氧化雙醛纖維素固定化脲酶的製備方法

2023-05-25 20:16:41 1

專利名稱：氧化雙醛纖維素固定化脲酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種酶學技術，具體是以氧化雙醛纖維素為載體固定化脲酶的製備方法。
背景技術：
脲酶在汙水處理、釀酒以及醫療領域都具有很高的潛在價值。但是由於脲酶價格昂貴，溶液中的脲酶容易變性失活，反應後的脲酶難以回收，無法重複利用，極大地限制了脲酶的應用。為了提高脲酶在溶液中的穩定性，重複使用性和貯存穩定性，採用適當的方法將脲酶與載體鍵聯連接固定從而克服游離態脲酶的缺點，是一種可行的技術途徑。 目前脲酶的固定化載體材料選擇比較廣泛，主要分為無機材料和有機材料，其中有機材料包括聚合物(如改性聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇)、藻朊酸鹽和殼聚糖及其衍生物。纖維素、殼聚糖、澱粉等天然多糖類載體在自然界中大量存在，容易獲得，價格便宜，載體性能比較穩定，被廣泛應用於生活中的各個領域。但是由於此類載體缺少能與酶結合的功能基團，只能以吸附方法將酶固定在載體上，得到的固定化脲酶重複使用性能比較弱。本發明以纖維素為原料，經化學改性，製備的氧化雙醛纖維素具有良好的生物相容性、生物可降解性、環境友好和無毒等特點，並具有纖維素不具有的活性功能基團，反應活性更強，是一種優良的載體材料。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種氧化雙醛纖維素固定化脲酶的製備方法。解決上述技術問題所採用的技術方案是本氧化雙醛纖維素固定化脲酶的製備方法是按如下步驟進行一、氧化雙醛纖維素的製備(I)纖維素的活化將微晶纖維素或棉纖維置於質量比為12% -20%的NaOH水溶液中潤漲24h，用蒸餾水洗至中性，抽濾後將得到的固體置於30-40°C烘箱中乾燥3h，研磨成粉末備用；(2)纖維素的氧化將活化後的微晶纖維素或棉纖維與I : 1-1 4的重量比的高碘酸或高碘酸鈉置於水熱合成反應釜中，加入蒸餾水，填充係數為O. 6-0. 9，將此密閉的水熱合成反應釜置於110-130°C烘箱中反應4-10h ;反應結束後，濾紙過濾得到固體，並用蒸餾水反覆衝洗該固體4-5次，抽濾後將固體置於30-40°C烘箱乾燥3h後研磨成粉備用；將乾燥得到的產物再進行一次相同方法的選擇性氧化反應，即得氧化雙醛纖維素，再將氧化雙醛纖維素置於30-40°C烘箱中乾燥3h後放入4°C冰箱中保存；二、固定化脲酶的製備(I)分散相的製備取步驟一(2)得到的氧化雙醛纖維素載體，加入PH4-10的磷酸鹽緩衝液製備分散相；控制氧化雙醛纖維素在此分散相中的質量比為3% -5% ;
(2)脲酶的固定向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液濃度為O. l-20mg/mL,控制反應溫度2-8 °C，磁力攪拌2-4h ；(3)洗滌乾燥用紗布過濾得到固體，將此固體用去離子水洗滌4-5次，除去未固定的游離脲酶，真空冷凍乾燥得到固定化的脲酶。本發明的有益效果是本發明採用水熱合成反應、利用密閉的壓力容器，以水為溶齊U，氧化反應更充分，比傳統的方法獲得的氧化纖維素，其醛基含量較高，能為脲酶與載體的連接提供更多的活性結合位點。本方法的載體性能穩定、酶固定化的條件溫和，方法簡便。
具體實施例方式本發明結合實施例作進一步詳述脲酶是一種專一分解尿素的酶類，又名醯胺水解酶。在水存在的條件下，將尿素分 解為氨和二氧化碳，是一般尿素分解反應(無脲酶催化)速度的IO14倍。因此脲酶在汙水處理、釀酒以及醫療領域都具有很高的潛在價值。但是由於脲酶價格昂貴，溶液中的脲酶容易變性失活，反應後的脲酶難以回收，無法重複利用，極大的限制了脲酶的應用。為了提高脲酶在溶液中的穩定性，重複使用性和貯存穩定性，可採用適當的方法將脲酶與合適的載體鍵聯連接固定從而很好的克服游離脲酶的缺點。脲酶的固定化載體材料選擇比較廣泛，纖維素、殼聚糖、澱粉等天然多糖類載體；聚乙烯，聚丙烯腈等聚合物載體；以及蠶絲素蛋白、磁性微球等其他新型載體均可作為脲酶的固載材料。優良的固定化載體材料應有化學性質穩定、親水性、具有一定剛性、機械穩定性、較大的表面積及抗微生物浸染等特點。纖維素是多羥基天然高聚物，部分羥基在纖維素分子內和分子間形成牢固的氫鍵，使其在自然界中幾乎找不到單組分溶劑，故纖維素材料具有穩定性好的特點；同時纖維素分子結構上還剩餘的羥基容易與任何活性物質上的極性官能基團形成氫鍵，使纖維素具有親水性和對極性物質有強的吸附能力。又因其原料豐富，價格便宜，無毒性，易被生物降解，對環境無汙染等優點使其具有潛在的廣泛用途。近年來用纖維素作為基質材料製備各種固定化酶多有報導。然而纖維素作為一種天然高分子化合物，在性能上存在某些缺點，如不耐化學腐蝕，強度有限，溶解性差，缺乏活性強的官能團等等。氧化纖維素具有良好的生物相容性、生物可降解性、環境友好和無毒等特點，並具有纖維素不具有的活性功能團，是一種優良的載體材料。傳統方法製備氧化纖維素，由於反應是在異相中進行，反應條件較溫和，所製得的氧化纖維素醛基含量較低。本研究中採用的水熱合成反應利用密閉壓力容器，以水為溶劑，在高溫高壓的條件下氧化反應能更好地進行，與傳統方法得到的氧化纖維素相比，醛基含量有明顯提高。本氧化纖維素固定化脲酶的製備方法是按如下步驟進行一、氧化雙醛纖維素的製備(I)纖維素的活化將微晶纖維素或棉纖維置於質量比為12% -20%的NaOH水溶液中潤漲24h，用蒸餾水洗至中性，抽濾後將得到的固體置於30-40°C烘箱中乾燥3h，研磨成粉末備用；(2)纖維素的氧化將活化後的微晶纖維素或棉纖維與I : 1-1 4的重量比的高碘酸或高碘酸鈉置於水熱合成反應釜中，加入蒸餾水，填充係數為O. 6-0. 9，將此密閉的水熱合成反應釜置於110-130°C烘箱中保存4-10h ;反應結束後，濾紙過濾得到固體，並用蒸餾水反覆衝洗該固體4-5次，抽濾後將固體置於30-40°C烘箱乾燥3h後研磨成粉備用；將乾燥得到的產物再進行一次相同方法的選擇性氧化反應，即得氧化雙醛纖維素，再將氧化雙醛纖維素置於30-40°C烘箱中乾燥3h後放入4°C冰箱中保存；
權利要求
1.一種氧化雙醛纖維素固定化脲酶的製備方法，其特徵是按如下步驟進行的 一、氧化雙醛纖維素的製備 (1)纖維素的活化將微晶纖維素或棉纖維置於質量比為12%-20%的NaOH水溶液中潤漲24h，用蒸餾水洗至中性，抽濾後將得到的固體置於30-40°C烘箱中乾燥3h，研磨成粉末備用； (2)纖維素的氧化將活化後的微晶纖維素或棉纖維與I: 1-1 4的重量比的高碘酸或高碘酸鈉置於水熱合成反應釜中，加入蒸餾水，填充係數為O. 6-0. 9，將此密閉的水熱合成反應釜置於110-130°C烘箱中反應4-10h ;反應結束後，濾紙過濾得到固體，並用蒸餾水反覆衝洗該固體4-5次，抽濾後將固體置於30-40°C烘箱乾燥3h後研磨成粉備用；將乾燥得到的產物再進行一次相同方法的選擇性氧化反應，即得氧化雙醛纖維素，再將氧化雙醛纖維素置於30-40°C烘箱中乾燥3h後放入4°C冰箱中保存； ニ、固定化脲酶的製備 (1)分散相的製備取步驟ー(2)得到的氧化雙醛纖維素載體，加入PH4-10的磷酸鹽緩衝液製備分散相；控制氧化雙醛纖維素在此分散相中的質量比為3% -5% ； (2)脲酶的固定向分散相中加入脲酶溶液，其中脲酶溶液濃度為O.l-20mg/mL，控制反應溫度2-8 °C，磁力攪拌2-4h ； (3)洗滌乾燥用紗布過濾得到固體，將此固體用去離子水洗滌4-5次，除去未固定的游離脲酶，真空冷凍乾燥得到固定化的脲酶。
全文摘要
一種氧化雙醛纖維素固定化脲酶的製備方法，經過如下兩個步驟製成一是氧化雙醛纖維素的製備，其中包括纖維素的活化、水熱合成製備氧化雙醛纖維素兩個子步驟。二是固定化脲酶的製備，其中包括分散相的製備、脲酶的固定化和洗滌乾燥三個子步驟。本方法利用自然界廣泛存在的纖維素為基質材料，通過水熱合成製備得到氧化雙醛纖維素載體，利用希夫鹼(Schiff base)反應將脲酶固定在此載體上，得到氧化纖維素固定化的脲酶。本發明製備的氧化雙醛纖維素醛基含量較高，為脲酶結合提供更多活性位點，固定化脲酶的方法簡單易於操作，且載體材料來源廣泛，具有廣泛的應用前景和實用價值。
文檔編號C12N11/12GK102732500SQ20121023767
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者李銘慧, 潘興祥, 燕冰宇, 郭明 申請人:浙江農林大學