按表7進行擴增反應。表7擴增文庫反應過程(2)文庫的純化使用核酸純化試劑純化上述擴增後文庫。最後加入25μLlowTE緩衝液充分洗滌磁珠，混勻。室溫靜置5min。置於磁力架上，靜置2分鐘或待溶液變清澈。移上清至新離心管。4.5文庫的定量qubit2.0螢光計檢測上述文庫質量。文庫濃度低於0.2ng/μL為不合格，需要重建庫。若用qPCR對上述文庫進行檢測，文庫濃度不低於100pM。5.高通量測序模板製備(乳液PCR和ES富集)高通量測序模板製備操作流程參考DA8600測序儀配套的試劑及使用說明。6.高通量測序高通量測序使用DA8600測序儀，按照測序儀標準操作規程進行。7.信息分析7.1原始數據的分析從測序儀獲取原始數據(FASTQ數據)，對原始數據進行質量控制，把trimscore小於13的數據去除。再參考hg19，運用但不僅限於SOAP軟體對過濾後的數據進行序列比對，再運用但不僅限於GATK軟體包進行序列的校正。再運用variantCaller進行SNP、indel、CNV等突變分析，生成一個vcf文件。7.2結果過濾將上一步驟中篩選出來的突變信息(vcf文件)進行篩選。篩選內容包括reads小於5的片段去除。再主要參考ExAC、Clinvar、1000Genomes、DVD等資料庫，將數據分成三類：I對資料庫裡已有報導致病的突變直接按照ACMG(美國醫學遺傳學與基因組學學會)的分類標準進行分類，II未標註的突變需要進一步除去高頻(等位基因頻率大於1％)的突變，III把未知突變中的稀有突變(MAF(最小等位基因頻率)小於1％)的進行下一步分析。7.3基因篩選將上一步驟中的III類數據進一步進行假陽性估計和過濾，再運用Annovar軟體包進行突變位點的注釋，再和I類數據一起按照ACMG的分類標準進行分類，並結合臨床信息和家系信息挑選位點。7.sanger驗證根據上一步驟中篩選出的位點，運用PrimerPremier5或者Primer-BLAST等軟體進行對應位點的引物設計並對樣本進行PCR。Sanger測序參考3730xl等測序儀及試劑進行。8.結果分析測序數據統計結果見表8，檢出的候選突變信息如表9。表8：測序數據統計表目標區長度(bp)730.05kb目標區覆蓋度99.6％數據產量8Mreads捕獲特異性100％目標區平均深度1139均一性88％總變異位點數1337變異分數0.1％目的區SNP數1258INDEL數62內含子突變數763外顯子突變數507致病位點數2Splicing位點數5表9：檢出的候選突變信息表當前第1頁1 2 3